第二章 微生物菌种选育(笔记类)

第二章工业微生物基础

●知识要点和教学要求

1）、了解微生物的特点

2）、了解常见的工业微生物

3）、掌握工业微生物菌种的分离和选育

4）、掌握工业微生物菌种的改良

5）、掌握工业微生物菌种的保藏

6）、掌握工业微生物菌种的扩大培养

●能力培养要求

通过本章节的学习，学生能掌握工业微生物菌种的分离和选育、改良和保藏方法，以及菌种扩大培养的基本工艺。

●教案内容

2.1微生物的特点

（1）种类多，分布广

目前已发现的微生物在10万种以上。不同种类的微生物具有不同的代谢方式，能分解各式各样的有机物质和无机物质，当前国内外积极利用微生物来防治公害，分解三废中许多毒性强、结构复杂的物质。另一方面，不同微生物在生化过程中积累不同的代谢产物，所以发酵工业上常利用各种微生物来生产各种产品，如酒类、酒精、丙酮丁醇、抗生素、酶制剂、有机酸、氨基酸、核酸、维生素、菌体蛋白、医药产品和化工产品等到。

（2）高面积-体积比，代谢能力强

（3）生长迅速，繁殖快

（4）适应性强，容易培养

（5）易变性

2.2常见的工业微生物

广义的微生物包括病毒、立克次氏体、细菌、放线菌、酵母菌、霉菌、单细胞藻类、原生动物和支原体等。在发酵工业中经常遇到的是细菌、放线菌、酵母菌、霉菌及危害、放线菌生长的噬菌体。

微生物工业的范围

微生物工业越来越深地同国民经济各部门发生关系，涉及的范围十分广泛，而且越来越大，大致可分为下列14类：

（1）酿酒工业（啤酒、葡萄酒、白酒等）

（2）食品工业（酱、酱油、食醋、腐乳、面包、酸乳等）

（3）有机溶剂发酵工业（酒精、丙酮、丁醇等）

（4）抗生素发酵工业（青霉素、链霉素、土霉素等）

（5）酶制剂发酵工业（柠檬酸、葡萄糖酸等）

（6）酶制剂发酵工业（淀粉酶、蛋白酶等）

（7）氨基酸发酵工业（谷氨酸、赖氨酸等）

（8）核苷酸类物质发酵工业肌苷酸、肌苷等）

（9）维生素发酵工业（维生素B2、维生素B12等）

（10）生理活性物质发酵工业（激素、赤霉素等）

（11）微生物菌体蛋白发酵工业（酵母、单细胞蛋白等）

（12）微生物环境净化工业（利用微生物处理废水、污水等）

（13）生物能工业（沼气、纤维素等天然原料发酵生产酒精、乙烯等能源物质）

（14）微生物冶金工业（利用微生物探矿、冶金、石油脱硫等）

2.3工业微生物菌种的分离和选育

2.3.1微生物菌种的分离

从自然界分离新菌种一般包括以下几个步骤；采样、增殖培养、纯种分离和性能测定等几个步骤。

1.采样：采样地点的确定要根据筛选的目的、微生物的分布概况及菌种的主要特征与外界环境关系等，进行综合、具体地分析来决定。如果预先不了解某种生产菌的具体来源，一般可从土壤中分离。

采土方法多在选好地点后，用小铲去除表土，取离地面5-15cm 处的土壤几十克，盛入预先消毒好的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，记录采样时间、地点、环境情况等，以备查考。一般土壤中芽孢杆菌、放线菌和霉素的孢子

2.增殖培养：收集到的样品，如含所需菌种较多，可直接进行分离。如果样品含所需菌种很少，就要设法增加该菌的数量，进行增殖（富集）。所谓增殖培养就是给混合菌群提供一些有利于所需菌株生长或不利于其他菌型生长的条件以促使所需菌株大量繁殖，从而有利于分离它们。例如筛选纤维素酶产生菌时，以纤维素作为唯一碳源进行增殖培养，使得不能分解纤维素的菌不能生长；筛选脂肪酶产生菌时，以植物油作为唯一碳源进行增殖培养，能更快更准确地将脂肪酶产生菌分离出来。

3.纯种分离：通过增殖培养还不能得到微生物的纯种，生产菌在自然条件下通常是与各种菌混杂在一起的，所以有必要进行分离纯化，才能获得纯种。分离方法很多，常用的有划线法和稀释法。

4.生产性能的测定：一般采用两步法，即初筛和复筛，经过多次重复筛选，直至获得者-3株较好的菌株，供发酵条件的摸索和生产试验，进而作为育种的出发菌株。

2.3.2菌种选育

菌种选育就是按照生产的要求，根据微生物的遗传和变异的理论，用人工方法造成菌种变异，再经过筛选而达到菌种选育的目的。育种的目的，就是要改善菌种的特性，使能提高产量、改进质量、降低成本、改革工艺、方便管理及综合利用等。工业微生物育种的基本方法的包括自然选育、生产育种、抗噬菌体菌株的选育、诱变育种、代谢控制育种及基因重组定向育种等。诱变育种一般采用物理、化学诱变因素使微生物DNA的碱基排列发生变化，以使排列错误的DNA 模板形成异常的遗传信息，造成某些蛋白结构变异，而使细胞的功能发生改变。代谢控制育种主要有两个方面：一方面是改变代谢通路的育种，另一方面改变代谢自动调节系统的育种。而基因重级的方法一般有转化、转导及杂交等。有关育种的方法在微生物学中已详细介绍，这里不再赘述。

2.5工业微生物菌种的保藏

菌种保藏的目的在于使菌种的生命得以延续并保持它们原有的生物学特性。在基础的

研究中，可保证同一菌种在工作过程及工作结束后，均可获得重复的实验结果。对于有经济价值的生产菌，良好的保藏条件可保持其高产、高抗性等优良的性能。对于通过生物工程技术所得的重组菌，

则需保持其遗传特性的稳定。

菌种的保藏方法有很多，但其基本原理是大同不异的，主要是根据微生物生理、生化特点，人工地创造条件，使微生物处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。这些人式造成的环境主要是低温、干燥、缺氧三方面，使菌株尽可能少发生突变，以达到保持纯种的目的。

2.5.1 斜面保藏法和穿刺保藏法

2.5.2 干燥保藏法

2.5.3 悬液保藏法

2.5.4 冷冻干燥保藏法

2.5.5 液氨保藏法

2.5.6 低温保藏法

2.6 工业微生物菌种的扩大培养

2.6.1 微生物的培养方法

1.表面培养

表面培养是将纯种微生物接种在固体或液体培养基的表面的在恒温条件下进行静置培养的方法。如实验室中进行的固体斜面培养、固体平板培养都是表面培养；进行液体培养时，若细胞在液面生长繁殖，形成一层膜状物，也为表面培养。表面培养的特点是生长在培养基表面上的微生物既能与空气接触吸收氧气，又能与培养基接触吸收营养。但是由于表面培养近于自然培养，因此存在生长缓慢，占用面积大，容易染菌等缺点，在大规模工业生产中很少采用，仅在实验室

或小试中用得较多。

2.固体培养

固体培养法是将纯种微生物接种在固体培养基上。工业上常用大米、麸皮、米糠、谷壳、木屑等为基本原料，适当补充一些其他营养成分和水分，经灭菌后制成微生物培养基。固体培养基的特点是疏松，在培养基内部充满了空气，因此既可以静置培养，又可以通风培养。固体培养是介于表面培养和深层培养之间的一种培养方式，它的优点是设备简单，投资少，适合于小规模生产。缺点是占地面积大，劳动强度高，产品质量不太稳定。

3.液体深层培养

液体深层培养又叫液体通风培养，菌体在液体培养基中处于悬浮状态，导入培养基中的空气通过气液界面传质进入液相，再扩散进入细胞内部。液体深层培养是在专门的发酵罐中进行的。它的优点是可以根据微生物在生长过程中对碳源、氮源、生长因子等营养物质及温度、PH值、需氧量等条件的不同需要，合理配制，补加各种营养物质和随时调节温度、PH值和通风量，这就有可能把微生物培养过程的生长、代谢都控制在最佳状态而收到最好的培养效果。

2.7 种子扩大培养

1、种子扩大培养的任务

现代的发酵工业生产规模越来越大，每只发酵罐的容积有几十立方米甚至几百立方米，要使小小的微生物在几十小时的较短时间内，

完成如此巨大的发酵转化任务，那就必须具备数量巨大的微生物细胞才行。菌种扩大培养的目的就是要为每次发酵罐的投料，提供相当数量的代谢旺盛的种子。因为发酵时间的长短和接种量的大小有关，接种量大，发酵时间则短。将较多数量的成熟菌体接入发酵罐中，就有利于缩短发酵时间，提高发酵罐利用率，并且也有利于减少染菌的机会。因此，种子扩大培养的任务，不但要得到纯而壮的培养物，而且要获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物。对于不同产品的发酵过程来说，必须根据菌种生长繁殖速度快慢来决定种子扩大培养的级数。抗生素生产中，放线菌的细胞生长繁殖速度较慢，常常用三级种子培养，即将种子罐中之菌丝移植到较大的种子罐中扩大培养后，再移入发酵罐中，这种流程称为三级发酵。一般50t发酵罐多采用三级发酵，有的甚至采用四级发酵，如链霉素生产。有些酶制剂发酵生产也采用三级发酵。而谷氨酸及其他氨基酸发酵所用的菌种是细菌，生长繁殖速度很快，所以采用二级发酵。

二级发酵的流程如下：

斜面菌种一级种子摇床培养

二级种子罐培养发酵罐

2.种子罐级数

种子罐级数是指制备种子需逐级扩大培养的次数，一般根据种子的生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度，以及发酵罐的容积而定。对

于生长快的细菌，种子用量少，帮种子罐数相应也少。如谷氨酸生产，种子接入种子罐后于32C培养7-10h，菌浓达到108-109个/ml，即可接入发酵罐作为种子，这称为一级种子罐扩大培养，也称二级发酵。生长较慢的菌种，如青霉素生产菌种，种子接入一级种子罐27C培养40h后，再需移入装有新鲜培养基的第二级种子罐，于27C培养10-24h移至发酵罐作为种子，这称为二级种子罐扩大培养，也称三级发酵。一般50m3发酵罐都采用三级发酵。

种子罐的级数越少，越有利于简化工艺和控制，并可减少由于多次移种而带来染菌的机会。但也必须考虑尽量延长发酵罐最终代谢产物积累的时间，缩短由于种子发芽、生长而占用的非生产时间，以提高发酵罐的生产率。

3. 接种龄与接种量

接种龄是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。通常接种龄以菌丝处于生命极为旺盛的对数生长期，且培养液中菌体尚未达到最高峰时较为合适。对于年轻的种子接入发酵罐后往往会出现前期生长缓慢，整个发酵周期延长；过老的种子会引起生产能力下降而菌丝过早自溶。不同品种或同一品种而工艺条件不同，其接种龄是不一样的，一般要以过多次试验来确定。

接种量是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。如大多数抗生素发酵的最适接种量为7%-15%，由棒状杆菌进行谷氨酸发酵的接种量只需用%。采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖到达高峰的时间，但是，如果接种量过多，往往使菌丝生长过快，培

养液粘度增加，造成溶解氧供应不足而影响产物的合成。近年来，生产上多以加大种子量及采用丰富培养基作为获得高产的的措施。有的产品采用两面三刀只种子罐接一只发酵罐的双种法。如卡那霉素采用双种比单种的发酵单位提高8%；而且达到产量高峰的时间提前。也有采用倒种法，即以适宜的发酵液倒出适量级另一发酵罐作种子。例如链霉素发酵中，使用倒种法比单种的发酵单位提高12%。