工作报告之细胞传代培养实验报告

细胞传代培养实验报告

【篇一:细胞传代培养实验报告】

细胞传代培养

一.实验目的

初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程,为生物技术在医学上的

应用打下基础。

二、原理

从生物体中取出某种组织或细胞,模拟体内生理条件,在人工培养条件下使其生存、生

长、繁殖或传代,这一过程称为细胞培养。细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接观察

活细胞,并在有控制的环境条件下进行实验,避免了体内实验时的许多复杂因素,还可以与

体内实验互为补充,可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象,耗费少,比较经济,

因此成为生物学研究的重要手段。

细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为

原代培养;当原代培养的细胞增殖达到一定密度后,则需要做再培养,即将培养的细胞分散

后,从一个容器以1:2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养,为传代培养,传

代培养的累积次数就是细胞的代数。

细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。所有离体细胞的生长都受

温度、渗透压、ph值、无机盐影响,消毒、配液等均有严格的规范和要求,特别是无菌操

作是细胞培养成败的关键。

三、材料和试剂

1、细胞:293细胞株

2、试剂:0.25%胰酶、1640培养基(含10%小牛血清)

3、仪器和器材:倒置显微镜,培养箱、电动枪,培养板,吸液枪,5ml玻璃吸管、酒精

灯等

四、操作步骤

1、将长满细胞的培养板中原来的培养液吸去。

2、加入1~2ml 0.25%胰酶溶液,使板底细胞都浸入溶液中。

3、马上吸走胰酶液,再次加入2ml左右的胰酶,同样马上吸去,

再加入几滴胰酶放入培养箱中消化几分钟

4、用吸管将贴壁的细胞反复吹打成悬液,再按照观察的生长情况

确定的传代比例传代

5.根据确定的比例来取需要的量(剩余的细胞拿来做细胞计数),

加入4ml左右的培养液

6.前后左右的来回震荡使细胞分散均匀后,将培养板放入培养箱

7.收拾整理超净台

附:消化液配制方法:

称取2.5克胰酶蛋白酶,加入100ml10xpbs+纯水溶解到1l,滤器

过滤除菌,4℃保存,

用前可在37℃下回温。

10x pbs配方:na2hpo4(14.2g)kh2po4(2.32g)

nacl(80g)kcl(2.02g)

(调至ph=7.4)

五、实验结果

传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶壁上,2天左右就在

瓶内形成单层,

达到七八成满。这时需再次传代

六、讨论与反思

无菌操作中的注意事项

在无菌操作中,一定要保持工作区的无菌清洁。为此,在操作前要

认真地洗手并用75%乙醇消毒。操作前20~30分钟起动超净台灭菌。培养瓶要在超净台内才能打开瓶塞,打开之前和加塞前瓶口都

要在酒精灯上烧一下,打开瓶口后的操作全部都要在超净台内完成。操作完毕后,加上瓶塞,才能拿到超净台外。使用的吸管在从消毒

的铁筒中取出后要手拿末端,将尖端在火上烧一下,戴上胶皮乳头,然后再去吸取液体。总之,在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯

的周围进行。

每天观察细胞形态,掌握好细胞是否健康的标准:健康细胞的形态

饱满,折光性好,生长致密时即可传代。

多做,熟能生巧

【篇二:细胞传代实验报告】

细胞传代培养

一.实验目的

初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程,为生物技术在医学上的应用打下基础。

二、原理

从生物体中取出某种组织或细胞,模拟体内生理条件,在人工培养条件下使其生存、生长、繁殖或传代,这一过程称为细胞培养。细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接

观察

活细胞,并在有控制的环境条件下进行实验,避免了体内实验时的许多复杂因素,还可

以与

体内实验互为补充,可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象,耗费少,比较

经济,

因此成为生物学研究的重要手段。细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。直接从体内获取的组织细胞进行首次培养

原代培养;当原代培养的细胞增殖达到一定密度后,则需要做再培养,即将培养的细胞

分散

后,从一个容器以1:2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养,为传代培养,

作是细胞培养成败的关键。

三、材料和试剂

1、细胞:293细胞株

2、试剂:0.25%胰酶、1640培养基(含10%小牛血清)

3、仪器和器材:倒置显微镜,培养箱、电动枪,培养板,吸液枪,5ml玻璃吸管、酒精灯等

四、操作步骤

1、将长满细胞的培养板中原来的培养液吸去。

2、加入1~2ml 0.25%胰酶溶液,使板底细胞都浸入溶液中。

3、马上吸走胰酶液,再次加入2ml左右的胰酶,同样马上吸去,再加入几滴胰酶放入培养箱中消化几分钟

4、用吸管将贴壁的细胞反复吹打成悬液,再按照观察的生长情况确定的传代比例传代

5.根据确定的比例来取需要的量(剩余的细胞拿来做细胞计数),加入4ml左右的培养液

6.前后左右的来回震荡使细胞分散均匀后,将培养板放入培养箱

7.收拾整理超净台

附:消化液配制方法:

称取2.5克胰酶蛋白酶,加入100ml10xpbs+纯水溶解到1l,滤器过滤除菌,4℃保存,用前可在37℃下回温。

10x pbs配方:na2hpo4(14.2g)kh2po4(2.32g)

nacl(80g)kcl(2.02g) (调至ph=7.4)

五、实验结果

传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶壁上,2天左右就在瓶内形成单层,达到七八成满。这时需再次传代

六、讨论与反思

无菌操作中的注意事项在无菌操作中,一定要保持工作区的无菌清洁。为此,在操作前要认真地洗手并用75%

乙醇消毒。操作前20~30分钟起动超净台灭菌。培养瓶要在超净台内才能打开瓶塞,打开之

前和加塞前瓶口都要在酒精灯上烧一下,打开瓶口后的操作全部都要在超净台内完成。操作

完毕后,加上瓶塞,才能拿到超净台外。使用的吸管在从消毒的铁筒中取出后要手拿末端,

将尖端在火上烧一下,戴上胶皮乳头,然后再去吸取液体。总之,在整个无菌操作过程中都

应该在酒精灯的周围进行。每天观察细胞形态,掌握好细胞是否健康的标准:健康细胞的形态饱满,折光性好,生

长致密时即可传代。

多做,熟能生巧篇二:细胞生物学实验传代培养

一、【实验目的】

1、了解动物细胞传代培养的基本原理。

2、掌握动物细胞传代培养的基本操作,并对hela细胞进行传代培养。

二、【实验原理】

hela 是heietta lacks的简称,heietta lacks 是一位患有子宫颈癌

的美国妇女的

名字,在她死后,该细胞走被广泛散发到各研究机构,并无限次地

繁殖分裂下去。培养细胞的特性:

贴附生长:必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞。悬浮生长:于悬浮状态下即可生长,不需要贴附于支持物表面。见

于各种造血系统肿瘤

细胞。

每代贴附生长细胞的生长过程:

1、游离期细胞接种后在培养液中呈悬浮状态.也称悬浮期。此时

细胞质回缩,胞体

呈圆球形。10分钟一4小时

2、贴壁期细胞附着于底物上,游离期结束。细胞株平均在10分

钟一4小时贴壁。

3、血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白

(生长基质),这些带

正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上,悬浮细胞再与吸附

有促贴壁因子的附着。

4、潜伏期此时细胞有生长话动,而无细胞分裂。细胞株潜伏期一

般为6~24小时。

5、对数生长期细胞数随时间变化成倍增长,活力最佳,最适合进

行实验研究。

6、停止期(平台期)细胞长满瓶壁后,细胞虽有活力但不再分裂

细胞传代方法

1、悬浮生长细胞传代离心法传代:离心(1000转/分)去上清,沉

淀物加新培养液后再混匀传代。直接传代

法:悬浮细胞沉淀在瓶壁时,将上清培养液去除l/2一2/3,用吸管直接吹打形成细胞悬

液再传代。

2.悬浮生长细胞传代(hela细胞)此类细胞部分呈现贴壁生长现象,但贴壁不牢,可用直接吹打法使纫胞从瓶壁脱落下来,

进行传代。

3、贴壁生长细胞传代

采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25%的胰蛋白酶液。

细胞培养用液的配制

蒸水 1000ml

2、d-hanks工作液试剂配方

d-hanks原液 100ml 三蒸水 896ml 0.5% 酚红液 4ml

3、消化液:

胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健,除去细胞间粘蛋

白及糖蛋白,影响细

胞骨架,从而使细胞分离。胰蛋白酶液浓度越高,作用越强,但超

过一定限度会损伤细胞。

胰蛋白酶是一种黄白色粉末,用无ca2+、mg2+的pbs缓冲液配制

常用的胰蛋白酶液浓度是

0.25%。用滤器过滤除菌。

胰蛋白酶液消化时间:2-10分钟。用含血清培养液终止其对细胞的

消化作用完全培养基的组成基础培养基 80%一95%血清 5%一20%(一般加10%)碳酸氢钠2.0 g/l 青、链霉素各100卑位/毫升血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等,其中以胎牛血清质

量最好。

优质血清的标准:透明,淡黄色,无沉淀物,无细菌、支原体、病

毒污染。血清的灭活

(消除补体活性):56 ℃,30 分钟血清的消毒:过滤除菌

三、【实验材料】

实验用具:离心管(2支),移液枪(每个台面一把),枪头,吸

管(4根),培养皿(每

组2个)

实验药品:0.25%胰酶,d-hanks,1640培养基

四、【实验操作】

1. 用75%乙醇擦手,取离心管一个,打开超净台(照明、风机),

把离心管置于架子上。

然后用75%乙醇擦一下台面,点燃酒精灯。取尖吸管、吸量管各一支,套好吸球,放置在专

用的架上。

2.从冰箱中取出0.25%胰酶、d-hanks、培养基。可以把胰酶和

d-hanks的瓶盖打开

或者拧松。

3.取待传代的细胞,用尖吸管弃去旧的培养基,加入d-hanks。轻轻摇动后将hanks弃

掉。

4.用尖吸管吸取适量胰酶加入,加入的量以覆盖整个细胞培养面为宜,轻轻摇动。2-5

分钟后迅速将消化液吸出。消化时间长短是实验成败的关键,宁可

短消化,不能过消化。否

则细胞会变死。在倒置显微镜下观察,当细胞质回缩,胞间间隙加

大为消化适宜。

5.取培养基加入细胞,反复轻轻吹打培养皿壁,制备细胞细胞悬液。吹打的部位均匀,

从上到小,从左到右,顺序进行吹打,保证各个部位的培养细胞均

能吹打到,成片的细胞已经分散成小的细胞团或者单细胞便停止吹打。吹打时用力不要过猛,

尽量不要出现气泡,以免损伤细胞。

6.至所有细胞从培养皿底部脱落下来,然后吸取至离心管中。

1000 rpm离心5分钟。(无

需准确计数时离心可略)

7.细胞离心毕,尖吸管弃去上清,吸取培养基适量,加入离心管,

将细胞重悬、吹匀。

(无需准确计数时离心可略)

8.吸量管吸取适量培养基1.5ml加入新的培养皿中。细胞悬液

0.5ml加入新的培养皿中,

9.待培养基(本身为红色),当ph值降低,培养基呈偏淡红色时,一般2天以后,将旧

的培养基吸掉,更换新鲜培养基继续培养。

五、【实验现象】培养基:rm1640培养基+10%胎牛血清

六、【实验讨论】

注意事项

1.传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操

作要尽量靠近酒精灯

火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。培养用液应严格分开。

2.每天观察细胞形态,掌握好细胞是否健康的标准:健康细胞的形态饱满,折光性好,

生长致密时即可传代。

3.如发现细胞有污染迹象,应立即采取措施,一般应弃置污染的细胞,如果必须挽救,可加含有抗生素的bss或培养基反复清洗,随

后培养基中加入较大量的

抗菌素,并经常更换培养基等篇三:原代细胞培养实验报告实验:

细胞培养

1.实验目的

初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程,为

生物工程在医学上的

应用打下基础。

2.实验原理

从生物体中取出某种组织或细胞,模拟体内生理条件,在人工培养

条件下使其生存、生

长、繁殖或传代,这一过程称为细胞培养。细胞培养技术的最大优

点是使我们得以直接观察

活细胞,并在有控制的环境条件下进行实验,避免了体内实验时的

许多复杂因素,还可以与

体内实验互为补充,可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究

对象,耗费少,比较经济,

因此成为生物学研究的重要手段。近年来,在体细胞遗传、分化、

胚胎发生、肿瘤发生、免

疫学、细胞工程、放射生物学以及老年学等一系列的研究领域中得

到广泛的应用,并取得了

丰硕的成果。细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。直接从体内获取的组织细胞进

行首次培养为原代培养;当原代培养的细胞增殖达到一定密度后,

则需要做再培养,即将培

养的细胞分散后,从一个容器以1:2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养,为传

代培养,传代培养的累积次数就是细胞的代数。细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。所有离体细胞的生长都受

温度、渗透压、ph值、无机盐影响,消毒、配液等均有严格的规范和要求,特别是无菌操作

是细胞培养成败的关键。

3.实验用品

3.1 材料和标本乳兔、hela细胞(人宫颈癌细胞)

3.2 器材和仪器手术器械、平皿、培养瓶、吸管、离心管(灭菌后备用)、酒精灯、烧

杯、超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜。

2.3 试剂含有5%小牛血清的mem培养液、0.01mol/l pbs,0.25%胰蛋白酶一0.02%

edta混合消化液、75%乙醇。

4.实验方法

4.1 原代细胞培养

4.1.1 原理

细胞培养(cell culture)是模拟机体内生理条件,将细胞从机体中取出,在人工条件下

使其生存、生长、繁殖和传代,进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。近

年来,广泛地应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域,发展成一种

重要生物技术,并取得显著成就。由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。原代培

养细胞离体时间短,性状与体内相似,适用于研究。一般说来,幼稚状态的组织和细胞,如:

动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。

4.1.2 操作

①.取材

用颈椎脱位法使乳兔迅速死亡。然后,把整个动物浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消

毒,取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀剪开用碘酒和乙醇再次消毒后的皮肤,

剖腹取出肝脏或肾脏。置于无菌平皿中。②.切割

用灭菌的pbs液将取出的脏器清洗三次,然后用眼科手术剪刀仔细

将组织反复剪碎,直

到成1mm3左右的小块,再用pbs清洗,洗到组织块发白为止。移入无菌离心管中,静置数分

钟,使组织块自然沉淀到管底,弃去上清。③.消化、接种培养吸

取0.25%胰蛋白酶一0.02%edta混合消化液1ml,加入离心管中,

与组织块混匀后,

加上管口塞子,37℃水浴中消化8~10分钟,每隔几分钟摇动一下

试管,使组织与消化液充

分接触,静止,吸去上清,向离心管中加入5~10ml含5%小牛血

清的mem培养基,用吸管

吹打混匀,移入二个培养瓶中,置于二氧化碳培养箱中培养。

4.1.3 结果

细胞接种后一般几小时内就能贴壁,并开始生长,如接种的细胞密

度适宜,5天到一周

即可形成单层。

4.2 传代细胞培养

4.2.1 原理

体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代,以

便获得稳定的细胞株

或得到大量的同种细胞,并维持细胞种的延续。培养的细胞形成单

层汇合以后,由于密度过

大生存空间不足而引起营养枯竭,将培养的细胞分散,从容器中取出,以1:2或l:3以上的

比率转移到另外的容器中进行培养,即为传代培养。细胞“一代”指

从细胞接种到分离再培养的一段期间,与细胞世代或倍增不同。在

一代

中,细胞培增3~6次。细胞传代后,一般经过三个阶段:游离期、指数增生期和停止期。常用细胞分裂指数表示细胞增殖的旺盛程度,即细胞群的分裂相数/100个细胞。一般

细胞分裂指数介于0.2%~0.5%,肿瘤细胞可达3~5%。细胞接种2~3天分裂增殖旺盛,

是活力最好时期,称指数增生期(对数生长期),适宜进行各种试验。

4.2.2 操作

①.将长成单层的原代培养细胞或hela细胞从二氧化碳培养箱中取出,在超净工作台中

倒掉瓶内的培养液,加入少许消化液。(以液面盖住细胞为宜),静置5~10分钟。②.在倒置镜下观察被消化的细胞,如果细胞变园,相

互之间不再连接成片,这时应立即在超净台中将消化液倒掉,加入

3~5ml新鲜培养液,吹打,制成细胞悬液。③.将

细胞悬液吸出2ml左右,加到另一个培养瓶中并向每个瓶中分别加

3ml左右培养液,盖好瓶

塞,送回二氧化碳培养箱中,继续进行培养。

4.2.3 结果

一般情况,传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶壁上,2~

4天就可在瓶内形成

【篇三:实验五细胞的传代培养】

实验5 细胞的传代培养

一、实验目的

熟练掌握动物细胞的传代培养法。

二、实验原理

哺乳动物细胞的传代培养是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细

胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶,细胞才能继续生长,这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。

三、仪器、材料与试剂

1仪器

co2培养箱,倒置显微镜,超净台

2材料

培养瓶,试管,移液管,巴斯德吸管,废液缸,75%酒精棉球,酒

精灯,细胞。

3试剂

完全培养基(rpmll640或dmem),0.25%胰蛋白酶,d-hanks液。

四、实验步骤

1.入无菌室之前用肥皂洗手,用75%酒精擦拭消毒双手。

2.倒置显微镜下观察细胞形态,确定细胞是否需要传代及细胞需要

稀释的倍数。将培养用液置37℃下预热。

3.超净台台面应整洁,用75%酒精溶液擦净。

4.打开超净台的紫外灯照射台面20min左右,关闭超净台的紫外灯,打开抽风机清洁空气。

5.点燃酒精灯,取出无菌试管,刻度吸管;安上橡皮头;插在无菌试管内。

6.打开细胞培养瓶,过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。

7.倒掉培养细胞的旧培养基。酌情可用2-3ml hanks液洗去残留的旧培养基,或用少量胰酶涮洗一下。

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