DNA合成常见问题解答
D N A合成常见问题解答 This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020
DNA合成常见问题解答
1． DNA合成粗产物中含有什么杂质
DNA合成仪合成的粗产物经过浓氨水氨解以后，其中除了含有所需的目的DNA片段(n)以外，还含有合成反应过程中产生的目的片段短的失败片段(n-1,n-2,…)以及脱保护基团产生的铵盐。需要通过纯化去除短片段、通过脱盐去除盐分。
2．如何进行合成产物的纯化
目前公认和大多采用的DNA粗产物后处理方式有4种：
A) C18柱脱盐，这是一种活性炭柱子，有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。但是它不能有效去除比目的片段短的小片段。实际上，它是一种脱盐的作用。这种方法处理的产物中虽然含有比目的片段少5'端一个或两个或多个碱基的产物，却一般不会对普通PCR反应产生影响。但是对于需要用于测序、用于克隆的引物不能使用这个级别，以免后患无穷。
B) OPC柱纯化，OPC柱中装有对Dmt具有亲和力的树脂，合成DNA片段时保留5'端最后一个碱基上的Dmt，所有合成产物吸附在OPC柱上以后，用稀的有机溶剂洗柱，带有Dmt 的片段吸附能力强，不易被洗脱，不带有Dmt的片段吸附能力弱，被洗脱。然后用三氟乙酸TFA或三氯乙酸TCA脱去Dmt基团，再用浓一点的有机溶剂洗脱DNA。这种方法的优点是快速，简易。但是其专一性吸附Dmt能力有限，不免仍然有短片段带入的可能，而且负载量小。特别是对长于25碱基以上的片段纯化效果不好。
C) HPLC纯化，这是国外厂家常常使用的办法。它是依据不同大小的片段带有的净电荷多少来分离产物的。合成粗产物中不同长度的DNA片段决定了它带有不同的净电荷，较长的片段带有高电荷比带电荷低的短片段在离子交换柱中流动得慢。先将粗产物检测主峰位
置，再增加加样量，回收主峰位置的部分。它的优点是自动化程度高、省人力；缺点是纯化量小、不能纯化长片段(对于长于40碱基的片段，无法纯化)。
D) PAGE纯化，几乎所有专业书籍上介绍的最佳纯化方法。它是依据DNA片段在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时的迁移率不同来分离大小片段的。由于各分子所带电荷和大小不同，综合影响其在凝胶中的迁移速度，大片段迁移得慢，经过一定时间的电泳，大小片段会分开，然后停止电泳，剥离凝胶，置于荧光TLC板上在紫外灯下切割目的条带，浸泡碎胶，并从泡胶的盐溶液中回收目的DNA。优点是纯化效果很好、尤其是纯化长链效果更好、而且是可以直观看见DNA片段合成情况的质控环节。通常认为的缺点是实验室水平的PAGE 纯化实验步骤多费人工、电泳及后处理过程样品损失量大、电泳装置局限或电泳时间如果不够会影响纯化效果。但这些缺点完全可以克服。我们通过扩大规模流水作业使实验过程便于掌握和节省人力；在粗样品中加入尿素饱和液增加样品比重减少电泳上样的损失；改用C18柱回收产物，使得回收效率大大提高；通过特制电泳装置，增加凝胶厚度和长度来增加负载量和分离效果等等。所以我们一直使用PAGE纯化方式保证合成产物的纯度。
为了保障您的后续实验，请您选用PAGE纯化的产品，特别是现在DNA合成不同纯化方式的价格相差不多的情况下。
3．如何测定引物的OD值
用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的光密度来定量。请注意紫外分光光度计的使用，测定时溶液的光密度最好稀释到之间。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，取部分溶液稀释到1ml并在1ml标准比色杯中测定其光密度，即为所测体积的OD值，进而可以计算出母液的OD值。
举例：您拿到一管干粉的DNA，用1ml水溶解成母液，取该母液50微升稀释成1ml并在1ml标准比色杯中测定的光密度为，说明该50微升中含有的DNA，也即说明原来1ml母液中含有5OD的DNA。
4．如何检测引物的纯度
实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95oC,2mins)。加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)，剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。(有时由于变性不充分，主带之上可能会有条带，乃是引物二级结构条带。)
5．怎样按照使用浓度溶解引物
记住几个参数：
1OD引物干粉约为33微克；
碱基的平均分子量为；
引物的分子量=碱基数 x 碱基的平均分子量；
引物的摩尔数=质量数 / 引物分子量
举例：如果您拿到一管标明为2OD的20碱基的引物，
分子量=20 x =6490 质量数=2 x 33 =66μg
摩尔数=66 / 6490 = μmol= 10 nmol
若您需要溶解为10μM(=10pmol/μl)的溶液，只需加1mlddH2O充分溶解即可。
同时请您注意：真空干燥的DNA呈干膜状或粉末状在离心管底部，开启瓶盖时小心不要丢失；请加入足量的水充分振荡溶解。
6．如何保存引物
我们提供的干粉DNA从有机溶剂中干燥出来，无菌，无核酸酶。可以室温或-20oC密闭长期保存；
溶解以后的DNA最好保存在-20oC,溶解引物的水的PH要求大于7，并且无菌。带有荧光标记的引物请注意避光保存。
7．已经溶解的引物，为什么原先使用正常，而过一段时间再使用就不好了
如果您溶解引物的水PH过低或污染了菌或核酸酶，会使引物降解。我们发现不少实验室用的双蒸水PH<6，请您也查查。
使用时没有充分解冻振荡混合，液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。
8．为什么公司可以提供较多产物
与所有化学制备反应一样，最终产物的多少取决于起始反应物的量以及合成效率。
我们使用的仪器和生产规程使我们可以调整合成的起始量，而且合成的高效率使我们可以得到较多粗产物。
我们的改良的PAGE纯化与C18柱回收结合的方法使得我们得到的最终产物能够满足您的要求。
9．为什么说用EB染色合成DNA片段来定量是不正确的
通常可以用EB染色的方法来判断双链DNA的量(如质粒DNA)，是因为EB可以嵌合到双链DNA中。而合成的单链DNA，由于碱基组成不同，形成二级结构的可能性不同，EB的染色程度也会不同，比如Oligo(dT)等不形成二级结构，EB根本无法染色。所以不要用EB染色的方法来定量，而用紫外分光光度计检测。同样道理，用EB染色来照片不适合所有引物。
10． PCR扩增没有成功，怀疑是引物不好，怎么办
PCR扩增不成功的因素很多，需要您耐心地分析，最好在实验时设置对照来判定原因。
如果您怀疑引物的问题，请您首先测定您溶解的引物的OD值，看实验时加入的引物量是否正确。如果量是正常的，请您告诉博亚公司您的引物编号，我们会复查留存样品。如不明原因，我们免费为您重新合成一次。如果仍然不能扩增，请您查找其它原因。也可以将引物和模板寄给我们帮助您进行PCR。
11．引物不纯会造成什么后果
引物不纯可能会导致：1)非特异性扩增；2)无法用预先设计在引物5'端酶切位点的酶切开，特别是没有保护碱基的引物；3)用于测序出现双峰或乱峰。
12．普通合成的DNA片段5'末端是磷酸基团吗
普通合成的DNA片段5'末端与3'末端都是羟基，可直接用于PCR。如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5'端磷酸化，或者要求我们合成时直接在5'或3'端进行磷酸化，需要另外收费(参见价目表)。
13． PCR产物经过克隆以后测序发现引物区与合成序列不相符合，怎么办
我们认为这多数是PCR过程和克隆过程中引入的错误。遇到这种情况，请您：
1) 可以要求我们重新免费合成引物。
2) 重新挑取克隆测序，会有找到正确克隆的可能；
3) 要求我们免费为您做点突变予以改正。
14．公司可以合成多长的序列
由于用户和基因拼接的要求，我们很好地合成过不少100碱基左右长度的长片段。因为我们可以提高起始合成数量、加大合成用的试剂量、用PAGE纯化。如果您的实验需要，我们愿意接受110碱基以下的订单。
15．我订购了两条可以退火的引物，您可以帮助退火吗
可以。您也可以自己退火。用退火缓冲液(10mM Tris, pH - , 50mM NaCl, 1mM EDTA)溶解引物, 将要退火的引物等摩尔数混合，总体积不要超过500微升，加热到95oC
2mins，然后缓慢冷却至室温(低于30oC)即可。退火的产物可以放在4oC待用。
16．公司帮助设计引物吗
我们可以帮助您设计引物，需要您按照要求提供具体资料。但是由于您提供资料的准确信以及我们水平的限制，我们不能保证每一个设计的引物一定工作。我们不承担设计引物失败的责任。您如果信任我们，我们愿意帮助设计。
17．各种标记的荧光染料的名称、吸收波长和发射波长、可见光中颜色是怎样的