下呼吸道感染细菌学检验操作规范
下呼吸道感染细菌学检验操作规范
临床通常将正常人喉以上部位称之为上呼吸道，上呼吸道定植有大量的正常菌群，而气管以下包括气管、支气管和肺泡称下呼吸道，通常无菌。下呼吸道感染包括急性气管-支气管炎、慢性支气管炎急性发作、支气管扩张继发感染及肺实质感染（肺炎、肺脓肿）等。病原体有细菌、病毒、衣原体、支原体、真菌、立克次体和原虫等。
社区获得性肺炎常见的病原菌有肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、卡他莫拉菌、肺炎克雷伯菌、军团菌、肺炎支原体和肺炎衣原体等。医院获得性肺炎常见的病原有铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌和假丝酵母菌等。
下呼吸道感染患者可有发热、咳嗽和咳痰，痰呈脓性、粘稠或血性，可伴有胸痛、气急，肺部闻及湿罗音、白细胞总数及嗜中性粒细胞比例明显增高，X线检查提示肺部有炎症性浸润或胸腔积液等体症，严重时可导致感染性休克和呼吸衰竭，因此临床诊断一般不难；细菌学检验能明确感染病原及药敏结果，有助于疾病治疗、流行病学调查和医院感染的监测。临床呼吸道标本中常见的分离细菌见表1。
表1呼吸道标本中常见分离菌
革兰阳性菌革兰阴性菌
草绿色链球菌、肺炎链球菌、韦荣球菌
化脓性链球菌脑膜炎奈瑟菌、其他奈瑟菌
表皮葡萄球菌、金黄色葡萄卡他莫拉菌
球菌、其他葡萄球菌肺炎克雷伯菌及其他克雷伯菌
微球菌、消化链球菌、消化沙雷菌、变形杆菌
球菌、肠球菌大肠埃希菌及其他肠杆菌科细菌
真杆菌、丙酸杆菌、乳酸杆菌百日咳鲍特菌、不动杆菌
放线菌、奴卡菌、结核分枝杆菌铜绿假单胞菌及其他假单胞菌属
白喉棒状杆菌、类白喉棒状杆菌细菌、嗜肺军团菌、气单胞菌、流
假丝酵母菌感嗜血杆菌、付流杆嗜血杆菌、梭杆菌
一、送检指征
痰液标本是临床微生物学检验最常见的的标本，但不是下呼吸道感染的最佳标本。
1.咳嗽咳嗽咳痰是下呼吸道感染最常见的症状，咳嗽的性质与痰的性状如脓或铁锈样痰具有鉴别诊断意义。
2.咯血喉以下的呼吸道出血为咯血，包括泡沫血痰、鲜血和痰中带血等。
3.呼吸困难呼吸急促或哮喘，常伴有胸痛。
4.发热伴白细胞增高尤其是中性粒细胞或CRP明显增高。
5.胸部影像学检查提示有感染可能。
二、标本采集与验收
对可疑烈性呼吸道传染病（如SARS、肺炭疽、肺鼠疫等）的患者采集检验标本时必须注意生物安全防护。
（一）标本采集方法
1.自然咳痰法以晨痰为佳，采集标本前应用清水、冷开岁漱口或用牙刷清洁口腔和牙齿，有假牙者应取下假牙。尽可能在用抗菌药物之前采集标本。用力咳出呼吸道深部的痰，痰液直接吐入无菌、清洁、干燥、不渗漏、不吸水的广口带盖的容器中，标本量应≥1ml。咳痰困难者可用雾化吸入加温至45°C的100g/L NaCl水溶液，使痰液易于排出。对难于自然咳
痰患者可用物菌吸痰管抽取气管深部分泌物。标本应尽快送检，不能及时送检的标本，室温保存≤2h。
2.支气管镜采集法、防污染毛刷采集法、环甲膜穿刺经气管吸引法、经胸壁针穿刺吸引法和支气管肺泡灌洗法，均由临床医生按相应操作规程采集，但必须注意采集标本时尽可能避免咽喉部正常菌群的污染。
3.小儿取痰法用弯压舌板向后压舌，将拭子伸入咽部，小儿经压舌刺激咳痰时，可喷出肺部或气管分泌物粘在拭子上送检。幼儿还可用手指轻叩胸骨柄上方，以诱发咳痰。
（二）标本验收与拒收
遇有不合格标本用及时与临床联系，反馈不合格标本拒收的具体理由。
下呼吸道细菌学检验标本验收与拒收见下：
1.呼吸道有大量的正常菌群存在，咽拭子、咳痰、吸出的分泌物厌氧菌培养无意义。
2.申请单填写应完整无误。标本标识必须唯一，并与申请单相符，未标采集时间、部位或检验要求等拒收。
3.痰标本呈水样或唾液样，拒收。
4.涂片白细胞和鳞状上皮细胞计数：白细胞＜10／低倍镜和鳞状上皮细胞＞25／低倍镜，表示该标本已污染正常菌群，建议重送标本。
5.标本容器必需符合规定，溢漏、无盖者拒收。
6.送检时间超过2h拒收。
7.同时同部位或同一天两份相同检测的标本，应与申请医生协商处理。
三、实验室检查
（一）肉眼观察观察痰液的颜色、粘度、有无血丝和是否呈脓性，如见有颗粒存在，则应注意可能与放线菌属及奴卡菌属感染有关。
（二）显微镜检查下呼吸道细菌学检验的标本均需涂片革兰染色进行常规的白细胞和鳞状上皮细胞显微镜下计数和细菌学检查，其目的是判别送检的标本是否合适做细菌培养，并初步判定有否病原菌、病原菌的数量及其类别，有助于初步报告、选择培养基和对培养结果的综合分析。
推荐判别标本合格的标准见表2。
表2 下呼吸道细菌学检验标本涂片显微镜白细胞和
鳞状上皮细胞计数判断标准
分类
细胞数／低倍镜
结果判断白细胞鳞状上皮细胞
A>25<10合格可用于细菌培养
B>2510~25尚合格可用于细菌培养
C<10>25不合格，重送标本
近年来推荐判别标本合格的简单方法是痰标本涂片镜检＞10个白细胞／低倍镜，就可判断是基本合格并可用于细菌培养的标本，尤其是白细胞减少的患者。
油镜下观察细菌形态、排列和染色特性，可初步推定菌属（或种），涂片中所见细菌的量及吞噬细胞内是否有细菌等，如发现酵母样菌孢子、菌丝或放线菌、奴卡菌等，应予相应报告和继续检查。
（三）分离培养
痰标本培养前处理不含或含粘液很少的合格标本，可直接接种，遇有含大量粘液的标本，应加入等量的液化剂（如pH7.6的10g/L胰酶溶液等），放置35°C待充分液化再行接种。也
可加液化剂后用旋转混匀器搅拌混匀，3000r/min离心10min，弃去上清液，取沉淀物接种。一般细菌培养
(1)一般细菌培养应同时划区接种：
1)血平板适用于分离肺炎链球菌和其他细菌。
2)加抗生素的巧克力平板适用于分离嗜血杆菌。
3)麦康凯／中国蓝平板适用于分离革兰阴性杆菌。
(2)分离培养血平板和巧克力平板需置5%CO2环境，麦康凯平板／中国蓝平板，35°C需氧孵育。
(3)挑取可疑菌落进行细菌鉴定和药敏试验，痰及下呼吸道分泌物标本易受到上呼吸道正常菌群的污染，临床微生物实验室通常可从送检的呼吸道标本中分离出多种细菌，但分离的细菌是否能真正代表下呼吸道感染的病原菌，这对临床诊断和治疗感染性疾病至关重要。实验室人员在检验过程中应重视判断所分离的细菌是污染的上呼吸道正常菌群还是引起下呼吸道感染的病原菌。在实际工作中，有时也由于细菌生长速度不一，如肺炎链球菌可能被生长速度快的细菌（包括正常军群）菌落掩盖，不仔细观察就会漏检。
当在同一培养基上分离出多种病原菌时，应主动与临床医生联系，结合患者的临床症状、痰涂片染色镜检及近期细菌培养结果（如近期同一病人多次分离培养出同一种菌）等综合判断所分离的多种细菌中哪一种菌可能为优势病原菌。当分离的优势菌与涂片染色镜检结果相符时，优势菌必需进行药敏试验。若分离培养结果与涂片染色镜检结果不相符时，或少量生长优势可疑病原菌时，也需做药敏试验，但在报告中提示，此结果请结合临床和涂片所见进行分析。痰及下呼吸道分泌物标本检验流程见下图。
四、结果报告
（一）下呼吸道标本细菌学检验结果报告由于检验结果报告的时效性，下呼吸道标本细菌学检验结果分为初步报告和最终报告。
1.初步报告应包括标本涂片革兰染色白细胞和鳞状上皮细胞计数、细菌学镜检的描述性报告（发现有诊断价值时应及时向临床口头报告，并作相关记录）。
1)涂片革兰染色白细胞和鳞状上皮细胞计数、细菌学镜检的描述性报告
细菌学镜检的描述性报告：如镜检见到排列成葡萄状的革兰阳性球菌，可报告“找到革兰阳性球菌，形似葡萄球菌”；如见到瓜子仁形成矛头状端相背，成双排列，具有明显荚膜的革兰阳性球菌时，可报告“找到革兰阳性球菌，形似肺炎链球菌”；如见到不易识别的细菌时则报告“找到革兰＃性＃形细菌”；如发现其他有意义病原微生物存在时，应主动描述性报告观察结果，并与临床联系和追踪进一步检查。
2) 白细胞和鳞状上皮细胞计数的描述性报告：包括白细胞和鳞状上皮细胞数／低倍、细胞内是否含有细菌和胞内细菌染色及形态学特点。
2.最终结果报告应包括送检标本肉眼观察的结果、涂片革兰染色白细胞和鳞状上皮细胞计数、细菌学镜检的描述性报告、分离致病菌的鉴定结果、药敏试验结果。
1)痰标本涂片革兰染色后白细胞和鳞状上皮细胞计数、细菌学镜检未发现有临床诊断意义结果（可不用初步报告），细菌分离培养为正常菌群时，最终检验结果应报告“正常菌群生长”。若无菌生长应报告“经48h培养无细菌生长”。有意义的培养基（巧克力平板、血平板），再置2天仍无可疑病原菌生长时可将其弃之；但对偶然分离的“优势可疑病原菌”，还需做药敏试验，并及时与临床联系，最终检验报告应包括标本肉眼观察结果、涂片革兰染色白细胞和鳞状上皮细胞计数及细菌学镜检的描述性报告、细菌鉴定的规范细菌名称和药敏试验结果。但应提示所报告的结果请结合临床进行分析。
2)标本涂片革兰染色白细胞和鳞状上皮细胞计数、细菌学镜检发现有诊断价值时，细菌分离培养检出优势菌，并与涂片染色镜检结果相符时，除及时初步报告外，最终检验结果应报告
肉眼观察的结果、涂片革兰染色白细胞和鳞状上皮细胞计数、细菌学镜检的描述性报告、优势菌鉴定的规范细菌名称和药敏试验结果等；细菌分离培养未检出优势菌，通常提示可能厌氧菌感染、大量应用抗菌药物、培养基及培养方法或送检标本保存和运送不当等原因。
痰及下呼吸道标本细菌学检验操作流程
痰及下呼吸道分泌物标本
肉眼观察及涂片革兰染色白细胞、鳞状上皮细胞和细菌学显微镜检查
初步报告不合格标本
拒收及建议重新血平板巧克力平板麦康凯平板采集合格标本（
菌落观察，涂片染色镜检
结合涂片白细胞、鳞状上皮细胞计数和细菌学镜检结果与培养结果综合分析
结果报告（最终报告）