课题计划项目以与可行性研究报告

河南省重书 脂

装

膜基底型免疫及抗体固定研究 项目内容摘要：

研

了提升免疫抗体的固定效率， 建立米膜基底型的新 方免疫芯片验参考支持。 研究内容：择多糖中水溶利用分，以载体， 脂糖、 高对玻片琼脂体。利用 SEM 、AFM 和 F T 行表得最条件；微成像及 I m a g 件，载 2种不同种属来源抗体的固定效琼脂体和抗 体的固定比分析。 脂糖 ; 免疫芯片 ; 抗体固定 项目概况 1、主要研内容 多糖中水溶，利用分，以载体， 脂糖、高对玻片，琼脂体。 利用 SEM 、 A F M 和 F T 行表得最条件；微成像及 ImageJ 软件，2 种不同种属来源抗体的固定效琼脂体 和抗体的固定比分析。 材脂糖、 3-氨基丙基三甲氧( APTES) ( Sigma 公司，美国 ) ， 高、、 36%冰乙酸、无水乙醇( 限公司); F I 抗兔抗体 (上海生工) ，F I 记的兔抗人 AFP 抗体 ( 上 海生工 ) 。 器械水子天平、拌器、烘干箱， JSM-6360LV 型高低真 F T S 3000F X 型的傅 OLYMPUS BX5型1 倒置荧 ， N a n o s c o p e I I I a 型原。 基处理： 25 m m ×7 m m 玻片用氨水洗液(氨氧

∶ 水 = 1∶ 1∶ 5)床2 h ，取出后水清，放入 1mol /L H C l 中夜，再水超声 10 min ，无水乙醇超声清洗 2 次，每次 5 min ， 热恒温箱 (120℃ ) 烘烤 2 h 。 脂进行。 基片表面抗的固体的固定效率。 2、主（限 1000 字） 主： 琼脂配制 0. 6%、0. 8%、1. 0%、1. 2%、1. 4% 脂糖溶液，微波炉煮沸 3 m i n 完全溶解 ; 6热玻片上脂糖室温凝固后，置 37℃烤箱烘干 2 h; 置室温保 用 ; ③将上脂糖玻片置于 50 mmol /L NaIO4 溶液中室温下活 化 60 m i n 。接着用 0. 1 m

普通醛基载体制备：按照文献中的方法制备普通醛基载体。清洗好的玻片浸入APTES活化试剂( 丙酮稀释) 中20 min 后取出，玻片用丙酮、去离子水冲洗，120℃下烘干，然后放入含5%戊二醛溶液中室温下浸泡 2 h ，取出用去离子水冲洗5 min × 3 次，烘干后，至干燥处保存。

基片表面抗体探针的固定：探针为FITC 标记的驴抗兔IgG 和兔抗人AFP 抗体，将探针固定至修饰后的载体表面，研究载体对不同蛋白探针的固定效率。取原始浓度为1mg/ml 的探针溶于含20%甘油的PBS溶液中稀释，使探针终浓度分别为0. 1 、0. 2 、0. 3 、0. 4 、0. 5 、0. 6 mg /ml ，将探针分子分别链接到修饰后基片上，避光，置于湿盒中，37℃固定 3 h ，然后PBS清洗 3 次，洗掉未结

合的荧光探针，晾干后荧光显微镜检测，获取荧光图像。

经济指标：载体对抗体的固定效率

多糖纳米膜基底型芯片载体成品的销售

3、技术创新点

1. 本研究经过前期资料查询，数据库内相关资料充足，课题研究设计经过推敲方案在课题组通过，已经组织选拔了课题组相关工作人员。

2. 课题组成员，高级、中级职称配备合理，有学科带头人，部分工作者有相关经验。

3. 琼脂糖、3-氨基丙基三甲氧基硅烷( APTES)( Sigma公司，美国) ，高碘酸钠、戊二醛、36%冰乙酸、无水乙醇等均为分析纯( 国药集团化学试剂有限公司) ; FITC 标记的驴抗兔抗体( 上海生工) ，FITC 标记的兔抗人AFP抗体( 上海生工) 。

3. 特色和创新：在免疫芯片的制备和应用过程中，大胆采用琼脂糖建立一种新

的免疫芯片载体制备方法，既可以改善实验方法，又可以提高临床提高诊断效率。

4、获得成果和知识产权（此处需要作者自己填写）

以下为项目可行性研究报告

（一）目的意义（限1000 字）

免疫芯片，又称为抗体微阵列，是实际应用中最重要、研究最多的一种蛋白质芯片。免疫芯片技术结合了抗原抗体反应的特异性和芯片高密度集成优势，只需少量生物样品，一次检测便可获得几种甚至几万种有关的生物信息或疾病的检

测结果。与传统的免疫分析方法相比，免疫芯片最大的优点是能够实现并行、快速、高通量的检测; 同时极大节省时间、试剂，被广泛应用于蛋白质组学研究，

其在疾病诊断、药物筛选、食品安全和环境监测等领域已显示出广阔的应用前景。

免疫芯片制备中，载体的表面修饰及抗体固定是影响芯片检测灵敏度的关键因

素。目前，免疫芯片载体表面修饰可大致分为两类: 二维表面修饰和三维表面修饰。二维表面修饰包括聚赖氨酸修饰、氨基修饰、醛基修饰、巯基修饰、链霉亲

合素修饰等，它们是通过共价键或特殊分子间的高亲合力把蛋白质固定在载体表面，所以对蛋白质的固定比较牢固，蛋白质的构象变化较少，有利于保持蛋白质的天然活性。但是二维表面修饰技术制备的载体在发展过程中仍存在不少问题，如: 引起抗体蛋白质性质不稳定的问题，动力学检测范围窄等问题。三维表面修饰是在玻片表面包被一层凝胶或树突状多聚物，这些凝胶或多聚物又可以通过化学反应引入活性基团，以共价结合和物理吸附的方式把蛋白固定在载体表面。琼脂糖一种拥有多种生物活性的高聚物，生物相容性良好，有研究推断琼脂糖自组装膜基底可能会提升免疫芯片对抗体的固定效率，建立多糖纳米膜基底型芯片载

[1] 。

体制备的新方法，为后续免疫芯片的制备提供实验参考和理论支持

（二）国内外同类产品和技术情况（限500 字）

[2]

已有大量研究证明，三维结构的载体对蛋白质的固定量比二维平面载体大

得多，而且凝胶的固- 液环境使固定在上面的蛋白质不易失去活性。所以三维修

饰表面是近年来较受关注的修饰方法。研究表明

[3] ，多糖膜具有三维多孔结构，经水化后可在内部形成固- 液状态的水凝胶结构，这种三维、多孔结构以及湿润

的微环境不但能固定足够的蛋白质，同时还可以防止蛋白质变性失活。

琼脂糖是一种拥有多种生物活性的高聚物，有着很好的生物相容性，其在载玻片表面形成的自组装结构具有类似于聚丙烯酰胺的水凝胶特征，这三维自组装结构又可以通过化学反应引入醛基基团，即可与抗体分子的氨基发生共价偶联。

具有这种三维结构的载体对蛋白质的固定量比二维平面载体大得多，而且凝胶的固- 液湿润环境使固定在上面的蛋白质不易失去活性，因此更有利于固定抗体探

针分子。有研究表明[4] : 壳聚糖氧化自组装膜修饰玻片与抗体结合效率高，荧光

信号强，点的密度及数量等都要优于普通醛基化玻片。琼脂糖是一种多糖，加热后易溶于水，不同浓度的琼脂糖在玻片上形成的膜的厚度和孔径大小也有差异，

膜的厚度和孔径的大小会直接影响蛋白质的固定。

参考文献

[1]Sjberg Ｒ，Mattsson C，Andersson E，et al ．Exploration of high-den-

sity protein microarrays for antibody validation and autoimmunity profiling ［J］．New Biotechnol ，2016，33(5): 582-592.

[2]Thk S M，Bonabi A，Nordberg ME，et al ．Thiol-ene microfluidic

devices for microchip electrophoresis: Effects of curing conditions and monomer composition on surface properties ［J］．J Chromatog-raphy A，2015，1426:

目申报

书

河南省重点研发

项

划

计

233-240.

[3]Klimushina MV ，Gumanova N，G Metelskaya VA. Direct labeling of

serum proteins by fluorescent dye for antibody microarray ［J］．Bio- chem Biophy Ｒes Commu，n2017，486(3): 824-826.

[4]Chang SY ，Bong JH，Yoo G，et al ．Activity control of autodisplayed proteins on the same outer membrane layer of E. coli by using Z-domain streptavidin and lipase foldase systems［J］．EnzymeMi-crobial Technology ，2017，96:85-95.

势（限500 字）

展趋

和发

（三）市场

预测

体表面修饰

择以及载

是制

程中，载体的选

未来，在免疫芯片的制备和应

用过

节

，最后建立了一种新的免疫芯片载体制

合力高的芯片将是重要环

量好、结

备质

验参考和理论

和应用不断提供实

支持。

后续

免疫芯片的制备

备方法，为

内容、方法、技术路线

二、研究开发

（限1000 字）

问题

关键

（一）具体研究开发内容和要重点解决的技术

，利用分子自组装技术

，以玻片为

基质

载

脂糖为

本文选

择多糖中水溶性的琼

装膜载

体。利用

，制备

琼脂糖自组

体，让

琼脂糖、高碘酸钠

对玻片表面进

行修饰

SEM、AFM和FTIR对载体进行表征，获得最佳制备条件；利用荧光显微成像及

ImageJ软件，研究该载体对2种不同种属来源抗体的固定效率，对琼脂糖自组

抗体的固定效果进

行对

比分析。

对

装膜载

体和普通醛

基修饰

载

体

材料：琼脂糖、3-氨基丙基三甲氧基硅烷( APTES) ( Sigma 公司，美国) ，

限公司); FITC标

的

驴

抗兔抗

有

记、戊二醛

化学试剂

、36%冰乙酸、无水乙醇等均为

分析纯(国药集团

高碘酸钠

记的兔抗人AFP抗体( 上

体( 上海生工) ，FITC标

海生工) 。

器械：超纯

子天平、磁力搅

拌器、烘干箱，JSM-6360LV 型高低真

水机、电

，FTS3000FX型的傅立叶变

，OLYMPUS BX5型1 倒置荧

外光谱仪

换红

镜

空扫

描电

微镜

，Nanoscope IIIa 型原子力显

。

微镜

光显

氨水∶过

氧

比为

处理：25 mm×75 mm光学载玻片用氨水洗液( 体积

基片的预

，放入1mol

2h，取出后用超纯水清洗干净

化氢

床上振摇

∶水= 1∶1∶5) 置摇

/L HCl 中浸泡过夜，再用超纯水超声10 min，无水乙醇超声清洗 2 次，每次5 min，

热恒温箱(120℃) 烘烤 2 h 。

置电

①分别配制0. 6%、0. 8%、1. 0%、1. 2%、1. 4%

体制备

琼脂糖自组

装膜载

脂糖溶液覆盖在

的琼

脂糖溶液，微波炉煮沸 3 min 完全溶解; ②将 2 ml琼

河南省重点研发计划项目申报书

60℃预热的清洁玻片上; 琼脂糖室温凝固后，置37℃烤箱烘干 2 h; 置室温保

存备用; ③将上述制备好的琼脂糖玻片置于50 mmol /L NaIO4 溶液中室温下活化60 min 。接着用0. 1 mol /L pH7. 4 PBS 洗涤5 min × 3 次，氮气流吹干。

普通醛基载体制备：按照文献中的方法制备普通醛基载体。清洗好的玻片浸入APTES活化试剂( 丙酮稀释) 中20 min 后取出，玻片用丙酮、去离子水冲洗，120℃下烘干，然后放入含5%戊二醛溶液中室温下浸泡 2 h ，取出用去离子水冲洗5 min × 3 次，烘干后，至干燥处保存。

基片表面抗体探针的固定：探针为FITC 标记的驴抗兔IgG 和兔抗人AFP抗体，将探针固定至修饰后的载体表面，研究载体对不同蛋白探针的固定效率。取原始浓度为1mg/ml 的探针溶于含20%甘油的PBS溶液中稀释，使探针终浓度分别为0. 1 、0. 2 、0. 3 、0. 4 、0. 5 、0. 6 mg /ml ，将探针分子分别链接到修

饰后基片上，避光，置于湿盒中，37℃固定 3 h ，然后PBS清洗 3 次，洗掉未结合的荧光探针，晾干后荧光显微镜检测，获取荧光图像。

不同基片对抗体分子固定效率的比较：利用最佳条件分别制备普通醛基化载体，琼脂糖自组装膜载体，分别固定最佳浓度的抗体探针分子，根据平均荧光强度比较两种载体对抗体的固定效果。载体表面的形貌用JSM-6360LV型高低真空扫描电镜( SEM) 与原子力显微镜( AFM) 观察; 在IRPrestige-21 型傅里叶变换红外光谱仪上测定红外光谱( FTI Ｒ) ，用来分析载体表面存在的化学键; 用OLYMPUS BX5型1倒置荧光显微镜观察载体表面荧光探针的固定效率。

重点解决的技术关键：琼脂糖自组装膜载体的制备。

（二）项目的特色和创新之处（限1000 字）

在免疫芯片的制备和应用过程中，载体的选择以及载体表面修饰是制备质量好、结合力高的芯片将是重要环节，采用琼脂糖建立一种新的免疫芯片载体制备

方法。

（三）要达到的技术、经济指标及社会、经济效益（限1000 字）

1. 测定载体对抗体的固定效率

2. 多糖纳米膜基底型芯片载体成品销售获得的经济效益

（四）采用的方法、技术路线以及工艺流程、合作方式