一株新型鸭源呼肠孤病毒_TH11株_的分离与鉴定_陈宗艳
Chinese Journal of Animal Infectious Diseases
中国动物传染病学报2012,20(1): 10-15一株新型鸭源呼肠孤病毒（TH11株）的分离与鉴定
·研究论文·
陈宗艳1，朱英奇1，王世传2，李传峰1，李 露1，王玢缤1，
付玉志1，高景鹏1，王 超1，刘光清1
（1.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241；2.安徽省全椒县畜牧兽医局, 全椒 239500）
摘 要：本文从太湖流域某养鸭场分离到一株呼肠孤病毒（Duck reovirus, DRV ）TH11株，该病毒感染的病鸭主要表现软脚和拉稀等主要症状，剖检病变以肝脏出血和脾脏坏死为主要特征。电镜鉴定结果显示，该病原具有呼肠孤病毒的典型形态学特征。动物回归试验和RT-PCR 扩增结果证明，该株病毒无论是在致病性方面，还是在基因序列方面都不同于以往的番鸭呼肠孤病毒，而是一株对多品种鸭具有较高致病性和病死率的新型鸭呼肠孤病毒。关键词：鸭源呼肠孤病毒；动物回归试验；电镜；RT-PCR
中图分类号：S858.322.659.4 文献标志码：A 文章编号：1674-6422（2012）01-0010-06
ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF A NEW TYPE OF DUCK
REOVIRUS
CHEN Zong-yan 1, ZHU Ying-qi 1, WANG Shi-chuan 2, LI Chuan-feng 1, LI Lu 1, WANG Fen-bin 1, FU
Yu-zhi 1, GAO Jing-peng 1, WANG Chao 1, LIU Guang-qing 1
(1.Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2.Quanjiao Animal Husbandry and Veterinary bureau, Anhui
Province, Quanjiao 239500, China)
Abstract: A new infectious disease emerged on a ducks farm in Jiangsu Province. The sick ducks showed weakness in legs and diarrhea and pathological ? ndings included necrotic foci in the spleens and hemorrhage in the livers. A virus was isolated from the liver and spleen of a dead duck. The virus isolate designated Duck reovirus(DRV) TH11 was demonstrated different from those previously documented in pathogenecity in ducks, genetic analysis in RT-PCR and morphology under electron microscopy. Therefore, the virus isolate DRV-TH11 represented a new type of duck reovirus.
Key words: Duck reovirus; animal regression experiment; electron microscopy; RT-PCR
收稿日期：2011-01-11
基金项目：中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（2012JB06，2012JB13）；公益性农业科研专项(201003012)；“863”
计划（2011AA10A200）
作者简介：陈宗艳，女，博士，主要从事动物病毒学研究通信作者：刘光清，E-mail：liugq@https://www.360docs.net/doc/0a14788613.html,
2011年上半年，中国太湖流域的许多养鸭场陆续发生一种新的鸭病毒性传染病，临床主要表现为发病雏鸭软脚，排白色稀粪，发病率约20%~60%，病死率在80%以上，给养鸭业造成了较为严重的经济损失。该类病例的临床病变主要为：肝脏呈土黄色，质脆，有点状、斑块状出血，或黄白色坏死灶；
脾脏肿大、出血，呈暗红色，有多处大小不等的淡黄色坏死灶；其他脏器也表现出不同程度的肿大或出血等。为了查明该病的病原，我们对采集的病死鸭病料进行了病原分离和鉴定。初步研究结果表明，造成该次疫情的病原是一种不同于番鸭呼肠孤病毒的新型呼肠孤病毒。
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1 材料与方法
1.1 材料病料采集于安徽省太湖县某养鸭场；SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司；SPF鸭胚购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。
1.2 试剂 Tissue DNA/RNA Kit 、Premix Taq TM （Ex Taq TM Version）、DNA Marker（DL2000）购自TaKaRa公司；DMEM细胞培养液、胎牛血清购自GBICO公司。
1.3 病毒分离 将病料剪碎，按1:5体积加生理盐水，匀浆器匀浆后反复冻融3次，10 800×g、4 ℃离心30 min，吸取上清液，0.22 μmol/L滤膜过滤除菌。取上述滤液接种按常规方法[1]制备的鸭胚成纤维细胞（Duck embryo fibroblasts, DEFs），出现病变时收集细胞液。过滤除菌的滤液同时经尿囊腔途径接种9日龄鸡胚10枚，接种量为0.2 mL/枚。接种后，置37 ℃生化培养箱恒温孵化。弃去24 h 内死亡的鸡胚，每间隔12 h观察一次，收获死亡的胚体及尿囊液并记录结果。连续传3代，至该病毒致死鸡胚稳定为止。
1.4 病毒半数鸡胚致死量（ELD
50
）的测定将分离株病毒悬液作10倍系列稀释，取105、106、107、108稀释度接种鸡胚，0.1 mL/个，每一稀释度接种5个鸡胚，观察记录鸡胚的死亡数，计算各稀释度的百分率。按Reed 和Muench 法计算病毒半数致死量（ELD50）[2]。
1.5 动物回归试验 1日龄健康太湖麻鸭20只，随机分为攻毒组和对照组，各16只和4只。攻毒组中8只鸭皮下注射病毒液0.5 mL，8只鸭口服病毒液0.5 mL。
1.6 电镜观察 收集病毒感染的鸡胚尿囊液, 以4 ℃、15 000×g离心30 min（Beckman）以除杂蛋白，上清转移至铺有蔗糖（40%，W/W；PBS 配制）垫层的离心管中，于4 ℃、45 000×g（rotor SW32 Ti, Beckman）离心3 h。超离后的沉淀用水重悬, 取样使用磷钨酸负染后于JEM-1200EX电子显微镜下观察。
1.7 RT-PCR检测按照Tissue DNA/RNA Kit说明书从细胞裂解液中提取病毒总RNA，随机引物反转录后做为模板扩增全基因。根据禽源呼肠孤病毒S2基因的部分序列设计特征性引物：上游引物P1: 5'-GCATGAACATGCCAGTTGAG-3'；下游引物P2: 5'-AAGCCATAACGATGGCAGTC-3'，其扩增长度为320 bp。引物由上海英骏生物公司合成。PCR 反应体系为: 2×PCR Taq Mix 25 μL、上游引物（50 μmol/L）1μL、下游引物（50 μmol/L）1 μL、cDNA 模板4 μL、无菌ddH2O 19 mL，总体积为50 μL。反应条件为: 94 ℃预变性5 min ；
94 ℃变性40 s ，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min ，33个循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，用AXYGEN Gel Ext reaction Kit回收纯化后，将扩增的片段与pMD18-T载体连接，转化感受态细胞DH5α ，挑菌落PCR 鉴定，得到含目的片段的重组阳性菌株，用于测序分析。
1.8 序列测定及分析 将阳性克隆送上海桑尼工程有限公司测序,使用DNAStar、Mega4.1软件对测定的病毒核苷酸序列与GenBank中收录的禽源呼肠孤病毒的序列进行同源性比对和分析。
2 结果
2.1 病毒分离 将病毒液接入DEFs细胞，培养48 h后出现细胞堆聚，细胞核浓缩，胞间界限模糊，部分细胞脱落，有噬斑形成（图1）。培养72 h后，大部分细胞脱落。
将病毒液接种鸡胚后，鸡胚在60~84 h死亡，表现为胚胎蜷缩，体表充血、出血严重，全身弥漫针尖大小的出血点；内脏病变主要表现为肝脏肿大、质脆，出血明显，有边缘坏死灶（图2）。此外，病变呈渐进性，早期死亡胚肝脏出血比较多见，但随着死亡时间的延长，胚体肝脏出现边缘坏死增多。
2.2 病毒半数鸡胚致死量（ELD
50
）分离到的毒株命名为TH11。其ELD50测定结果为： ELD50=107.1/0.2 mL。
2.3 动物回归实验 两种攻毒途径的鸭均在接毒后
d 3发病，接毒后5 d内死亡，其发病率和死亡率分别为100%（8/8）和100%（8/8）。发病鸭精神萎靡，排白色稀粪。剖检发现肝脏呈土黄色，质脆，
· 12 ·2012年01月
中国动物传染病学报有点状或斑块状出血；脾脏肿大，呈暗红色,有多处约2 mm 大小不等的淡黄色坏死点；肾脏表面出
血（图3）。对照鸭无临床症状。临床自然病死鸭
的临床病理变化与上述基本一致。
图1 分离的鸭源呼肠孤病毒TH11株引起鸭胚成纤维细胞的病变情况Fig.1 Cytopathic effect on duck embryo ? broblast induced by DRV-TH11 isolate
a: DEFs 对照; b: 接毒48 h 后, 细胞堆积, 部分脱落, 形成噬斑
a: DEFs of control group; b: Some plaques appears on DEF monolayer at 48 h postinfection(200×
)
图2 DRV-TH11接种鸡胚
Fig.2 Lesions of chick embryo experimentally infected with DRV-TH11a: 正常胚; b: 死亡胚肝脏肿大、质脆、出血, 边缘有坏死灶; c: 死亡胚全身出血
a: Normal chicken embryo; b: Swollen and spot bleeding with some marginal necrosis in the liver of the dead embryo; c: Systemic hemorrhage in the dead embryo
病毒稀释度Virus dilution
观察结果
Result
总死胚数
Total numbers of dead embryos
总活胚数Total number of live
embryos 死亡率(%)
Mortality rate
死胚数Numbers of dead embryos 活胚数
Number of live embryos
1045018
010010550130100106418180107324360108141720109
5
12
表1 DRV-TH11分离株接种鸡胚死亡率
Table 1 Mortality rate of chick embryo experimentally infected with DRV-TH11 strain
· 13 ·
第20卷第1期陈宗艳等：一株新型鸭源呼肠孤病毒（TH11
株）的分离与鉴定图3 动物回归实验
Fig. 3 Lesions of ducks experimentally infected with DRV-TH11
a: 发病鸭站立不稳, 排灰白色粪便; b: 肾脏出血; c: I 为对照组鸭的脾脏; II 、III 为攻毒组鸭的脾脏, 肿大, 呈暗红色, 有多处约2 mm 大小不等的淡黄色坏死点; d: 肝脏部分呈淡黄色,质地变脆, 有点状或块状出血
a: Unstable gait, weakness in legs and white loose feces in the infected ducks; b: Renal hemorrhage; c: Swelling and necrotic foci in the spleen; d: Yellow discoloration and hemorrhage in the friable liver.
图4 电镜观察超速离心纯化的病毒粒子
Fig.4 Observation of puri ? ed DRV-TH11 particles by
electron microscopy
2.4 电镜样品的制备及观察 收集的病毒尿囊液经蔗糖垫底超速离心后，管底有沉淀聚集。使用PBS 悬浮沉淀，取少量经磷钨酸负染后，电镜观察，可观察到具有典型呼肠孤病毒形态学特征的病毒颗粒（图
4）。
2.5 基因同源性比较和进化树分析 从攻毒细胞裂解液中提取病毒RNA，用设计的特异性引物进
行RT-PCR，可以获得预计大小的片段(图5)。经过序列测定和分析，获得320 bp 核苷酸序列。将其与GenBank 中的参考毒株DRV（JF320803）、DRV（HM591300）、DRV（FJ858376）、MDRV （AY219225）、MDRV（AY962265）、MDRV （EF076764）、MDRV（AY962259）、MDRV （AY589090）、MDRV（DQ013347）、MDRV
图5 RT-PCR 扩增DRV-TH11
Fig. 5 RT-PCR ampli ? ed product of DRV-TH11 M: DNA 分子量标准(DL5000); 1: 300 bp 目的条带; 2: 阴性对照M: DNA Marker(DL5000); 1: 300 bp fragment; 2: Negative
control
bp
· 14 ·2012年01月
中国动物传染病学报（DQ013346）、MDRV（DQ013348）、MDRV （AJ278102） 的S2基因的部分核苷酸序列进行同源性比较，结果表明: 核苷酸序列同源性分别为
97%、96%、95%、92%、92%、92%、92%、
图6 DRV-TH11与其他参考毒株S2基因部分序列的遗传进化树分析
Fig.6 Phylogenetic tree of partial S2 gene between DRV-TH11 and other Arian reovirns(ARV)
92%、92%、92%、91%、90%。遗传进化树分析结果表明，DRV-TH11与2009年从福建分离的DRV 毒株（JF320803）亲缘关系较近，而与番鸭源呼肠孤病毒亲缘关系较远（图6）。
3 讨论
禽呼肠孤病毒（Avian reovirus，ARV）是呼肠孤病毒科、正呼肠孤病毒属的成员，为无囊膜、双股分节段的RNA 病毒。ARV 呈世界性分布，可感染鸡、火鸡及其他水禽类
[3-5]
。胡奇林等
[5]
分别
在福建省、广东省以肝、脾表面有大量坏死点为主要病理变化的病番鸭中分离到呼肠孤病毒，将其命名为番鸭呼肠孤病毒（Muscovy duck reovirus，MDRV）。ARV 与番鸭呼肠孤病毒（Muscovy duck reovirus，MDRV） 在致病性、抗原性、电泳图谱、病毒基因编码蛋白的顺序，以及病毒基因间的同源性方面存在着很大的差异。程安春等[7]根据“Koch 假说”，认为四川省的患病鸭中存在一种新的病毒性传染病，并根据病毒的特性建议将分离毒划归呼肠孤病毒科，其名称暂定为“鸭病毒性肿头出血症病毒”（Duck viral swollenhead haemorrhagic disease virus），但未见有病毒分离报道。2008年，刘红等[8]对广东省某市一种以肿头、软脚、流泪，拉黄绿色稀便，肝出血和坏死及食道泄殖腔溃疡和结痂为主要特征的鸭病。在进行病因调查时，他们分离到多
株病毒，其中包括1株呼肠孤病毒DRV-GZ 株。陈少莺等[9]从临床表现为肝脏不同程度点斑块状出血和坏死点灶为主要病变的病死雏番鸭、雏半番鸭和雏麻鸭肝脾组织中分离到呼肠孤病毒，并证明它是鸭出血性坏死性肝炎的病原。2011年，Liu 等[10]从临床解剖以脾坏死为特点的北京鸭中分离到DRV-HC 株，其动物回归实验表明，DRV-HC 在15 d 内引起未能引起鸭的死亡，但能引起SPF 鸡的死亡。
本研究从以脾脏坏死，肝脏点状或斑块状出血为主要特征的，临床表现为站立不稳的病死鸭中分离到鸭源呼肠孤病毒。透射电镜观察证明该病毒粒子具有呼肠孤病毒粒子的特征。经动物回归试验, 该病毒能高度致死实验感染鸭，产生与临床自然病死鸭基本一致的临床病理变化。初步表明分离毒是鸭站立不稳、脾坏死的病原。依据上述特性，认为该分离毒株有别于以往的分离株，我们将此分离毒归属于呼肠孤病毒科、正呼肠孤病毒属新型鸭呼肠孤病毒（DRV-TH11）。与经典的番鸭源呼肠孤病毒不同，本研究中分离的DRV-TH11株不仅能致死鸡胚，还可在DEFs 中良好增殖。另外，与DRV-HC
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株相比较，DRV-TH11的致病性更强，其毒力变异的分子机制还有待于进一步研究。
为了探讨TH11株与国内、外参考毒株之间的遗传关系，我们将TH11株的S2基因部分核苷酸序列与参考毒株进行了比对和分析。结果发现，TH11株与番鸭呼肠孤病毒的同源性比较低（90%~92%），而与新近报道的麻鸭源呼肠孤病毒的同源性则较高（95%~97%）。系统发生树分析结果也显示，TH11与 新型鸭呼弧肠孤病毒（如福建分离株（JF320803））处于同一进化分支，具有较近的亲缘关系，而与早期的番鸭呼肠孤病毒则处于不同的分支，据此，我们推测当前在中国鸭群中流行鸭呼肠孤病毒病是由一种新型鸭呼肠孤病毒引起的。至于该病原是由番鸭呼肠孤病毒变异而来，还是一种新出现的病原，目前尚缺乏充分的证据。
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鸭传染性浆膜炎的鉴别诊断
鸭传染性浆膜炎的鉴别诊断 鸭传染性浆膜炎是由鸭疫里默氏杆菌引起的一种急性、败血性传染病。本菌现有21个血清型，各血清型之间无或少交叉保护，为革兰氏阴性杆菌。病变以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎以及部分病例出现干酪性输卵管炎、结膜炎、关节炎为特征。 养鸭场一旦传入本病，病原即在发病鸭场持续存在，引起不同批次的幼鸭感染发病，且难以扑灭，是当前危害养鸭业的主要传染病之一。 流行病学诊断：本病一年四季都可发生，低温、阴雨潮湿的季节较为多见，尤以冬春季为甚。各品种鸭均易感，1-8周龄鸭多发，其中以2-3周龄的小鸭最易感，8周龄以上的鸭很少发病。 本病的发生和流行与应激因素有密切的关系，如果卫生条件差、饲养密度过大、饲料营养不均衡、缺乏维生素和微量元素等，更易造成本病的发生和传播。 临床诊断 1、最急性病例未见明显症状便突然死亡。 2、急性病例主要表现为嗜睡、缩颈、软脚、食欲下降，下痢，粪便稀薄呈白色或淡绿色。眼的周围有湿润的分泌物黏着，故有“眼镜鸭”之称。鼻孔常流出浆液或黏液性分泌物。部分病例出现神经症状，如头颈震颤、转圈、不停的摇头、点头、阵发性痉挛，向上仰望、两腿伸直呈角弓反张状，不久抽搐而死。还有的病例出现呼吸困难、张口呼吸、跗关节肿胀等症状。病程一般为1-3天。 3、4-7周龄鸭病程1周或以上，多呈亚急性或慢性经过。临床主要表现为精神沉郁、困倦，少食或不食，下痢，腿软、伏卧或呈犬坐姿势，间有共济失调、痉挛性点头、摇头摆尾、前仰后翻、翻倒后仰卧、两腿在空中划动，呈游泳状，不易翻转，惊叫，头颈歪斜，转圈或倒退等神经症状。病程1周以上。
病理诊断 最急性病不出现明显症状而突然死亡。最特征的病理变化是浆膜表面的纤维素性渗出物，尤以纤维素性心包炎、纤维素性肝周炎和纤维素性气囊炎（三炎）最明显。 1、心包炎，心包液增多，心包膜附着纤维素性渗出物，心包内填充淡黄色纤维素快，病程较长时可见心包膜与心外膜粘连。 2、肝周炎，肝肿明显大于正常，肝呈橙红色或土黄色，质脆，胆囊肿大；肝脏表面覆盖有一层极易剥离的灰白色或灰黄色纤维素膜，病程较长时渗出物呈干酪样不易剥离。 3、气囊炎，气囊壁增厚，浑浊，不透明，表面有纤维素性渗出物；病程较长时渗出物可机化而与胸壁粘连，有时个别病例腹腔积液。 4、脾脏略肿大，呈斑驳状，表现有灰白色坏死斑点，表面附着纤维素性假模。 5、部分病例肠道充血出血，以十二指肠最为严重，表面有黄色胶东样分泌物，直肠处可见白色或浅绿色稀粪。 6、患鸭有神经症状时，可见纤维素性脑膜炎，脑膜充血出血。 7、慢性病例还见有坏死性皮炎和关节炎。 鉴别诊断 临诊上对鸭疫里默氏杆菌病的诊断应注意与大肠杆菌病、鸭衣原体病、雏番鸭“花肝病”、鸭沙门氏菌病、鸭流感、鸭副粘病毒病、鸭病毒性肝炎、鸭霍乱、曲霉菌病、小鸭副伤寒、鸭瘟等相区别。 1、与大肠杆菌病的鉴别诊断患病鸭群发生本病时，常有60%以上的病群同时混合感染大肠杆菌病。大肠杆菌性败血症的病变表现为心包炎、肝周炎和气囊炎，与鸭疫里默氏杆菌病的病变非常相似。 大肠杆菌病剖检时有特殊臭味，病鸭心脏和肝脏表面附着的渗出物较厚，一般为干酪样（凝乳状），色较重，不易剥离，肝脏肿大呈铜绿色。鸭疫里默氏杆菌病
第16章 呼肠孤病毒科(Reoviridae)
第十六章呼肠孤病毒科（Reoviridae） 一、概述 二、正呼肠孤病毒属 （一）哺乳动物呼肠孤病毒 （二）禽呼肠孤病毒 三、环状病毒属 （一）蓝舌病病毒 （二）非洲马瘟病毒 （三）鹿流行性出血病病毒 （四）茨城病病毒 （五）马器质性脑病病毒 四、轮状病毒属 五、COLTI病毒属 科罗拉多蜱传热病毒 六、水生呼肠孤病毒属 草鱼出血病病毒 主要参考文献 一、概述 同义名：双股核糖核酸病毒科 本科的命名是取自3个英文单词的词头组合而成，全称是呼吸道（respiratory）、肠道（enteric）和孤儿（orphan）病毒。于50年代早期，当乳鼠和灵长类的细胞培养开始广泛应用于病毒学实验室时，从人的呼吸道和胃肠道分离出这类病毒，但与任何疾病都不相关，分类鉴定为小RNA病毒。几年以后，发现该病毒的基因组为双股RNA，并分节段。1959年建议命名为呼肠孤病毒，强调了其与疾病的不相关性。但是随后发现，这些病毒也有一定的病原性，一些成员还是某些特定疾病的病原体，因此建议改称呼肠病毒。本书照顾习惯，仍称呼肠孤病毒，也与英文“Reo”相应。在证明呼肠孤病毒的基因组是由若干片段组成的双股RNA后，接着又发现三叶草的伤瘤病毒（Clover wound tumour virus, WTV）也含双股RNA，而且病毒粒子的形态结构极像呼肠孤病毒，从而引起病毒学工作者对双股RNA病毒的极大兴趣。此后，相继在脊椎动物、无脊椎动物、细菌、高等植物和真菌等宿主体内发现了60种以上的双股RNA病毒（虽其形态结构和生物学特性不尽一致）。 呼肠孤病毒基因组是双链ＲＮＡ这一重要发现，第一次说明了双链ＲＮＡ可作为稳定的生命形式存在于自然界。1968年，Verwoerd等建议成立一个新的分类学类群，称为“双股核糖核酸病毒”（亦即双股RNA病毒）。1971年，Borden等在原来的呼肠孤病毒群中的某些病毒的负染标本上，发现病毒壳粒呈短粗中空的环状，建议成立环状病毒属。1974年，Flewett等根据犊牛腹泻病毒和婴儿腹泻病毒的形态类似车轮的特点，又提出了“轮状病毒”这一新的病毒名称。1975年，国际病毒命名委员会正式采用这一名称，并于1978年将其列为一个病毒属，而将原来的呼肠孤病毒属提升为科，从而在呼肠孤病毒科下包括呼肠孤病毒属、环状病毒属和轮状病毒属等三个病毒属。1991年，国际病毒分类委员会（ICTＶ）第5次病毒分类报告中新增科州蜱传热（ＣＯＬＴＩ）病毒属及水生呼肠孤病毒属，将呼肠孤病毒科分为呼肠孤病毒亚群（正呼肠孤病毒属、环状病毒属、轮状病毒属、COLTI病毒属、水生动物呼肠孤病毒属)、胞质多角体病毒群（胞质多角体病毒属
病毒分离方法
植物内生菌分离方法 植物内生菌分离方法 匿名提问 2009-02-18 20:04:53 发布 自然科学学术 6个回答 回答 曲恋| 2009-02-18 20:45:40 有0人认为这个回答不错| 有0人认为这个回答没有帮助 植物内生放线菌是一类大有开发潜力的微生物资源。目前使用的分离条件和技术尚不完善，容易被外源菌和内生真菌、细菌污染，因此内生放线菌尤其是稀有内生放线菌的选择性分离技术至少是今后一段时间研究的重点。介绍了植物内生放线菌选择性分离方法并提出值得研究的问题。( 添加评论(0) nk0226 | 2009-07-25 11:13:09 有0人认为这个回答不错| 有0人认为这个回答没有帮助 植物病毒与病毒防治 Plant Virology& Control of Plant Virology 32学时2学分 一、课程性质、地位和任务 植物病毒与病毒防治是研究病原病毒与植物病毒病害相互关系的生物学科。本课程重点讲授植物病毒相关生物学特性与研究进展：病毒侵染寄主植物生理效应与抗病免疫；植物亚病毒病原等基础理论知识。同时，根据植物病毒基础研究需要，课程理论讲授与实验技能训练并重。通过本课程的学习，使学生进一步熟悉病毒病原与其它相关病原的区别要点，病害宏观及微观鉴定基本技术、方法、手段，并能在实践中应用。为独立开展植物病毒及病毒病害研究奠定基础。 二、课程教学的基本要求 要求学生重点掌握以下内容： （1）植物病毒的传播途径及传毒机制；
（2）病毒侵染植物内部症状，侵染增殖过程； （3）植物受病毒侵染的生理效应与抗病免疫； （4）植物亚病毒病原的基本特性； （5）植物病毒与病毒病害诊断鉴定的程序与方法。 三、课程理论教学大纲及学时分配 1. 绪论（2学时） 1.1 病毒的发现与病毒学的发展 1.2 研究病毒的意义与任务 1.3 植物病毒与其他病毒的关系 1.4病毒与其他微生物的区别 2. 病毒的分类与命名（3学时） 主要介绍病毒分类和命名的基本原则相关指标。重点：植物病毒的命名和分类系统。 2.1 病毒命名和分类的发展 2.2 病毒命名的系列 2.3 病毒分类的系列 2.4 植物病毒的命名和分类系统 3. 病毒侵染植物与增殖与增殖过程及遗传与变异（5学时） 主要讲授植物病毒侵染方式，在寄主体内的增殖过程，病毒遗传变异的本质。难点:病毒进入寄主细胞的方式及粒体装配。 3.1病毒粒体的吸附与侵入 3.2病毒粒体的脱壳与生物合成 3.3病毒粒体的装配与释放 3.4病毒的遗传与变异 3.5病毒的体外重新组与生物活性 4. 植物病毒的传播途径及传毒机制（5学时） 主要讲授病毒的介体传播和非介体传播的两大途径，以及不同介体传播机制与病害发生流行关系，难点：介体持久性传毒（口针传毒）与非持久性传毒（巡回传毒）机理。 4.1介体传毒 4.2非介体传毒 4.3种子与花粉传毒 4.4传毒机制 5. 病毒侵染植物生理效应与抗病免疫（5学时） 主要介绍病原侵染植物的内部症状（内含体）、病毒在植物体内的运转及生理活性物质改变与寄主抗病机理。难点：病毒侵染植物的生理变化与寄主的免疫反应。 5.1病毒侵染植物内部症状（内含体及其类型） 5.2病毒在植物体内的运输
第十一节禽呼肠孤病毒感染
第十一节禽呼肠孤病毒感染 教学目标：掌握禽呼肠孤病毒感染的病原、流行病学、症状、病理变化、诊断和防治 教学重点：禽呼肠孤病毒感染流行病学、症状、病理变化、诊断和防治 教学难点：禽呼肠孤病毒感染的流行病学病源、病理变化与防治 教学方法：讲授讨论 教学手段：多媒体教学 【引入】呼肠孤病毒感染通常为养鸡从业人员熟知的是病毒性关节炎。另外，许多学者证实矮小综合征、呼吸道病综合征、肠道疾病和所谓“吸收不良综合症”等病也与呼肠孤 病毒有关。呼肠孤病毒广泛存在于自然界中，可自消化道和呼吸道分离出来。病毒 无囊膜，对脂溶剂和热有抵抗力，-20°C 可存活 4 年以上，病毒在细胞内复制可 形成包涵体。呼肠孤病毒造成的经济损失通常来源于鸡的跛行（病毒性关节炎、腱 鞘炎）和总体生产性能低下，包括增重减少、饲料转化率低、死淘残鸡增多，因此 降低了生产成绩。 【板书】一、病源 1.病原：属于呼肠孤病毒类。为双股RNA 2.抵抗力：对环境抵抗力强，耐热及PH为3的酸性环境，对过氧化氢的抵搞 力强。 【板书】二、流行病学 1．易感动物鸡和火鸡1日龄的鸡易感染本病 2．发病年龄多发生在3～7周龄的肉鸡，蛋鸡也偶有发生。 3．传染源病鸡、带毒鸡。病毒通过粪便传播。 4．传播途径可垂直传播、也可水平传播 【板书】三、症状 跛行、跗关节肿胀、肌腱增厚或断裂。本病绝大多数呈隐性经过，当发生急性感染时出现跛行，病鸡喜欢坐在跗关节上，驱赶时才会移动。跗关节肿胀不能活动，不敢负重，患肢不能伸张。腱断裂时，趾屈曲，出现典型的蹒跚步态，患肢多向外扭转，且多发育不良，长期不能恢复。呼肠孤病毒除了引起关节炎、腱鞘炎外，还会引起“吸收不良综合症”，病鸡表现为生长发育受阻，矮小，明显小于同一日龄的鸡只，色素沉着障碍，病鸡明显苍白，羽毛发育不良、蓬乱，骨骼系统钙化作用紊乱，骨质疏松，股骨头坏死，有时腺胃肿大，死亡率增加，可达5% 。鸡群患“吸收不良综合症”可导致鸡群均匀度下降，生产性能降低，造成经济损失。 【板书】四、病理变化 患有病毒性关节炎、腱鞘炎的鸡只，病变主要在跗关节，关节上下周围肿胀，切开肿胀部，若单纯感染时，见有少量黄色浆液性或纤维素性渗出液，若有细菌感染时，可见脓性渗出物。趾屈腱和腓肠腱周围水肿，滑膜常有出血点。慢性病程其特点为腱鞘硬化或粘连，失去活动性。组织学变化主要表现为非化脓性腱鞘炎的特征，在滑膜下可见到幼稚性纤维性细胞增生，逐渐纤维化，呈慢性腱鞘炎的病象。腓肠腱和周围的肌纤维呈空泡样变性，肌纤维组织可见到脂肪浸润。如有细菌感染时，则网状细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和腺细胞大量渗出和增生。“吸收障碍综合症”没有特征性的病理变化。 【板书】五、诊断 根据流行病学，特征性症状和典型的病变，即可作出初步诊断。
鸭圆环病毒流行情况及防控
鸭圆环病毒流行情况及防控 水禽病近几年发病特点 近两年的疫病监测数据分析，水禽群（特别是鸭群）出现二重及多重感染的情况十分普遍，病毒+病毒、病毒+细菌、病毒+病毒+细菌等混感模式层出不穷。究其原因，其中一种病原所起的作用至关重要，即鸭圆环病毒。 鸭圆环病毒危害 鸭圆环病毒(DuCV)是圆环病毒科圆环病毒属的新成员，无囊膜，单股环型DNA结构。该病毒于2003年由Hanemann在德国首次报道。在我国，姜世金等(2007)首次从2006年在福建省采集的鸭疫里默氏菌病鸭样品中检测到DuCV。 单纯感染临床表现为发育状况，差生长发育迟缓、体重减轻、羽毛凌乱等临床症状为共同特征，并且明显表现羽毛营养失调，在背部脊柱（的羽毛）尤其明显，许多羽毛羽轴出血，鼻流黏液和脚掌发绀，剖检肝脏、脾脏和肾脏均散布数量不等、大小不一的灰白色坏死灶为主要临床特点。 圆环病毒还侵害畜禽免疫系统，导致宿主抵抗力下降，易遭受其它病原的并发或继发感染，严重降低了疫苗、药物和抗体的效果，大幅度提高了养殖难度。 临床往往是混发感染居多，刘少宁等(2008-2009)对来自山东、江苏、四川、福建和广东5个省份36个鸭群343份组织样品进行检测，发现DuCV检出率高达81.63％，鸭群阳性率达94.44％，5个省份均有DuCV存在；多数与禽流感、鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒、鸭腺病毒4型、鸭细小病毒、鸭疫里默氏杆菌、鸭大肠杆菌等病原混感。对混感鸭群治疗发现，只要混感有DuCV，使用针对其它性病毒的卵黄抗体加对抗生素难以达到良好的治疗效果。 防治 由于目前DuCV在动物细胞和禽胚上难以培养，因此目前尚无商品化疫苗，只能使用圆环抗体，配合其他抗病毒药、免疫增强剂、中药、抗生素等药物进行综合治疗，以降低直接和间接损失。 大东农鸭圆环专用圆弧安 本产品对鸭圆环病毒、新型呼肠孤病毒和鸭巴氏杆菌具有明显的预防和疗效。 临床可用于发病治疗 养殖周期使用，极大减低疾病发生。
雏鸭呼肠孤病毒病
雏鸭呼肠孤病毒病 （即“花肝病”或“白点病”） 雏番鸭呼肠孤病毒病俗叫“花肝病”、“白点病”，是70年代末期以来在福建、广东、广西、江苏和浙江等省、自治区雏番鸭群中相继发生并广为流行的一种以脚软、高发病率、高病死率、肝脾有大量白色坏死点为特征的新的急性传染病，给番鸭养殖业造成了严重的经济损失。病原由福建省农林大学动科学院吴宝成教授首先分离出病毒，鉴定并确认为番鸭呼肠孤病毒(MDRV)。 流行特点 1、自然发生仅见于7-50日龄、最常见于7-35日龄的雏正番鸭和雏半番鸭，较大的正番鸭和半番鸭均不发病。其他鸭种概不感染。 2、本病一年四季都可发生，但多见于炎热、潮湿的季节，而寒冷的冬、春季节则较少发生。发病率高达20%-90%，最高100%；病死率通常10%-70%，严重时高达90%以上，甚至全群覆没。据研究，半番鸭雏的发病率和病死率均比正番鸭低。病正番和半番鸭雏及其痊愈带毒鸭是传染源，通过其病死尸、分泌物特别是排泄物散毒，污染饲料，饮水、垫料、空气和用具等经消化道、呼吸道和脚蹼损伤等水平传染，能否垂直传染尚须进一步研究。 3、鸭舍潮湿、闷热、卫生条件差和饲养密度高等是促进发病，加重病情的因素。 主要症状 潜伏期一般3-11天，病鸭沉郁委顿、乏力、软脚、懒动、多蹲伏或挤堆、嘶叫、少饮、减食或不食，羽毛蓬乱，无光泽、腹泻，排白色或绿色稀粪。病程长短不一，一般2-14天。发病后5-7天是死亡高峰期。两周龄以内病鸭难免一死。耐过病鸭往往生长发育迟缓，成为僵鸭，常无饲养价值。 剖检病变 剖检病鸭可见肝、脾、心肌、肾、腔上囊、腺胃和肠粘膜下层等组织白色坏死点。其中以肝、脾最为明显。肝肿大、质脆、出血、表面及实质布满大量针尖大小的坏死点；脾肿大，暗红色，表面及实质有许多大小不等的灰白色坏死点，有的汇成一片，呈花斑状的外观。肾和胰腺有的也可见到数量不等的白色坏死点。脑水肿，脑膜有点状或斑块状出血。 诊断 根据流行病学、临床症状特点和特征性剖检病变可以做出初诊。在临诊中注意和番鸭疫里氏杆菌病、番鸭细小病菌毒病、番鸭禽霍乱、番鸭副伤寒等有类似症状及病变的番鸭病做区别诊断。 确诊必须依靠采病番鸭雏的肝、脾组织和血清等病科，送有关实验做分离病毒、鉴定以及血清学试验的阳性结果进行确认。 防治方法 1、建立并完善鸭场生物安全措施，到非疫区良种鸭场引雏番鸭苗。平时加强管理、清洁卫生、消毒隔离饲养。按当地疫情免疫程序做好其他疫病免疫接种工作。1-2日龄种接种雏番鸭呼肠孤病毒病灭火活苗0.5ml/羽或弱毒苗（按说明书用量），和1L-2联用：弱毒苗分开稀释，混合注射；灭活苗则分开注射。或于8-10日龄和20日龄注射本病高免卵黄抗体两次，剂量按说明书，可有效地预防本病的发生。 2、发生疫情时，病鸭雏隔离饲养，立即注射高免卵黄抗体+禽白细胞干扰素，剂量均按说明书酌加，先注射同群未见症状雏鸭，后注射病鸭，同时用金刚乙胺和环丙沙星各1克，加水20-49公斤，混饮4-5天，防止细菌性并发或继发感染；0.2%-0.3%过氧乙酸带鸭消毒1天1次，直到疫情彻底扑灭。
病毒的分离鉴定讲课教案
病毒的分离鉴定
病毒的分离与鉴定 要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，则必须满足以下原则： ①从患病者体内分离出病毒； ②在实验动物或寄主细胞中可以培养； ③证明这种培养物具有滤过性； ④在原始宿主或相关种属内能产生同样的病症； ⑤能重新分离出病毒。 1.病毒的分离 1.1标本的处理 1.1.1标本的收集 a)粪便标本：将5g粪便标本和50ml PBS放入盛有20-25颗玻璃小 珠的100ml无菌瓶中，搅拌成悬液，倒出上清，3000×g，4℃离心6min。 b)拭子和生物体液：拭子浸在2-3ml运载培养基中，将棉拭子中的 液体尽量挤出以获得标本，如果液体被污染，应3000×g 4℃离心30min。 c)组织标本：用无菌乳钵或匀浆器研磨组织标本，同时加入足量的 PBS制备成20%的悬液，3000×g 4℃离心30min。 1.1.2 除菌处理 a)粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫升，置4℃过夜。 b)鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/毫升，置4℃作用
4小时。 c)对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠孤病毒、腺病 毒、痘病毒等，则可加入等量的乙醚4℃过夜除菌。 1.2病毒的分离培养 病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏感动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种）或离体细胞进行分离培养（细胞培养）。 1.2.1 鸡胚接种 a)鸡卵的选择：一般都选新鲜、10天以内的受精卵以保证规格质 量上的一致。 b)孵育：孵育时可将鸡卵放入卵箱内进行,气室向上，孵育的最适 温度为38--39℃，相对湿度为40—70％，孵育8日后，鸡卵应每天翻动1—2次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。 c)检卵：鸡卵孵育4～5天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况 （二天一次）。①未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。 ②活鸡卵：鸡胚发育4天后，在检卵器上就可见到清晰的血管， 鸡卵内有一小黑点（鸡胚），有明显的自然转动。③死胎：如果发现鸡卵血管模糊、扩张、胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。鸡胚孵育完毕后，用铅笔划出气室边缘和胚胎的位置待用。 d)接种：
病毒的分离鉴定
病毒的分离鉴定 Prepared on 22 November 2020
病毒的分离与鉴定 要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，则必须满足以下原则： ①从患病者体内分离出病毒； ②在实验动物或寄主细胞中可以培养； ③证明这种培养物具有滤过性； ④在原始宿主或相关种属内能产生同样的病症； ⑤能重新分离出病毒。 1.病毒的分离 1.1标本的处理 标本的收集 a)粪便标本：将5g粪便标本和50mlPBS放入盛有20-25颗玻璃小 珠的100ml无菌瓶中，搅拌成悬液，倒出上清，3000×g，4℃离心6min。 b)拭子和生物体液：拭子浸在2-3ml运载培养基中，将棉拭子中的 液体尽量挤出以获得标本，如果液体被污染，应3000×g4℃离心30min。 c)组织标本：用无菌乳钵或匀浆器研磨组织标本，同时加入足量的 PBS制备成20%的悬液，3000×g4℃离心30min。 除菌处理 a)粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫升，置4℃过夜。
b)鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/毫升，置4℃作用 4小时。 c)对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠孤病毒、腺病 毒、痘病毒等，则可加入等量的乙醚4℃过夜除菌。 1.2病毒的分离培养 病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏感动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种）或离体细胞进行分离培养（细胞培养）。 鸡胚接种 a)鸡卵的选择：一般都选新鲜、10天以内的受精卵以保证规格质 量上的一致。 b)孵育：孵育时可将鸡卵放入卵箱内进行,气室向上，孵育的最适 温度为38--39℃，相对湿度为40—70％，孵育8日后，鸡卵应每天翻动1—2次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。 c)检卵：鸡卵孵育4～5天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况 （二天一次）。①未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。 ②活鸡卵：鸡胚发育4天后，在检卵器上就可见到清晰的血管， 鸡卵内有一小黑点（鸡胚），有明显的自然转动。③死胎：如果发现鸡卵血管模糊、扩张、胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。鸡胚孵育完毕后，用铅笔划出气室边缘和胚胎的位置待用。 d)接种：
鸭长舌病的病因探讨及防控措施
鸭长舌病的病因探讨及防控措施 鸭长舌病也称为鸭鹅大舌头病，是由多种原因引起的一种以鸭鹅舌头长，上下喙短，舌头被长长的露在喙的外面为特征的一种疾病。由于鸭鹅的舌头被长长的伸出并露在喙（嘴）的外面，使鸭鹅无法采食及饮水，鸭鹅常常因无法进食而死亡。也就是一般常说的“吊死鬼”，发病较轻的鸭只也常因舌头外漏而影响卖相，造成不收这类鸭只或扣除斤称，出栏时屠宰场每只扣2-3元，而使养鸭户蒙受极大的经济损失。 1、发病原因： 本病的发病原因较为复杂。由于本病自2014年以来才较多的表现出来，而且自2014年下半年以来发病率越来越高，发病的地区范围也逐步在扩大，己蔓延到了很多地区。给养殖户造成的损失也越来越大，所以，目前已引起行业的逐步关注。2015年3月以来,山东农业大学动物科技学院、中国农业大学动物医学院/农业部人畜共患病重点开放实验室从不同地区5个发病肉鸭群采集130余份样品,取5份样品进行病原的分离。细菌培养结果均为阴性(4株大肠杆菌从肝脏常规分离);获得5份鸭胚培养物。该培养物不能凝集鸡红细胞。对5株分离株株进行PCR检测,结果显示鸭瘟病毒、坦布苏病毒、鸭甲肝病毒、鸭星状病毒、鸭呼肠孤病毒、鸭圆环病毒、鹅多瘤病毒、鹅腺病毒、禽网状内皮组织增生征病毒等均为阴性,鹅细小病毒呈阳性。采用基于鹅细小病毒VP3基因的PCR方法对74份样品(肝脏和泄殖腔棉拭子)进行检测,阳性率为100%。该分离株661bp的VP3核苷酸序列与鹅细小病毒和番鸭细小病毒进行分析,结果显示该分离株与鹅细小病毒82-0321v株和SHM319株亲缘关系最近,核苷酸同源性分别为98.8%和98.3%;与番鸭细小病毒同源性较低,在77.6%~78.8%之间。用鸭胚分离的SDLC01株感染1日龄雏鸭能引起鸭上、下喙萎缩、舌头外伸等症状。上述结果表明,从BADS患鸭体内分离得到鸭细小病毒(duck parvovirus,DPV),其可能与BADS具有相关性。经专家团队综合调研和实验室检测发现，本病是以鸭细小病毒引起的一种脚软、骨脆、嘴短、舌长为主要症状的急性传染病。该病毒为单链DNA病毒，能在胚胎中繁殖，对蛋白酶、酸和热等灭活因子有很强的抵抗力，但对紫外线照射敏感。病鸭通过排泄物，特别是粪便排出大量病毒而形成水平传播和垂直传播。 2、流行特点 本病主要侵害消化系统，破坏肠黏膜和肠道菌群，使饲料内营养不能正常吸收，引起体内钙、锰和维生素等营养元素缺乏，进而影响骨组织发育，出现肉鸭嘴短舌长，站立不稳，不长个，腿和翅膀的长骨易断等症状。 （1）流行范围逐步扩大 本病于2000年时在我国南方及东南地区个别地区零散发生过，2014年以来包括北方等全国各地均有发生，但在肉鸭养殖比较密集的山东、江苏、辽宁、安徽、广东、江西、四川、浙江、湖南、湖北、河南等地发生率较高。 （2）呈现类似的传染性 本病具有明显的区域性和群体发病，本病鸭鹅均有发生，尤以商品肉鸭的发病率最高。呈地区集中散发型，一个地区只要出现一家发病，就会慢慢向周边扩散。本病死亡率较低，多因无法饮水及采食而死亡。 （3）发病率逐渐提高 刚开始发病率一般为0.1%-0.5%左右，也就是饲养6000只商品肉鸭中发现有20只左右的长舌患鸭。自2014年以来，群体发病率一般在5%左右，以万只为例有的棚发现500-700只，有的少100-300只左右，少的发病率在2%左右，发病率高的鸭群能够达到20-30%。（4）发病日龄逐步拓展 本病刚开始以20日龄后至40日龄左右的鸭只出现发病情况，目前多发生于10-25日龄
病毒的分离与鉴定
病毒的分离与鉴定 （一）病毒的分离病毒分离的一般程序是：检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状鸡胚→病变或死亡细胞培养→细胞病变→鉴定病毒种型(血清学方法)无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离… （一）病毒的分离 病毒分离的一般程序是： 检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状 鸡胚→病变或死亡 细胞培养→细胞病变 →鉴定病毒种型(血清学方法) 无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离心后，取上清接种；咽洗液、粪便、尿、感染组织或昆虫等污染标本在接种前先用抗生素处理，杀死杂菌。 1．细胞培养用分散的活细胞培养称细胞培养（Cell culture）。所用培养液是含血清（通常为胎牛血清）、葡萄糖、氨基酸、维生素的平衡溶液，pH7.2～7.4。细胞培养适于绝大多数病毒生长，是病毒实验室的常规技术。 原代细胞培养(Primary cell culture) 用胰蛋白酶将人胚（或动物）组织分散成单细胞，加一定培养液，37℃孵育1-2天后逐渐在培养瓶底部长成单层细胞，如人胚肾细胞、兔肾细胞。原代细胞均为二倍体细胞，可用于产生病毒疫苗，如兔肾细胞生产风疹疫苗，鸡成纤维细胞产生麻疹疫苗，猴肾细胞生产脊液灰质炎疫苗。因原代细胞不能持续传代培养，故不便用于诊断工作。 二倍体细胞培养(Diploid cell cultune) 原代细胞只能传2-3代细胞就退化，在多数细胞退化时，少数细胞能继续传下来，且保持染色体数为二倍体，称为二倍体细胞。二倍体细
犬细小病毒的分离与鉴定
犬细小病毒的分离与鉴定 摘要：采用细胞培养法对疑似犬细小病毒的粪便和内脏进行了分离和鉴定，并对分离到的病毒进行生物学特性鉴定和动物回归试验。结果共分离到3株CPV，分离株在猫肾细胞F81产生明显细胞病变，血凝效价达1∶27～1∶210，细胞病变能被犬细小病毒阳性血清所抑制，接种幼犬后，分离株3可以引起试验犬发病死亡。 关键词：犬细小病毒；分离；鉴定 犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）属于细小病毒科细小病毒属，为单股、负义、线形无囊膜的DNA病毒[1]。CPV可引起犬的出血性肠胃炎和心肌炎，并使白细胞大量减少，在幼犬中的发病率和死亡率都很高[2]。CPV对多种理化因素和常用消毒剂具有较强的抵抗力，在4～10 ℃存活6个月，37 ℃存活2周，56 ℃存活24 h，80 ℃存活15 min，在粪便中可存活数月至数年[3]；该病毒对乙醚，氯仿和醇类有抵抗力[4]。CPV一年四季均可发病，以冬、春多发[5]，饲养管理条件骤变、长途运输、寒冷、拥挤均可促使该病发生[6]。病犬是主要传染源，其呕吐物、唾液、粪便中均有大量病毒[7]。根据临床症状和血清学反应，可做出准确诊断[8-13]。本研究通过对山东毒株分离，并对其部分生物学特性进行研究，为该病的防治和后续研究提供一定的理论基础。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要试剂DMEM培养基为Gibco产品；小牛血清、谷氨酸胺、双抗、胰蛋白酶等购自大连宝生物TaKaRa有限公司；其他化学试剂均为分析纯试剂。 1.1.2 病料病料为2009～2011年聊城大学兽医院收集或其他养犬场送检的可疑CPV病料，包括20份粪便样品和10份脏器。 1.1.3 试验动物和细胞8只40～50日龄的山东细犬幼犬（抗CPV HI抗体效价小于1∶4），健康状况良好；猫肾传代细胞系（F81）和犬肾传代细胞系（MDCK）等由聊城大学农学院实验室保存。 1.2 方法 1.2.1 试剂的配制 1）1%猪红细胞悬液的制备。用20 mL注射器内吸入阿氏液3～5 mL，于健康猪前腔静脉采血10～15 mL，立即混匀，4 ℃保存备用。使用时用PBS洗涤保存的猪红细胞，1 000 r/min离心5 min，洗涤3次，取红细胞泥1 mL加稀释液100 mL，再加入小牛血清白蛋白0.1 g，即为1%猪红细胞悬液。 2）HA抗原配制。用移液器向V型血凝板每孔加稀释液25 μL，然后吸取25 μL经福尔马林灭活的CPV细胞培养物，在血凝板上倍比稀释，最后1孔不稀释，作为阴性对照；接着每孔加稀释液25 μL和1%猪红细胞悬液50 μL，于振荡器上振荡1 min混匀，于4 ℃冰箱静置1～2 h，待红细胞完全沉淀后判定。判定的方法是以50%红细胞凝集为终点，在对照孔红细胞完全不凝集，呈圆形小点
病毒的分离鉴定
病毒的分离与鉴定 要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，则必须满足以下原则： ①从患病者体分离出病毒； ②在实验动物或寄主细胞中可以培养； ③证明这种培养物具有滤过性； ④在原始宿主或相关种属能产生同样的病症； ⑤能重新分离出病毒。 1.病毒的分离 1.1标本的处理 1.1.1标本的收集 a)粪便标本：将5g粪便标本和50ml PBS放入盛有20-25颗玻璃小 珠的100ml无菌瓶中，搅拌成悬液，倒出上清，3000×g，4℃离心6min。 b)拭子和生物体液：拭子浸在2-3ml运载培养基中，将棉拭子中的 液体尽量挤出以获得标本，如果液体被污染，应3000×g 4℃离心30min。 c)组织标本：用无菌乳钵或匀浆器研磨组织标本，同时加入足量的 PBS制备成20%的悬液，3000×g 4℃离心30min。 1.1.2 除菌处理 a)粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫升，置4℃过夜。 b)鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/毫升，置4℃作用4 小时。
c) 对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、 痘病毒等，则可加入等量的乙醚4℃过夜除菌。 1.2 病毒的分离培养 病毒是严格的细胞寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏感动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种）或离体细胞进行分离培养（细胞培养）。 1.2.1 鸡胚接种 a) 鸡卵的选择：一般都选新鲜、10天以的受精卵以保证规格质量上 的一致 。 b) 孵育：孵育时可将鸡卵放入卵箱进行,气室向上，孵育的最适温度 为38--39℃，相对湿度为40—70％，孵育8日后，鸡卵应每天翻动1—2次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。 c) 检卵：鸡卵孵育4～5天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况（二 天一次）。①未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。②活鸡卵：鸡胚发育4天后，在检卵器上就可见到清晰的血管，鸡卵有一小黑点（鸡胚），有明显的自然转动。③死胎：如果发现鸡卵血管模糊、扩、胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。鸡胚孵育完毕后，用铅笔划出气室边缘和胚胎的位置待用。 d) 接种：
小鼠呼肠孤病毒3型RV3试剂盒使用方法
小鼠呼肠孤病毒3型(RV3)试剂盒使用方法 检测范围： 96T 4ng/mL -120ng/mL 使用目的： 本试剂盒用于测定小鼠血清、血浆及相关液体样本中呼肠孤病毒3型(RV3)表达。 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中小鼠呼肠孤病毒3型(RV3)表达。用纯化的小鼠呼肠孤病毒3型(RV3)抗体包被微孔板，制成固相抗体，可与样品中呼肠孤病毒3型(RV3)相结合，经洗涤除去未结合的抗原和其他成分后再与HRP标记的呼肠孤病毒3型(RV3)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD 值），与CUTOFF值相比较，从而判定标本中小鼠呼肠孤病毒3型(RV3)的存在与否。 标本要求 1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融 2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤 1.编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照2孔、阳性对照2孔、空白对照1 孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同） 2.加样：分别在阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照50μl。然后在待测样品孔先 加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀， 3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用 5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此 重复5次，拍干。
病毒分离鉴定技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪的一种繁殖障碍与呼吸困难的传染病。其特征为发病母猪厌食、发热，怀孕后期发生流产、死胎和木乃伊胎，幼龄仔猪发生呼吸道症状[1]。1987年在美国中西部首先发现该病，并分离到病毒，其后在北美、欧洲、亚洲等国家流行。目前该病已在全球范围内传播、蔓延。我国郭宝清等[4]于1996年首次从暴发流产的胎儿中分离到PRRSV。国内诸多血清学检测结果表明，该病在我国许多地方已有流行[5]。河南某猪场"猪场发生临床症状疑似PRRS的传染病，用间接ELISA法检测，呈PRRS 抗体阳性。从病猪肺、淋巴结病料中分离到1株疑似PRRSV，并对其进行了一系列的鉴定。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1病料采自河南某猪场疑似PRRS发病仔猪肺脏及淋巴结。 1.1.2细胞及血清细胞系Marc145、Vero、PK15均购自中国兽药监察所；阳性血清购自中国兽药监察所；阴性血清采自无PRRS病史猪场的新生仔猪血清，经中和试验证明为阴性。 1.1.3主要试剂及试剂盒RNasin、dNTP、反转录 Buffer、MMLV、rTaq酶均购自宝生物(大连)工程有限公司；琼脂糖为 Sigma公司产品；其他常规试剂均为分析纯；UNIQ10柱式Trizol 总RNA抽提纯化试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
1.1.4RTPCR引物设计根据GenBank公布的PRRSV美洲株ORF5核苷酸序列，参照文献[6]自行设计并由宝生物(大连)工程有限公司合成下述一对引物，引物扩增片段长度为720bp；上游引物P1 5′CTG GAG CCG TGC TAT CAT3′；下游引物P2 5′TCC ATT TCA TGA CAC CTG3′。 1.2方法 1.2.1细胞培养生长液为含100 mL/L新生牛血清(NCS)的RPMIl640培养液；维持液为含20 mL/L NCS的RPMIl640培养液。Marc145、Vero和PK15细胞均在体积分数为5%的CO2培养箱中于37 ℃培养至单层后传代培养。 1.2.2病料的处理无菌采集发病仔猪的淋巴结、肺脏、脾脏等组织并剪碎，用Hanks液研磨并制成5倍～10倍的乳悬液，反复冻融3次后，经5 000 r/min离心30 min，上清悬液用0.22μm微孔滤膜过滤后，－20 ℃保存备用。 1.2.3病毒的分离将上述处理的病料悬液1 mL分别接种于长成单层的 Marc145细胞、Vero细胞和PK15细胞，37 ℃吸附1 h，补加维持液至8 mL，继续培养3 d～5 d，反复冻融3次，收获培养上清液，同时设参考毒株、正常细胞作为对照。出现典型PRRSV细胞病变时按上述方法继续传代，供进一步检测备用，连传5代未出现CPE者判为阴性。
病毒的分离与测定
第二十九讲病毒的分离与测定 教学目的：掌握病毒效价的测定方法 教学重点：噬斑法、终点法 教学难点：病毒的分离与鉴定 课时分布：1学时 教学过程： 一、病毒的分离与纯化 1、病毒的分离 病毒的分离是将疑有病毒的样品经处理后，接种于敏感的宿主，经培育后，通过检查其特异性病理表现或其它方法以肯定病毒的存在。 （1）标本的采集与处理标本应含有足够量的活病毒；加入抗菌素除细菌；研磨或超声波处理破碎细胞，让病毒充分释放出来；标本处理后立即接种，否则冷冻保藏。 （2）标本接种与感染表现接种实验宿主（动植物、细菌）、鸡胚或细胞（要求：操作简单、易于培养、产生的感染结果易判定）。噬菌体以噬菌斑为标记；动物病毒产生致细胞病变效应；植物病毒致敏感质感植物出现坏死斑或枯斑。 2、病毒纯化 通过分离得到的是病毒感染的宿主机体、组织或破细胞后的抽提物，或感染的宿主的体液、血液和分泌物，或培养液，须将杂质成分除去。 （1）病毒纯化的标准：纯化的病毒制备物应保持其感染性；纯化的病毒毒粒应具有均一性。 （2）病毒纯化的方法毒粒的主要成分是蛋白质，故可利用蛋白质提纯方法纯化；毒粒具一定的大小、形状和密度，可离心提取。 二、病毒的测定 在谷氨酸、抗菌素、酶制剂等生产中，经常出现不正常的发酵现象。发酵缓慢、发酵液含菌数下降、菌体畸形、耗糖缓慢或停止，镜检时发现有云雾状碎片，严重时以致倒罐。
1、病毒的物理颗粒计数 （1）电镜下直接计数 （2）血细胞凝集试验许多有包膜的动物病毒能在一定条件下凝集一定种类的脊椎动物红血球，凝集量与病毒浓度成正比。 此外，可根据病毒的抗原性质，与抗体发生特异性结合，利用分光光度计对病毒进行定量。但灵敏度较低，多在特殊情况下使用。总之，该方法测得的是有活力与无活力病毒数量的总和。 2、病毒的感染性测定 测定的是因感染所引起宿主或细胞发生某一特异性病理反应的病毒数量。 病毒感染单位：能引起宿主或宿主细胞一定特异性反应的病毒最小剂量。 病毒效价：指单位体积病毒悬液的感染单位数目。 （1）噬菌斑的测定 噬菌斑：噬菌体感染敏感细胞后，通过复制使宿主细胞裂解，释放大量噬菌体，扩散到周围的细胞中，继续侵染，从而在有噬菌体的地方形成一个透亮无菌近似圆形的空斑。它是phage存在的一种指示性指标。 在液体培养基中培养物变清。一个phage产生一个噬菌斑，故可根据在固培上形成的噬菌斑数测得phage的效价。通常是将噬菌体悬液分别与高浓度的敏感细菌以及半固体琼脂均匀混合后涂布在较高浓度的营养琼脂上，培养后计算噬菌斑数便可算出噬菌体效价。 ①双层平板法 底层培养基10ml 上层培养基4ml、凝固 指示菌0.2 ml、检样0.1 ml →32℃16-24h 测定前，事先配制含2%和1%的琼脂底层培养基和上层培养基，将铺成平板，用无菌吸管吸取一定量的指示菌和被测样品与上层培养基混合，冷到45℃迅速倒在底层平板上铺平，凝固后恒温培养16—20小时，如有phage存在，则在双层琼
病毒的分离鉴定
病毒的分离鉴定 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT
病毒的分离与鉴定 要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，则必须满足以下原则： ①从患病者体内分离出病毒； ②在实验动物或寄主细胞中可以培养； ③证明这种培养物具有滤过性； ④在原始宿主或相关种属内能产生同样的病症； ⑤能重新分离出病毒。 1.病毒的分离 1.1标本的处理 标本的收集 a)粪便标本：将5g粪便标本和50mlPBS放入盛有20-25颗玻璃小 珠的100ml无菌瓶中，搅拌成悬液，倒出上清，3000×g，4℃离心6min。 b)拭子和生物体液：拭子浸在2-3ml运载培养基中，将棉拭子中的 液体尽量挤出以获得标本，如果液体被污染，应3000×g4℃离心30min。 c)组织标本：用无菌乳钵或匀浆器研磨组织标本，同时加入足量的 PBS制备成20%的悬液，3000×g4℃离心30min。 除菌处理 a)粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫升，置4℃过夜。
b)鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/毫升，置4℃作用 4小时。 c)对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠孤病毒、腺病 毒、痘病毒等，则可加入等量的乙醚4℃过夜除菌。 1.2病毒的分离培养 病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。根据病毒的不同选用敏感动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种）或离体细胞进行分离培养（细胞培养）。 鸡胚接种 a)鸡卵的选择：一般都选新鲜、10天以内的受精卵以保证规格质 量上的一致。 b)孵育：孵育时可将鸡卵放入卵箱内进行,气室向上，孵育的最适 温度为38--39℃，相对湿度为40—70％，孵育8日后，鸡卵应每天翻动1—2次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。 c)检卵：鸡卵孵育4～5天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况 （二天一次）。①未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。 ②活鸡卵：鸡胚发育4天后，在检卵器上就可见到清晰的血管， 鸡卵内有一小黑点（鸡胚），有明显的自然转动。③死胎：如果发现鸡卵血管模糊、扩张、胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。鸡胚孵育完毕后，用铅笔划出气室边缘和胚胎的位置待用。 d)接种：
病毒的分离与鉴定
（一）病毒的分离病毒分离的一般程序是：检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状鸡胚→病变或死亡细胞培养→细胞病变→鉴定病毒种型(血清学方法)无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离… （一）病毒的分离 病毒分离的一般程序是： 检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状 鸡胚→病变或死亡 细胞培养→细胞病变 →鉴定病毒种型(血清学方 法) 无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离心后，取上清接种；咽洗液、粪便、尿、感染组织或昆虫等污染标本在接种前先用抗生素处理，杀死杂菌。 1．细胞培养用分散的活细胞培养称细胞培养（Cell culture）。所用培养液是含血清（通常为胎牛血清）、葡萄糖、氨基酸、维生素的平衡溶液，～。细胞培养适于绝大多数病毒生长，是病毒实验室的常规技术。 原代细胞培养(Primary cell culture) 用胰蛋白酶将人胚（或动物）组织分散成单细胞，加一定培养液，37℃孵育1-2天后逐渐在培养瓶底部长成单层细胞，如人胚肾细胞、兔肾细胞。原代细胞均为二倍体细胞，可用于产生病毒疫苗，如兔肾细胞生产风疹疫苗，鸡成纤维细胞产生麻疹疫苗，猴肾细胞生产脊液灰质炎疫苗。因原代细胞不能持续传代培养，故不便用于诊断工作。 二倍体细胞培养(Diploid cell cultune) 原代细胞只能传2-3代细胞就退化，在多数细胞退化时，少数细胞能继续传下来，且保持染色体数为二倍体，称为二倍体细胞。二倍体细胞生长迅速，并可传50代保持二倍体特征，通常是胚胎组织的成纤维细胞（如WI-38细胞系）。二倍体细胞一经建立，应尽早将细胞悬浮于10%二甲基亚砜中，大量分装安瓿贮存于液氮（-196℃ ）内，做为“种子”，供以后传代用。目前多用二倍体细胞系制备病毒疫苗，也用于病毒的实验室诊断工作。 传代细胞培养 (Continous cell culture) 通常是由癌细胞或二倍体细胞突变而来（如