中性红染色液(0.1%, 常规染色)操作步骤及注意事项
中性红染色液(0.1%,常规染色)操作步骤及注意事项
货号：G1316
规格：100ml/500ml
产品说明：
中性红是一种弱碱性pH指示剂，变色范围在pH6.4～8.0之间(由红变黄)。分子式为C15H16N4·HCl，分子量为288.78。在中性或微碱性环境中，植物的活细胞能大量吸收中性红并向液泡中排泌。中性红染色液(0.1%,常规染色)是一种组织或细胞染色时常用的可以把细胞核染成红色的染色液，常用于组织或细胞染色中细胞核的红色复染。
操作步骤(仅供参考)：
1、样品处理
a)对于石蜡切片：
二甲苯中脱蜡5～10min。
换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5～10min。
无水乙醇5min。
90%乙醇2min。
70%乙醇2min。
蒸馏水2min。
b)对于冰冻切片：
蒸馏水2min。
c)对于培养细胞：
用4%多聚甲醛固定10min以上。
蒸馏水洗涤2min。
换用新鲜的蒸馏水，再洗涤2min。
2、中性红染色
a)对于上述处理好的样品，用中性红染色液(0.1%,常规染色)染色。
b)用蒸馏水或自来水充分洗涤。
c)进行观察和拍照。
注意事项：
1、如果需要脱水、透明和封片处理，还需自备二甲苯，中性树胶或其它封片剂。如果
样品是石蜡切片，需自备70%和90%乙醇，无水乙醇以及二甲苯。
2、首次使用本试剂时建议先取1~2个样品做预实验。
3、中性红染色液时，可以根据染色结果和要求调整时间。
4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
革兰氏染色的实验原理
革兰氏染色的实验原理 ●G＋细胞壁的网状结构致密，交联度高，用乙醇处理后，发生脱水作用，肽聚糖层孔径缩小，透性降低，故细菌仍保留初染时的紫色。 ●G－肽聚糖层较薄，交联度低，含较多类脂质，故用乙醇处理后，类脂质被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，细胞被脱色，经沙黄复染呈红色。 涂片固定→结晶紫初染（碱性）→碘液媒染→乙醇（丙酮）脱色→番红复染（碱性）
◆◆◆原理： 当用结晶紫初染后，所有细菌都被染成初染剂的兰紫色，碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫-碘复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要有舦聚糖形成的网状结构组成，壁厚，类脂含量低，用酒精脱色时细胞壁脱水，使舦聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫碘复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的兰紫色。革兰氏阴性细菌则不同，由于其细胞壁舦聚糖层较薄，类脂含量较高，，所以当脱色处理时，类脂质被酒精溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。 ◆◆实验步骤： 1、制片 涂片——干燥——固定 2、初染 滴加结晶紫染色1——2分钟，水洗； 3、媒染 用碘液冲去残水，并用碘液覆盖1分钟； 4、脱色 滴加95%酒精脱色，25-30秒，立即水洗； 5、复染 用番红液复染约2分钟，水洗； 6、镜检 干燥后，用油镜观察。 细菌：细菌是一种具有细胞壁的单细胞微生物，在适宜条件下，能进行无性二分裂繁殖，其形态和结构相对稳定。一般体积微小，通常需要借助光学显微镜才能看到，其测量单位用微米表示。
石蜡切片免疫组化染色步骤
石蜡切片免疫组化染色步骤 1、载玻片的处理： 抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 Histogrip TM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下： 1.1 APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。 1.2 Histogrip TM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留1~2分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60o C烤箱烘烤一小时，装盒备用。 1.3 Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60o C烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。 2、常用酶消化： 2.1 胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。 2.2 胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。 2.3 皂素（Saponin）：一般使用浓度为2~的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。 3、抗原热修复： 可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。请选用我公司提供的ZLI-9064 枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于1000ml 的蒸馏水中，混匀，其pH值在6.0 0.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。 3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3％H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却10~20分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。 3.2 石蜡切片高压抗原修复操作方法：切片脱蜡至水。将1500ml~3000ml的枸橼酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热5~6分钟后），计时1~2分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3，下接免疫组化染色步骤。 3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。 4、免疫组化染色步骤： （以美国ZYMED公司SP试剂盒为例） 4.1石蜡切片脱蜡至水。 4.2 3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。 4.3蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。
革兰氏染色的机理和步骤.
1. 革兰氏染色的机理和步骤 机理：G+、G-主要由其CW化学成分的差异而引起对乙醇的通透性，抗脱色能力的差异。主要有肽聚糖的厚度和结构所决定。 G+的CW:肽聚糖层厚，脂质含量低。乙醇脱色时CW脱水，孔径减少，透性降低，不易脱色，呈初染得蓝紫色。 G-的CW：肽聚糖层薄，脂质含量高。乙醇脱色时，类脂被乙醇溶解，透性升高，细胞被复染显红色。 步骤：①涂片：在干净的载玻片上滴一滴水，用接种环挑取菌体均匀涂布于水中。 ②固定：将玻片靠近酒精灯火焰，蒸干水分，但不要烤焦。 ③初染：用碱性颜料结晶紫对菌液涂片进行初染。 ④媒染: 以碘液媒染1min，水洗，吸干水分。(细胞内形成结晶紫与碘的复合物，增强相互作用） ⑤脱色(关键步骤）：以95%的乙醇脱色30s，应适当振荡均匀，是乙醇脱色完全。 ⑥水洗，吸干。 ⑦复染：??(第2张）复染30s，水洗吸干。 ⑧干燥镜检。 2、用渗透皮层膨胀学说解说芽孢耐热机制。 芽孢的耐热性在于芽孢衣对多价阳离子和水分的透性很差，以及皮层的离子强度很高，这就使皮层产生了极高的渗透压去夺取芽孢核心中水分，其结果造成皮层的充分膨胀和核心的高度失水，正是这种
失水的核心才赋予芽孢极强的耐热性。 3、引起微生物培养过程中PH变化的几种可能反应，并说明如何能够维持微培PH稳定。 答：培养过程中，由于营养物质被分解利用，代谢产物的形成与积累，会导致PH变化。 （第2张中的图） 还与培养基的C/N比有关，C/N高，经培养基后PH显著下降，C/N 低，经培养基后PH明显上升。 PH调节：①加入缓冲剂--------常用:一氢二氢磷酸盐，K2HPO4 呈碱性，KH2PO4 酸性，只在一定的PH范围内调节（6.4--7.2） ②大量产酸的菌株，加CaCO3调节，CaCO3难溶于水，不会使培养液的PH过度增加，但可不断中和微生物产的酸。 ③培养液中存在天然的缓冲系统，如AA，肽，Pr均属两性电解质，也起缓冲的作用。 ④过酸：治标------加NaOH、Na2CO3中和，治本-----加适量氮源：NaNO3、Pr、NH3·H2O；增加通风量。 ⑤过碱：治标-----H2SO4、HCl中和，治本----加适量碳源:G类，脂类;减小通风量。 3、抗生素法和菌丝过滤法为何能浓缩营养缺陷型突变株？ 抗生素法（青霉素法）：适用于细菌。原理：青霉素抑制肽聚糖链间的交联，组织了合成完整的CW，野生型B处于正常生长繁殖，所以对青霉素敏感，可被抑制或杀死；营缺B在基本培养基上休眠状态
免疫组化染色过程中存在的问题
良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提。由于免疫组化染色过程中存在很多步骤或环节，每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果，因此，要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件非常容易的事。需要病理技术员和病理医生密切配合、相互协调、共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片。虽然免疫组化染色可以存在各种各样的问题，但从染色的结果看，一般可分为两类：无色片（即无阳性信号）和“杂音”染色片（有阳性信号）。 一、无色片 染色结束后，切片中见不到任何阳性信号。这是常规工作中比较常见的现象，出现这种现象，有两种可能：1、真阴性结果：整个染色过程没有出现问题，组织或细胞确实不表达与抗体相关的抗原。2、假阴性结果：即此阴性结果不是真实的反映。假阴性结果又可分为两种情况：（1）、切片中根本就不包含所预期检查的组织或细胞。出现这种情况，要麽是病理医生选择错了切片或抗体选错了，要麽是技术员选错了蜡块。获得正确的切片进行染色是获得正确结果的前提。由此表明：制作出合格的免疫组化切片不仅仅是技术员的事，病理医生也起着不可缺少的作用。（2）、染色过程中的某一或某些环节出了问题。比如，组织未进行抗原修复，有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达；或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体；或一抗失效，虽然抗体失效在理论上是一个逐渐的过程，但偶尔也遇到突然失效的情况，抗体长期不用和/或已超过有效期是主要的原因。也可见于染色过程中漏掉了某一环节，如忘记加二抗或三抗，或用了两次二抗而缺少了三抗，或配制DAB时少了过氧化氢。为了避免这种简单的错误，有一种简单的方法：在三抗孵育结束时，将切片上的三抗甩在一张白纸上，在将配制好的DAB滴一滴在白纸的三抗上，观察是否出现棕色。如果出现了，证明三抗和DAB的配制过程没有错误。如果这种DAB再滴到切片上没有出现任何阳性信号，问题一定是出在三抗以前。如果纸上不出现棕色反应，问题肯定在三抗DAB或DAB的配制过程。这种简单方法能迅速的帮助我们查找出现问题可能的原因。 解决阴性染色的问题非常简单，就是设立“阳性对照”。如果阳性对照有了表达，说明染色的全过程和所有试剂都没有问题。如果此时测试片仍为阴性，便是真实的阴性，说明组织或细胞没有相应的抗原表达。反之，如果阳性对照没有着色，表明染色过程中某个或某些步骤出了问题或试剂出了问题。应一一寻找原因。阳性对照包括两种，一种称为“自身对照”或“内部对照”，这是指在测试的切片中本身就存在已知的抗原，如正常淋巴结中存在T和B细胞抗原，CD20或CD3都应该有表达。自身对照是一种比较理想的对照，对照和测试组织或细胞都在同一张切片中，都处于相同的试验条件下，结果更可靠也更具有可比性。在选择自身对照片时最好选择既有病变组织同时又有正常组织的部分，这样有利于对比。另一种称为“外部对照”，有时在测试的切片中不存在已知的抗原，如在胃的标本中怀疑是恶性黑色素瘤，需要用HMB45或Mart-1来检测，在正常的胃组织中本身不存在相关的抗原，如果病变出现阳性反应结果，尚能提示是恶黑，但是如果出现阴性结果，就无法确定是本身组织中不含黑色素瘤抗原，还是技术问题。因此，应另外设立一个已知的阳性对照。这种在测试组织之外的阳性对照称为“外部对照”。在实际工作中需要设立外部对照的情况很多，如果每一种抗体都要选不同的阳性对照，工作量会很大。为了解决这个问题，目前国内外有单位将多种不同组织集成在一起，制成多组织切片、“腊肠”“春卷”切片、组织芯片等，其连续切片储备待用，需要时取出一张便可作为阳性对照。另外，比较简单的方法，是采用阑尾作为阳性对照，因为与人体其它组织器官比较阑尾包含的组织种类较多，如有上皮、淋巴组织、平滑肌、间质、神经、血管、间皮等。一张阑尾切片可以检测大多数常用的抗体。 设立阳性对照是病理医生的任务或责任，而不是技术员的责任。病理医生观察了HE切片，了解切片中是否有自身对照，如果没有，就应告诉技术员采用阳性对照。因此，病理医生在免疫组化中的作用是不可忽视的。 抗体未覆盖上测试组织：当多块散开的小组织染色时，可能漏掉某块组织染色。 二、“杂音”染色片 免疫组化除正常的真实的阳性信号外常常会遇到不正常的背景着色，这些非正常的着色称为“杂音”染色。“杂音”染色种类繁多，产生的原因也多种多样，为了便于说明，笔者将其归纳为下面几种 1、全片着色
做好免疫组化染色必须注意的问题
做好免疫组化染色必须注意的问题 一、为达到免疫组织化学技术的要求，组织固定越新鲜越好。 在免疫组化最后结果的判断时，常可见到均匀一片的似非特异性染色的现象，经多方研究认为，它是一种假性非特异性的染色。因为肿瘤组织中含有的抗原较易发生扩散弥散，肿瘤细胞无限制的生长和生长过速，导致肿瘤中间部分组织血液供给困难，造成缺血坏死，坏死细胞中的抗原由于机体的作用，可以被均匀地散布于细胞与细胞间的间质，这是抗原发生弥散的一种方式。另一种抗原弥散的方式就是，由于组织没有及时的固定所引起的。离体的组织不及时固定，组织就会自溶，抗原就会扩散，这是一非常普通的常识，但要做好却是极不容易。标本从外科切除到浸入固定液需要经过一段时间，在这段时间里，有的抗原就可以发生扩散。虽然已浸入了固定液，但标本较大，固定液的量又不足，当然由于固定液的渗透需要时间，当渗入到组织之中时，中间的细胞已发生了变化，抗原也随着发生扩散，这种现象在产酶多的器官是比较明显的，如胃癌，当切除后标本较大，虽然在手术室期间已放入了固定液，但固定液要透过肌层达到胃粘膜面起码需要几个小时的时间，当固定液发挥作用时，组织已经发生变化。因此，这了达到免疫组织化学染色的要求，对于离体的组织尽量快的进行固定，有条件的应将其剖开，早取材，早固定。 二、组织脱水必须彻底干净 组织块取材不能太大过厚，才能较好地完成脱水的过程。如果取材太厚，在较短的时间内脱水不完全，将可引起一系列的问题，比如浸蜡不彻底，切片不好完成，切不完整。由于先天不足，导致后来切片染色的脱落，造成染色的失败，或者由此反复操作，造成年人力物力的浪费，造成病理报告的延期发出等。因此，对取材的要求是除了要求要有艺术性外，即平整、外观好看，还要求适中。 三、切片必须完整、均匀、平展、无邹折 应用于免疫组织化学染色的切片，对切片的质量要求较高，切片必须完整，平展、无汽泡，无邹折，这样有利在染色时的冲洗，有利于切片的牢固附贴。如果切片不平展，免疫组化染色后，可出现染色不均匀的现象，颜色深浅不一，不平。如果切片有汽泡切片在烘烤时，由于汽泡的破裂影响了汽泡周围的组织，在其周围可观察到深浅不一的染色。如果切片有邹折，免疫组化染色后，在邹折的地方有深浅不一的颜色，这是一种假阳性，容易引走混淆。 四、切片的附贴必须牢固，必须使用合适的粘贴剂。 免疫组织化学染色前的前期准备工作，就是必须对新的载玻片进行处理，新的载玻片表面看起来很干净，有人认为不需要进行任何的处理，都能够适合使用，这是一种错误的想法。新出厂的载玻片，表面复盖着开一层油脂样的物质，如果不加以处理，对切片的附贴是极为不利的。我们的做法是：新的载玻片，放于玻璃清洗液中浸泡4小时甚至过夜，然后取出，经自来水彻底冲洗后，浸入酒精中达2小时以上，取出擦干备用或烘干也可。然后再将载玻片浸入了－氨基－三乙氧基－硅烷（3－Aminopropyl triethoxy-silane）的稀释液（1：50用丙酮或无水乙醇稀释都可以）中硅化10分钟，后经无水乙醇洗2次，烘干即可使用。 五、切片必须烘烤附贴牢固，既要经得起抗原修复时高温的作用而不使轻易脱片，又不至于破坏抗原。 应用于免疫组化染色的切片。由于整个过程需经几个阶段的处理，如抗原修复时抗原修复液的沸腾且需持续十几分钟，PBS的反复冲洗，有的甚至于4℃冰箱中孵育达十几小时。因此，
免疫组化染色操作步骤
免疫组化染色操作步骤 Document serial number【UU89WT-UU98YT-UU8CB-UUUT-UUT108】
免疫组织化学染色原理和操作步骤一、免疫组织化学原理 免疫组织化学（IHC）又称免疫细胞化学，是根据抗原—抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。免疫组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗，形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素—生物素—过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素—过氧化物酶（SP）法。 PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响，但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物（含3个酶分子和 2个抗体分子），染色时依次加入一抗、二抗、PAP复合物孵育标本，最后用H 2O 2 和二氨基联苯（DAB）为底物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。 生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合4分子生物素，ABC法即在此基础上建立。ABC法与PAP法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显色。ABC法的敏感性较PAP法更高。 图1. 免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》）
抗酸染色——标准操作
抗酸染色 一、原理 本试剂盒采用WHO推荐的Ziehl-Neelsen法分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来促使其着色。但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色。齐-尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物，用盐酸酒精处理也不脱色。当再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为蓝色。 二、试剂 石碳酸复红染液、酸性酒精溶液、亚甲蓝溶液 三、方法 1.涂片：参见各标本操作程序涂片，涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，但勿靠近火焰
2.固定：常用高温进行固定。即手持载玻片一端，标本面朝上，在灯的火焰外侧快速来回移动3~4次，共约3~4秒。要求玻片温度不超过60℃，以玻片背面触及手背皮肤不觉过烫为宜，放置待冷后染色 3.染色 3.1 滴加石碳酸复红染液盖满玻片，染色10分钟或更久，无需加温 3.2 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水 3.3 滴加酸性酒精溶液盖满玻片，脱色1-2分钟，如有必要，需流水冲去溶液后，再次脱色至痰膜无可视红色为止 3.4 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水 3.5 滴加亚甲蓝溶液，染色30秒钟 3.6 流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水，待玻片干燥后镜检 3.7 一张染色合格的玻片，痰膜肉眼观察为亮蓝色，无红色斑块 四、结果判定 1.干燥后油镜观察300个视野（观察时间不少于4min），抗酸性细菌呈红色，其它细菌或细胞呈蓝色
免疫组化染色机种类介绍
自动化免疫组化染色机种类介绍 免疫组化的传统技术正在受到新的快速高敏的新技术的挑战，一方面是新试剂的推出，如SP、EPOS、Envision和CSA，另一方面是自动免疫组化染色机的问世。免疫组化技术正进入一个新的发展阶段。从先进国家免疫组化规范化或标准化的进程来看，自动免疫组化染色机的应用几乎贯穿始终，早在20世纪末已得到极大的普及，然而国内的自动免疫组化染色机应用则在近几年才得以发展。浙江省肿瘤医院作为省内较早应用的少数单位之一，在自动化免疫组化染色的使用和质量控制方面获得些许经验，在此做简单的介绍交流。 自动化免疫组化染色技术是由电脑控制整个染色程序的免疫组化染色机，具有自动加抗体、自动冲洗、显色、复染及预处理等功能，有全自动和半自动、封闭型和半开放型之分。根据不同仪器大小，每次染色20～240张切片不等，整个染色程序约需60～90min左右，它不仅可以应用于免疫组化染色，某些仪器还可应用于组织化学染色、特殊染色及原位分子杂交染色。目前较为理想的仪器为Roche公司、Lecia公司及Thermo公司的产品等。下面对不同机型的自动免疫组化染色机的特点分述如下。 Thermo公司的LabVision Autostainer 该机型属开放式半自动系统类型，用户可任意编辑所需试剂及模板，内建试剂兼容性检测。切片特殊染色模板可任意调整试剂量、孵育时间。体系开放保证可适就性强，即可同时运行不同检测试剂盒和不同的染色程序及不同厂商生的的一抗。使用单一探头，探头材料为特氟伦包被不锈钢，检测探头交叉污染残留物 <10-6 ，且分样精度>99%(总体积)。联合使用配套的抗原修复仪，可实现脱蜡与抗原修复一步完成。DAKO公司的 Autostainer系LabVision Autostainer贴牌产品，配合使用DAKO的Flex检测系统可获得极为敏感的免疫组化结果。早期的Biogenex i6000TM全自动染色仪亦属该类型产品，不同的是其加样头采用标准的Tip头加样，完全避免交叉污染的风险。 Lecia公司的Bond-Max
切片、免疫组化步骤
冰冻切片的免疫组化染色步骤 速冻组织 将组织块平放于软塑料盖或特制小盒内（直径2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮内，大约 10-20秒组织即迅速冰冻成块。取出组织冰块立即置入-80℃冰箱储存备用，或置于恒冷切片机冰冻切片。 冰冻切片4~8mm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存冰箱内保存。 室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟。也可根据需要选择其它的固定方式。 PBS洗，5分钟×3。 用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。 PBS洗，5分钟×3。 下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤（滴加一抗开始）。 石蜡切片免疫组化染色步骤 三步法（以SP试剂盒为例） 1. 石蜡切片脱蜡至水。 2. 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。 3. 3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS 冲洗，2分钟×3次。 4. 5~10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。 5. PBS冲洗，2分钟×3次。 6. 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。 7. PBS冲洗，2分钟×3次。 8. 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。 9. PBS冲洗，2分钟×3次。 10. 显色剂显色（DAB或AEC）。
(推荐)革兰氏染色法的过程及原理
革兰氏染色法的过程及原理 一，过程 1 ．涂片 将培养的不同菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰l 一2 次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。 2 ．染色 ( 1 ）初染加草酸铰结晶紫一滴，约一分钟，水洗。 ( 2 ）媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。 ( 3 ）脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95 ％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20 一30 秒钟，立即用水冲净酒精。 ( 4 ）复染用番红液染1 一2 分钟，水洗。 ( 5 ）镜检干燥后，置油镜观察．革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。( 6 ) 同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。 二，原理 革兰氏染色法（Gram stain ）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G＋表示：染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G 一表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肤聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫一碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肤聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫一碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌：而脱色，不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。 青霉素作用机制 干扰细菌细胞壁的合成。青霉素你的结果与细胞壁的成分粘肽结构中德D-丙氨酰-D-丙氨酸近似，可与后者竞争转肽酶，阻碍你粘肽的形成，造成细胞壁的缺损，使细菌失去细胞壁的渗透屏障，对细菌起到杀灭作用。 溶菌酶与青霉素对细菌细胞壁的作用 溶菌酶作用机制：是一种能水解致病菌种黏
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法 1、组织得采集、固定与保存: 采取组织后, 方法一:4％多聚甲醛(4％ＰＦＡ)4?Ｃ固定1小时(根据组织大小与致密程度调整固定时间)或过夜 方法二:采用boｕｉn’s固定ＲT 2h(6—8dｔeｓis)or RＴ过夜(成年tesiｓ) PBS缓冲液洗三次,每次5ｍin,4?C保存于7０%乙醇中。 ２、组织得包埋、切片、展片及保存:: 固定后得样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明,５2－54?C石蜡包埋,常规切片,切片厚4—１０μm,贴于处理过得干净载玻片上,37?C烤片过夜,之后收集于载片盒中,RT密封保存。 石蜡包埋: 保存于４?Ｃ70％乙醇中得组织样品 ↓ 80％乙醇1５ｍin ↓ 95%乙醇15 miｎ ↓ 1０0%乙醇15mｉｎ? 2 ↓ 1/2乙醇１／２二甲苯15 ｍin ↓ 二甲苯透明5-１0 min ↓ 1／２二甲苯１/2石蜡３0 min
↓ 石蜡(1) 1。5hｒ ↓ 石蜡(2) 1.5－２.5hr ↓ 石蜡(3) 包埋 ↓ RT保存 3、石蜡组织切片得免疫组化方法: 密封保存于RT得组织切片 ↓ 二甲苯(1) 20 min ↓ 二甲苯(2)20ｍin ↓ 100％乙醇20ｍin ↓ 95％乙醇10 min ↓ 8０％乙醇10miｎ ↓ 通风橱晾干,阻水笔在组织周围画圈 ↓ 切片在ＰBS中浸泡 5 ｍin＊2 ↓ 0.4%Tritonx RＴ10 mｉn ↓ 切片在PＢS中浸泡 5 min＊3 ３％H２O2 RT １０ｍin
切片在PBS中浸泡５ｍｉn*3 0、25％胰酶RT １0min 切片在PBS中浸泡 5 min*３ Blocking bｕｆfｅr(3%BSA+5%NGS＋０、2%Ｔritｏnx—１０0 in PBS) ＲT 60mｉn 倾去blｏｃking buffｅｒ,勿洗 一抗4 C overnighｔｉn blｏckinｇbuffeｒ 取出切片复温1h,切片在PBＳ中浸泡 5 mｉn*３ 二抗iｎblocking ｂufｆer GＡR1:２00 (GＡM1:100),R Ｔ 1h 切片在PBS中浸泡５min*3 DAB显色５—１0min(５0微升A＋５0微升B＋９0０微升ＰBS+5微升3％H2Ｏ2) 如果就是增强型DＡB只要1ｍｉn即可。 切片浸入PBS终止显色,ＨE衬染1s, 玻片架放入泡沫盒,流水冲洗15mｉn,肉眼瞧到淡淡得紫色即可停止。 若颜色太深,可用0、１-０、5％盐酸乙醇分色1～2秒钟(或更久)
免疫组化步骤
免疫组化实验步骤 细胞和组织的固定 （一）固定 为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，有必要对细胞和组织进行固定。固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源性酶活性，更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。不同抗原，其稳定性也不相同，因而对固定剂的耐受性差异较大 （二）固定剂 用于免疫组织化学的固定剂种类较多，性能各异，在固定半稳定性抗原时，尤其重视固定剂的选择，介绍如下。 1．醛类固定剂双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联，保存抗原于原位，其特点是对组织穿透性强，收缩性小。有人认为它对IgM、IgA、J链、K 链和λ链的标记效果良好，背景清晰，是常用的固定剂。 1）4%多聚甲醛为我们常用固定剂 2）Bouin’s液 该固定液为组织学、病理学常用固定剂之一，对组织穿透力较强而收缩性较小，比单独醛类固定更适合免疫组化染色。Kayhko认为用于标记B细胞的J链较好，但Bullock则认为它可导致Igg γ重链变性，故必需加大第一抗体的浓度。 2．丙酮及醇类固定剂 系最初免疫细胞化学染色的固定剂，其作用是沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强，保存抗原的免疫活性较好。但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，解决的办法是和其它试剂混合使用，如加冰醋酸、乙醚、氯仿、甲醛等。 丙酮的组织穿透性和脱水性更强，常用于冰冻切片及细胞涂片的后固定，保存抗原性较好，平时4。C低温保存备用，临用时，只需将涂片或冰冻切片插入冷丙酮内5-10min，取出后自然干燥，贮存于低温冰箱备用。 以上介绍了免疫组织化学中常用的固定液，用于免疫组化的固定剂种类很多，不同的抗原和标本需经过反复试验，选用最佳固定液，迄今尚无一种标准固定液可以用于各种不同的抗原固定。而且同一固定液固定的组织，免疫组化染色标记
抗酸染色液(Kinyoun冷染法)
抗酸染色液(Kinyoun 冷染法) 简介： 分枝杆菌的细胞壁内含有大量脂质包围在肽聚糖的外面, 所以分枝杆菌一般不易着色。传统的染色方法要经过加热和延长染色时间来促使其着色。分枝杆菌中的分枝菌酸与染料一旦结合后，就很难被酸性脱色液脱色，故名抗酸染色。其中最具代表性是结核杆菌Ziehl －Neelsen 染色法，该法是WHO 推荐热染的方法。 Leagene 抗酸染色液(Kinyoun 冷染法)属于冷染色液，无需加热，相对较抗酸热染液安全。其染色原理是在室温条件下，分枝菌酸与复红结合成复合物，经亚甲蓝复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为蓝色。该染色法较改良Kinyoun 冷染法要深，更适用于常规抗酸染色，Leagene 推荐该Kinyoun 冷染法作为实验室或临床上标准抗酸染色法。 组成： 自备材料： 1、 接种环 2、 载玻片 3、 蒸馏水 4、 显微镜 操作步骤(仅供参考)： 1、 接种环挑取待检样本，涂布于载玻片上，自然干燥。 2、 滴加Kinyoun 复红染色液，染色。 3、 不必加热，蒸馏水冲洗。 4、 用Kinyoun 脱色液脱色至无红色为止。 5、 蒸馏水冲洗。 6、 用亚甲蓝染色液染色。 7、 蒸馏水冲洗。 编号 名称 DM0035 3×50ml DM0035 3×100ml Storage 试剂(A): Kinyoun 复红染色液 50ml 100ml RT 避光 试剂(B): Kinyoun 脱色液 50ml 100ml RT 试剂(C): 亚甲蓝染色液 50ml 100ml RT 避光 使用说明书 1份
8、轻轻吸干水分，自然干燥。 9、油镜镜检。 染色结果： 抗酸菌红色 非抗酸菌、细胞、背景蓝色 注意事项： 1、每次使用后盖紧试剂瓶，以防试剂挥发和污染。 2、上述试剂均对人体有刺激性，请注意适当防护。 3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。有效期：12个月有效。 相关： = 编号名称 CC0007 磷酸缓冲盐溶液(10×PBS,无钙镁) DC0032 Masson三色染色液 DG0005 糖原PAS染色液 DM0007 瑞氏-姬姆萨复合染色液 DM0016 增强革兰氏染色液 PW0053 Western抗体洗脱液(碱性) TC0713 葡萄糖检测试剂盒(GOD-POD比色法) TC1213 总胆固醇(TC)检测试剂盒(COD-PAP单试剂比色法)
免疫组化操作步骤
免疫组化操作步骤集团标准化工作小组 #Q8QGGQT-GX8G08Q8-GNQGJ8-MHHGN#
免疫组化操作流程 试剂准备 1. PBS缓冲液（～）： NaCl 137mmol/L，KCl L，Na2HPO4 L， KH2PO4 L。 2. L柠檬酸盐缓冲液（CB，，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸。即抗原修复液 : PBS+吐温-20（1000:1）洗液可全部运用PBST 4. 3% 甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。 5. 封片剂：中性树脂+二甲苯。 操作流程 免疫组织化学染色 SP法： 1. 脱蜡、水化： 脱蜡前，应将切片在60℃恒温箱中烘烤60~120分钟，观察石蜡应溶解。 从烤箱拿出切片后尽快置于二甲苯中浸泡30分钟，更换二甲苯后再浸泡30分钟； 无水乙醇中浸泡3分钟； 95%乙醇中浸泡3分钟； 70%乙醇中浸泡3分钟（我用80%）； 50%乙醇中浸泡3分钟； 自来水中浸泡3分钟；
梯度脱蜡 2. 抗原修复：（用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片） 高压热修复高压锅里放少许水，用一量杯或容器（大小能容纳玻片架为宜）装抗原修复液放入高压锅里一起煮沸，再放入玻片架，盖上不锈钢高压锅的盖子，将排气阀门套上，待听到阀门冒气时，即可倒计时2min，之后将玻片杯一起放入凉水中，静置15min，平衡至室温。电磁炉1000W 2min。 3.丢弃抗原修复液，将玻片浸泡在去离子水中（时间不限）可省略 4.用组织笔沿组织边缘画线（可与组织边缘留适当间隙），画完立即放入PBST溶液中浸泡3遍X3min（三个容器，每个容器3min，时间不限制）。 5. 3%H2O2滴加在切片上，室温静置15分钟(3%的H2O2用30%的 H2O2加双蒸水稀释10倍，现配现用。目的为阻断内源性过氧化物酶)； 6. PBST洗3次各3分钟(过三缸) 7. 滴加正常山羊血清封闭液,室温30分钟。用与一抗不同源的血清即可，本人用Western-blotting的含胎牛血清封闭液。 8. 甩去封闭液（注：不要冲洗），滴加一抗50ul（至少50ul否则易干片），4℃孵育过夜。4℃过夜后需在37℃复温45分钟（未验证：室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。）。 9. PBST洗3次各3分钟；
免疫组织化学实验之常用染色方法 百度文库
免疫组化的相关知识！ 一、免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC) 免疫组织化学是利用抗原抗体的特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。免疫组织化学染色技术不仅有较高的敏感性和特异性，其特点是将形态学改变与功能、代谢变化结合起来，直接在组织切片，细胞涂片或培养细胞爬片上定位一些蛋白质和多肽类物质的存在，并可精确到亚细胞结构水平，结合电子计算机图像分析系统或激光扫描共聚集显微术等技术，对被检物质进行定量分析。 二、免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？ 实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片(病理大片和组织芯片)和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。 三、石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？ 石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。 常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。 四、免疫组化实验用抗体的选择 1、一抗选择要点 (1)选择单克隆还是多克隆抗体。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体，单克隆抗体能目标明确地与单一特异抗原决定簇结合，就象导弹精确地命中目标一样。另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对较低；而多克隆抗体特异性稍弱，抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色(可以通过封闭等有所避免)。 (2)种属来源。一般家兔来源的抗体多是多克隆；而小鼠来源的抗体多是单克隆，但也有另外。这条主要要与后面的二抗来源相匹配。 (3)实验目的是检测什么种属的抗原，即species reactivity。这一点很重要，一般说明书
革兰氏染色法的步骤
革兰氏染色法的步骤 详细阐叙革兰氏染色法的步骤 浏览次数:174次悬赏分:0 |解决时间:2011-5-25 17:44 |提问者:肖箫 2011shaw 最佳答案 革兰氏染色 一、目的:在细胞发放之前,利用标准的革兰氏染色法对即将发放的细胞悬液进行检测,判断细胞悬液中是否含有革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。 二、原理: 通过结晶紫初染和碘液媒染后,在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物,革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密,故遇乙醇脱色处理时,因失水反而使网孔缩小,再加上它不含类脂,故乙醇处理不会出现缝隙,因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内,使其仍呈紫色;而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差,在遇脱色剂后,以类脂为主的外膜迅速溶解,薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出,因此通过乙醇脱色后仍呈无色,再经沙黄等红色染料复染,就使革兰氏阴性菌呈红色。 三、实验用品准备: 灭菌玻片、10-100ul移液器、10-100ul灭菌移液吸头、100ul-1000ul移液器、100ul-1000ul移液吸头、接种环、酒精灯、打火机、革兰氏染色液、吸水纸、显微镜、香柏油、擦镜纸、计时器 四、操作: 1 涂片:取灭过菌的载玻片于实验台上,用移液枪吸取10ul待检样品滴在载玻片的中央,用烧红冷却后的接种环将液滴涂布成一均匀的薄层,涂布面不宜过大。 2 干燥:将标本面向上,手持载玻片一端的两侧,小心地在酒精灯上高处微微加热,使水分蒸发,但切勿紧靠火焰或加热时间过长,以防标本烤枯而变形。 3 固定:固定常常利用高温,手持载玻片的一端,标本向上,在酒精灯火焰处尽快的来回通过2-3次,共约2-3秒种,并不时以载玻片背面加热触及皮肤,不觉过烫为宜(不超过60℃),放置待冷后,进行染色。 4 初染:在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1-2滴,使染色液覆盖涂片,染色约 1min。 5 水洗:斜置载玻片,在自来水龙头下用小股水流冲洗,直至洗下的水呈无色为止。 6 媒染:用100-1000ul移液枪吸取约300ul碘液滴在涂片薄膜上,使染色液覆盖涂片,染色约1min。
免疫组化染色操作顺序
精心整理免疫组织化学染色原理和操作步骤 一、免疫组织化学原理 免疫组织化学（IHC）又称免疫细胞化学，是根据抗原—抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。免疫组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗，形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素—生物素—过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素—过氧化物酶（SP）法。 PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响，但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物（含3个酶分子和2个抗体分子），染色时依次加入一抗、二抗、PAP复合物孵育标本，最后用H2O2和二氨基联苯（DAB）为底物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。 生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合4分子生物素，ABC法即在此基础上建立。ABC法与PAP法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显色。ABC法的敏感性较PAP法更高。 图1.免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》） SP法与ABC法相似，其不同于ABC法之处在于用生物学特性与亲和素相似的链亲和素标记过氧化物酶。在标本孵育过一抗和二抗后，加入链亲和素标记的过氧化物酶使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB 进行显色。与亲和素相比，链酶亲和素的结合力与亲和素相似而非特异性结合较亲和素低。SP法简化了操作步骤，同时也减少了非特异性背景，是目前应用最为广泛的免疫绥化染色技术。 二、实验准备： 1.标本准备 图2.SP法原理示意 ①石蜡包埋组织切片：由病理室常规处理 ②冰冻组织切片：由病理室常规处理
免疫组化基本步骤
细胞免疫组化染色步骤 1．细胞爬片，取出后，PBS洗三遍，每次3分钟。4℃冷丙酮固定10分钟，（或用4%多聚甲醛固定30分钟），干燥30分钟。 2. 用PBS洗三次，每次5分钟，加3%过氧化氢30μl，室温孵育10分钟，（以消除内源性过氧化物酶的活性）蒸馏水冲洗，PBS洗三次，每次5分钟。 3．加1%的Triton X-100 30μl，室温孵育10分钟，增加细胞膜的通透性。蒸馏水冲洗，PBS洗三次，每次5分钟。 4．滴加正常山羊血清30μl，封闭非特异性结合位点，以消除非特异性染色，室温孵育30分钟，倾去勿洗。 5．滴加适当稀释度的一抗，空白对照组以PBS代替一抗，4℃湿盒孵育过夜。PBS洗三次，每次5分钟。 6．滴加生物素标记的二抗工作液30μl，室温孵育30分钟。PBS洗三次，每次5分钟。 7．滴加辣根酶标记链酶卵白素30μl，室温孵育30分钟。PBS洗三次，每次5分钟。 8．滴加DAB显色剂30μl，显微镜下观察显色，自来水冲洗。 9. 将处理好的玻片细胞核衬染：浸入苏木精染液染色2min，自来水洗，迅速过盐酸酒精溶液，自来水洗，过氨水溶液，自来水洗。 10.梯度酒精脱水，过70%酒精1次，95%酒精2次，无水乙醇3次，每次1min 11.二甲苯透明，过二甲苯溶液3次，每次１min。 12.中性树胶封片将有细胞的一面向下，用中性树脂封片。 稀盐酸酒精溶液：用75%酒精配制1%盐酸。 淡氨水溶液：在400ml自来水中滴2滴浓氨水(使细胞核蓝化) 另外：需1%TritonX-100增加细胞膜通透性。苏木素复染时间和盐酸酒精脱色时间需自己摸索，我是染5-6秒脱色1-2秒。盐酸酒精还可用70%乙醇配制1%盐酸。我没用淡氨水溶液。若为悬浮细胞则需涂片，20μl即可。