微生物工程综合实训报告格式

辽东学院

《微生物工程》实训报告

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实训地点：农学院生物技术实验室

指导教师：

实训时间：2010 年7 月 5 日~ 7 月12 日

一、实训目的和要求

1.熟悉红曲霉菌种的分离纯化方法。

2.掌握观察霉菌形态的基本方法，观察红曲霉的形态特征，判断所分离的红曲霉是否纯种。

3.了解红曲霉菌扩大培养的方法，为较大规模固体发酵准备菌种。

4.了解浅盘固体发酵的大致过程，在实验室中小规模制备红曲。

二、实训准备

1.（1）样品：红方。

（2）培养基：固体PDA培养基：土豆２００g、蒸馏水１０００ml、葡萄糖20g、琼脂粉15～20g、PH 5.0～6.0。

（3）器材：水浴锅、培养箱、灭菌锅、培养皿、移液管、试管等。

2.（1）器材：培养箱、灭菌锅、显微镜、载玻片、盖玻片等。

（2）乳酸石碳酸棉兰染色液：石碳酸10g，溶于蒸馏水中（可适当加热），加入乳酸10ml，甘油20ml,再加入棉兰0.02g,溶解即成。

3.（1）样品材料：米、醋酸。

（2）器材：.电饭锅、高压蒸汽灭菌锅、培养箱等。

4.（1）样品材料：优质籼米、醋酸。

（2）电饭锅、纱布、浅盘等。

三、实训内容(步骤及程序)

实训一：红曲霉发酵

1.原理：红曲霉广泛分布与自然界，因此可以从自然界中分离纯化得到。鉴于我国劳动人民很早就开始利用红曲，他们将红曲霉制成了各种各样的发酵食品，因此，要得到红曲霉菌种，最简单的办法是直接从这些发酵食品中去分离。培养红曲霉多用麦芽汁琼脂培养基，红曲霉在该培养基上生长良好，菌落较大，培养初期菌落为白色，老熟后变成淡红色、紫红色、橙红色、烟灰色等，因种而异。菌落有呈绒毯状的，也有呈皮膜状的，红曲霉在马铃薯培养基上呈现局限性生长，某些种能在马铃薯培养基上形成疮疤状菌落。红曲霉生产的是水溶性红色色素，能分泌到培养基中，使培养物着色。

2．配制培养基

（1）PDA培养基：土豆２００g、蒸馏水１０００ml、葡萄糖20g、PH 3.5～4.0、分装5ml/管、每管加95%的乙醇两滴。

（2）固体PDA培养基：土豆２００g、蒸馏水１０００ml、葡萄糖20g、琼脂粉15～20g、PH 5.0～6.0。

3．灭菌：培养基、空培养皿、空试管、无菌水、枪头、纱布等。

4．红曲霉的分离纯化

（1）红曲米或红方5g、无菌过滤，加入1000ml无菌水（分装于几个锥形瓶中，每个瓶所装溶液不超过容积的2/3），振荡摇匀。

（2）60℃水浴，杀死，不耐热的细菌及酵母菌。

（3）稀释涂平板分离。

（4）30℃培养5天。

（5）试管斜面保存。

实训二：红曲霉细胞形态的观察

1.原理：红曲霉具有霉菌的典型特征，菌丝多分枝，具横隔，幼时细胞质稠密，多含颗粒，老后出现空泡及油滴。细胞多核，菌丝体可出现菌丝融合，即两条菌丝碰在一起时，接触处细胞壁消失，膜融合，使二菌丝互相沟通。

无性繁殖由其生菌丝分化成分生孢子梗，顶部不像黑曲霉那样膨大形成顶囊，而是细胞壁和细胞膜向内缢缩形成分生孢子，分生孢子单生或2—6个成链，大多为梨形，多核，成熟后可飘散开来，在合适的条件下又可萌发成菌丝。有性繁殖产生子囊和子囊孢子，但在培养条件适宜的情况下一般不进行有性繁殖。

霉菌菌丝粗大，细胞容易收缩变形，而且孢子容易向四周飞散，所以制作标本时常用乳酸石碳酸棉蓝染色液。红曲霉在通常情况下只进行营养生长和无性繁殖，只有在条件非常恶劣的情况下才能观察到有性孢子。本实验只对营养菌丝及无性孢子的形态进行观察。

2．配制棉蓝染色液

3．取一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，滴至载玻片中央。

4．用镊子于红曲霉菌落边缘处拨取少量带孢子的菌丝于染液中，用解剖针将菌丝挑开。

5．用镊子取一块干净的盖玻片，倾斜着慢慢盖在上面，注意不要产生气泡。6．置显微镜下观察，先用低倍镜，再用高倍镜观察。

实训三：红曲霉菌种扩大培养

1.原理：红曲霉生产虽然是纯种发酵，但采用的是固态自然发酵形式，并不是严格意义上的无菌操作。为了尽可能不被杂菌污染，必须接入大量的种子。种子的扩大应逐级放大，从斜面菌种到三角瓶米粒曲种，再到浅盘固体培养曲种。本实验在三角瓶中制备纯种米粒曲种。

三角瓶米粒曲种的制备虽然比较麻烦，但曲种的含水量与固态发酵时培养基的含水量比较接近，若用它作为种子，发酵时杂菌污染的可能性相对较小。2．浸米：称取精白优质米1400g,浸于1000ml水中，并加入醋酸10ml，拌匀。

浸米时间夏季一般为5～10h，使米吃水30%。

3．灭菌：将浸过的米用清水冲至五米浆水流出，沥干（至无滴水），然后称取40g装于250ml三角瓶内，盖好瓶口布，包扎好后，于0.1MPa灭菌30min。4．接种：无菌室在使用前用紫外线灭菌３０ｍｉｎ。接种时，用接种环从红曲霉中挑取菌丝体，接入三角瓶内，并充分拌匀。

5.培养：将三角瓶中的饭粒摇匀，于３０℃温箱中保温培养，２４ｈ后再将饭粒摇匀，并摊于三角瓶低继续培养，这样每天摇瓶２～３次，经６～９天，饭粒呈紫红色，即完成种曲制作。

6.干燥：将培养成熟的红曲米从三角瓶种取出，风干后于40~45℃恒温箱中烘干或在太阳下晒干，然后用塑料袋密封储存。储存室红曲的水分应该在8%~10%之间。

实训四：红曲霉浅盘固体培养

1.原理：我国古代劳动人民在几千年前就能利用浅盘固体培养来制红曲霉，此方法一直沿用至今。如：酱油厂曲霉菌种的扩大培养，黄酒厂酒曲的扩大培养等。

由于红曲霉是一类好氧微生物，生长和代谢都需要氧气，所以应该在通气良好的曲盘上发酵。原料不能铺放的太厚，一般2~3cm，在发酵过程中要控制好曲料的温度、湿度、氧气供应（主要控制曲料的厚度，并在培养过程中适时翻曲和调节曲盘位置）等，使之有利于微生物的生长和相关代谢物的积累。浅盘固体培养有不少优点，如：所需的设备简单，只需曲盘或曲盆、竹扁、竹帘等即可；方法容易掌握，便于土法上马；投资省，推广容易。但也有不少缺点如：容易染菌，所以产品质量不稳定；占地面积大；劳动强度大，完全用于手工操作；生产的产品数量少，只适用于小型厂家。

2.种子的制备：可直接用液体药瓶发酵的红曲作为种子。

3.红曲浅盘固体培养

（1）浸米：称取5千克籼米，25℃以上浸米5小时，大米吸水分在25%左右；（2）蒸饭：将浸好的米用清水淋去米浆水，沥干至无滴水，在电饭锅的蒸锅上蒸饭。待圆汽以后继续蒸料30分钟，出饭率约135%，饭粒呈玉色，粒粒疏松，不结团块。蒸饭不能夹生，也不能烂熟：

（3）将浅盘洗净，晒干。4层纱布经高压蒸汽灭菌处理；

（4）摊凉接种：将灭菌过的纱布垫在塑料筐内，倒入约1千克蒸熟的曲料，迅速打碎团块，摊平，使曲料厚2—3厘米，盖上纱布后冷却到30—32℃；（5）接种：曲料中接入红曲液体菌种，接种量从2%--6%不等，以比较不同接种量对红曲固体发酵的影响，充分帆拌2—3次后，放于30℃恒温室中培养。

四、实训结果 (结果和分析)

1.红曲霉的分离纯化

在试管中可以看到呈条状的红曲霉，将其剪碎接种在平板上，培养观察，菌落初为白色，老熟后变成淡粉色、紫色或灰黑色，多形成红色。

2.红曲霉细胞形态的观察

经过乳酸石碳酸棉蓝染色液染色，可以在镜下观察到呈蓝色的菌丝。

3.红曲霉菌种扩大培养

将培养的红曲霉与籼米混合均匀，使其在大米上生长，培养观察，可使米粒变成紫红色。

4.红曲霉浅盘固体培养

五、实训心得

微生物工程实训七天的时间看似短暂，但从中却学到了很多，这次实训是我提前接触到了微生物工程这一学科，为以后的微生物工程的学习提供了学习方向，这次的实习使我对微生物工程产生了浓厚的兴趣，从最开始的不知道应该做些什么，到后来熟悉实验的每一个步骤，亲自接种，灭菌，完成实验，感觉自己得到了很大的充实，在这里我不单单学到了知识，更合同学们建立了身后的友谊，这是在平时无法达到的，虽然短暂的实训结束了，但我们的学习还在继续，我会继续努力去学习，追寻知识的真理。

指导教师评语：

实训报告成绩：

指导教师(签字)：

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