欧盟转基因生物安全检测技术分析

摘要：为了了解欧盟转基因生物安全检测技术发展现状，提高我国转基因安全监管水平。本研究根据对欧盟8家转基因检测相关机构现状的调查和分析结果，阐述了转基因检测过程中的关键技术要点及欧盟的实施情况，具体包括抽样与制样方法，转基因检测方法的循环验证与参数要求，样品的检测策略与实验室环境要求，以及检测结果的表述与不确定度评估。并结合我国转基因生物安全检测发展现状，提出了开展检测方法的实验室联合验证和加强转基因定量PCR检测技术的研发和应用的建议。

关键词：欧盟;转基因生物;检测技术

引言

1.随着转基因技术的兴起和快速发展，转基因产品的安全性问题逐渐成为国际社会普遍关注的热点和焦点[1，2]。为促进转基因产业的健康发展，保障消费者的知情权和选择权，世界上许多国家和地区颁布了相关的转基因生物安全管理与标识制度[3-5]。其中，欧盟是世界上转基因生物安全管理与标识管理制度较为严格和完善的地区，也是第一个提出进行阈值管理的地区[6]。为了给转基因生物安全管理与标识制度提供技术支撑，欧盟花费庞大人力、物力和财力进行转基因检测技术研究。

2.构建了完善的转基因检测方法循环研制实验室网络和转基因检测标准物质研制机构[7，8]。在欧洲，执行转基因检测的机构组成了欧洲转基因检测网络实验室(EuropeanNetworkofGMOLaboratories，ENGL)。ENGL除了进行日常检测，还对欧盟设置在欧盟联合研究中心(JointResearchCentre，JRC)下属健康与消费者保护研究所(InstituteforHealthandConsumerProtection，IHCP)的欧盟转基因食物与饲料基准实验室(EuropeanUnionReferenceLaboratoryforGMFood&Feed，EURL-GMFF)研制和提供的转基因检测方法进行验证[9，10]。

3.目前国际上研制的转基因检测标准物质和发布的转基因检测标准方法有一半以上来自欧盟，因此有必要对欧盟的转基因检测技术平台进行分析研究。根据在欧盟联合研究中心健康及消费者保护研究所下属欧盟转基因食品和饲料基准实验室、意大利拉齐奥大区和托斯卡纳大区动物预防性实验研究院下属转基因检测国家基准实验室、翁布里亚区食品科技园(3A-PTA)内第三方食品安全检测实验室(Analysis)、洛迪省Tavazzano种子检测实验室等8家转基因检测相关机构(实验室)和单位进行的调研和考察，本文重点阐述了转基因检测过程中的关键技术要点以及欧盟的实施情况。并结合我国转基因生物安全检测发展现状提出相应建议，旨为我国转基因检测技术的发展提供参考。

一、抽样与制样

1.1抽样是转基因成分检测的第一个环节，也是非常复杂和重要的环节。抽样要有代表性，要能准确反映出样品的总体情况[11]。欧盟国家转基因安全管理主要遵循预防原则，与我国采取的源头控制理念类似。以意大利为例，目前意大利尚未批准转基因作物的商业化种植，在转基因生物监控计划实施过程中，边境检查站、国家宪兵队和地区卫生部门等执法机构负责抽样工作，样品主要来自进口等环节;农业部执法机构抽检样品则主要来源于种子企业的种子库，基本不对市场上销售的产品进行检测。

1.2因此，意大利转基因检测抽样主要是针对批次货物，不涉及田间种植样品。在典型情况下，欧盟国家执法机构的抽样工作参照《Rec.2004/787/ECTechnicalguidanceforsampl-inganddetectionofGMOs》进行[12]，可以对多至109粒的样品进行抽样。多个取样点至少可以获得105粒种子，将多个取样点的样品混匀，从中取出3份各3000粒种子交给转基因检测机构进行检测。转基因检测机构将其中一份3000粒种子粉碎，取少量(至少包含105个粉碎的颗粒)粉末提取DNA，用于转基因检测(批

次样品量大小及其组成，见表1)。

1.3通过了国际种子协会(InternationalSeedTestingAssociation，ISTA)认证的检测机构，在收样时遵从ISTA规范的规定，每份检测样品至少含有3000粒种子。种子检测机构一般将样品分为5份，并研磨其中2份用于转基因检测，因此，总收样量至少15000粒。在我国转基因检测工作中，种子类样品一般至少检测3000粒。对比来看，我国标准和欧盟的规范均能在95%的置信度下保证0.1%的检测灵敏度，我国做法是符合国际规范的。

1.4在计算种子数量方面，Tavazzano种子检测实验室的做法有自己的特色，在我国标准中，规定了不同作物种子的千粒重，而Tavazzano种子检测实验室采用了实测的值。在现实情况中，相同作物不同品种种子千粒重可能有翻番的差别，因此采取一个固定值有较大误差。在可能情况下，在相关标准制定和修订时应考虑这个因素。欧盟从事转基因检测的第三方检测机构也采用了经济合作与发展组织(OrganizationforEconomicCo-operationandDevelopment，OECD)的标准通过了良好实验室管理规范(GoodLaboratoryPractice，GLP)认证，与政府实验室类似，其样品也来源于委托方送样，并仅对来样负责。

二、转基因检测方法的认定

2.1转基因检测方法的标准化是获得准确可靠、具有可比性检测结果的基础[13]。JRC 下属欧盟转基因检测基准实验室的主要任务是为欧盟的立法提供技术支持，工作的重点在检测方法的研究和验证上，不从事一般的日常检测工作。依据欧盟法规，申请在欧洲释放的转基因生物，需要通过某一成员国主管当局申请。成员国主管当局在确认收到申请的同时，应在90d内作成一份评估报告。若同意申请，成员国主管当局应尽快将评估报告和相关的信息发送给欧盟委员会和其他欧盟成员国。

2.2欧盟委员委托欧盟食品安全局(EuropeanFoodSafetyAuthority，EFSA)在医学、营养学、毒理学、生物学、化学和其他相关学科方面的专家进行评估。如果欧盟食品安全局和其他欧盟成员国没有提出反对意见，则应以书面形式批准转基因生物投放市场。与此同时，申请者需向欧盟转基因检测基准实验室(或称参考实验室)提交检测方法和对照材料，由欧盟参考实验室组织12家欧盟实验室网络成员，对检测方法进行循环验证。检测方法达到欧盟相关法规要求的，方可依据安全评价结果，给予授权。

2.3欧盟转基因生物授权程序，见图1。由于欧盟要求对转基因食品进行标识，并设置了标识阈值，因此提交给欧盟参考实验室的转基因检测分析方法均为实时荧光定量PCR检测方法，依据欧盟对转基因检测分析方法最低性能要求的定义，欧盟对检测方法认定分为两个阶段，第一阶段为申请者提交方法文本的检查，第二阶段为检测方法的循环验证。在第一阶段，主要考察申请者提交检测方法的如下性能特性：(1)适用性;(2)可操作性;(3)特异性;(4)动态范围，即检测的精确性和准确性在线性范围内的转基因成分浓度区间;(5)准确性，±25%范围内;(6)扩增效率，标准曲线斜率在-

3.6至-3.1之间;(7)相关系数，R2≥0.98;(8)重复性标准偏差，线性范围内RSDr<25%;(9)定量极限，RSDr<25%前提下小于法规要求的标识阈值0.9%的1/10，即0.09%或50拷贝;(10)检测极限，在95%置信度下，小于法规要求的标识阈值的1/20，即0.045%;(11)稳健性，即可以忍受检测实验条件的小的变化，在此变化下检测结果偏差不会超过±30%。在第二阶段，主要通过多实验室联合测试，确保申请者所提交方法符合欧盟要求，并且在不同实验室有同样性能表现。考察的主要指标为动态范围、再现性标准偏差和准确性。实验室联合验证中，在精确度方面，所有浓度样品的RSDr均应低于35%。当浓度小于0.2%时，RSDr在小于50%的范围内都是可以接受的。在准确度方面，所有浓度样品的偏差不得超过±30%。

三、样品检测

3.1欧盟转基因检测机构无论采用何种技术规范，参加何种体系的认证，出具的定性或定量报告，基本都采用荧光定量PCR进行检测。与常规PCR相比，荧光定量PCR显著减