(人)胰蛋白酶
重组人胰蛋白酶
Cat.No.:RHT03
CAS:9002-07-7
EC:3.4.21.4
来源：人胰蛋白酶，基因工程生产，大肠杆菌表达
1.重组生产，无动物源性
重组人胰蛋白酶，氨基酸序列及性质与人胰蛋白酶完全相同。无动物源性，无病毒污染。可用于干细胞治疗、肿瘤的细胞治疗等过程中，无抗原性。
2.优势
安全性高
重组生产，无动物源性的病毒污染，如猪流感病毒、猪细小病毒等；
特殊工艺，无内源性病毒污染，无细菌、真菌、支原体污染；
冻干粉，运输及储存安全，活性不易损失；
不含任何蛋白酶抑制剂，如PMSF等。
上海雅心生物技术有限公司
?纯度高
HPLC纯化；
活性特异，无其它蛋白酶活性。
?活性高
比活性不低于2500USP u/mg。
3.用途范围
胰蛋白酶是一种内肽酶，可用于赖氨酸及精氨酸C末端剪切肽键，从而将大分子蛋白裂解为小肽。
胰蛋白酶广泛用于各种生物技术过程中，如：细胞培养各种组织的细胞分离；变性蛋白质的降解；蛋白质的酶解、测序；干细胞、肿瘤的细胞治疗等。
4.特性
纯化HPLC
产品性状白色或类白色冻干粉
纯度（HPLC）≥95%
比活不低于2500USP u/mg
其他酶含量无糜蛋白酶、羧肽酶A等污染及活性
不含任何蛋白酶抑制剂无PMSF、EDTA等任何蛋白酶抑制剂
上海雅心生物技术有限公司
5.信息
产品名称比活包装产地
重组人胰蛋白酶≥2500USP u/mg10mg,100mg,1g上海雅心
活力单位：25℃，pH7.6，反应体系3.0ml(1cm光路)，每分钟酶解BAEE使253nm下的吸收值增加0.003定义为一个USP单位。
6.相关产品
重组猪胰蛋白酶；
重组胰蛋白酶细胞消化液。
上海雅心生物技术有限公司
胰蛋白酶分离工艺
1、集落刺激因子（G-CSF ） 组成结构：是一种含有二硫键的单链糖蛋白，由175个氨基酸残基组成的单链非 糖基化多肽链 理化性质：①性状：无色澄明液体 ②分子量：20000，等电点为5.8～6.6 ③溶解度： ④稳定性： 生理作用与临床适应症：作用于造血祖细胞，促进其增殖和分化，其重要作用是 刺激粒、单核巨噬细胞成熟，促进成熟细胞向外周血释放，并能促进巨噬细胞及 噬酸性细胞的多种功能 ，主要用于预防和治疗肿瘤放疗或化疗后引起的白细胞 减少症， 分离纯化工艺： G-CSF 为无菌冻干粉剂，由含有10mM 醋酸钠pH 为4的蛋白溶液经0.2um 过滤后 分装冻干。 由含有高效表达人G-CSF 的原核表达系统（E.coli ）经发酵、分离和高度纯化后 经冻干制成。 纯化液聚乙二醇浓缩洗脱液柱层析透析液透析缓冲液溶解沉淀沉淀蛋白质盐析洗脱液纤维素柱层析透析液透析 缓冲液溶解沉淀饱和度至加入硫酸铵透析液透析滤液超滤浓缩正常成人尿液150 ephadexG -%8020000 S DEAE 2、超氧化物歧化酶（SOD ）： 组成结构： 理化性质：①性状：淡蓝色冻干粉结晶体 ②分子量：32000左右 ③溶解度： ④稳定性：耐热性强，90℃ 环境120分钟酶活几乎没有损失，100℃环境60分 钟酶活保持90%以上；稳定性高，在pH4.0—11.0范围内酶活稳定。 生理作用与临床适应症：是一种能够催化超氧化物通过歧化反应转化为氧气和过 氧化氢的酶，是一种重要的抗氧化剂，保护暴露于氧气中的细胞 分离纯化工艺： 血液预处理,洗涤红细胞和溶血;去除大部分杂蛋白得SOD 粗品;再经柱层析分离 得到精品。猪血经血液预处理、洗涤红细胞、溶血、乙醇一氯仿混合液除去血红 蛋白，然后用坟柳043HZO 萃取、丙酮沉淀、55一65℃热变性得到粗酶液。粗酶 液上阴离子DEAE 一Cellulose52交换层析柱、分子筛SephadexG-75柱,最终获 得了纯化的铜锌超氧化物歧化酶。
胰蛋白酶溶液(0.25%)
仅供科研版本号：180320 胰蛋白酶溶液(0.25%) 【产品组成】 【保存条件】 -20℃,12个月 【产品概述】 胰蛋白酶(Trypsin)是由胰脏产生没有活性的胰蛋白酶原分泌到小肠后，小肠内的肠肽酶会活化该酶原，形成胰蛋白酶。胰蛋白酶的特点在于已经活化的胰蛋白酶，能够继续活化更多胰蛋白酶原，这种过程即自动催化。胰蛋白酶在小肠工作，它会将蛋白质水解为肽，进而分解为氨基酸，其最适温度约为37℃。 Trypsin solution(0.25%)主要由0.25%胰酶组成，不含EDTA，经过滤除菌。本试剂可以直接用于培养细胞的消化，或者一些组织的消化，通常室温下1min左右就可以消化下大多数贴壁细胞。 【使用方法】 1、贴壁细胞的消化 ①吸除培养液，用无菌PBS、Hanks液或无血清培养液洗涤细胞一次，以去除残余的血清。 ②加入少量Trypsin solution，略盖过细胞即可，室温放置0.5～2min，不同的细胞消化时间有所不同。 ③显微镜下观察，细胞明显收缩，并且肉眼观察培养器皿底部发现细胞的形态发生明显的变化；或者用枪吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来，吸除胰酶细胞消化液。加入含血清的完全细胞培养液，吹打下细胞，即可直接用于后续实验。 ④如果发现消化不足，则加入Trypsin solution重新消化。 ⑤如果发现细胞消化时间过长，未及吹打细胞，细胞已经有部分直接从培养器皿底部脱落，直接用胰酶细胞培养液把细胞全部吹打下来。1000～2000g离心1min，沉淀细胞，尽量去除胰酶细胞消化液后，加入含血清的完全培养液重新悬浮细胞，即可用于后续实验。 2、组织的消化 不同的组织需要消化的时间相差很大，通常以消化后可以充分打散组织为宜。 【注意事项】 1、尽量减少反复冻融的次数，以免失效。 2、在Trypsin solution过程中，要特别注意避免消化液被细菌污染。 3、Trypsin solution消化细胞时间不宜过长，否则细胞铺板后生长状况会较差。 4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 南京森贝伽生物科技有限公司网址：https://www.360docs.net/doc/224725061.html,/ 第1页
蛋白酶酶切位点
蛋白酶酶切位点 木瓜蛋白酶巯基蛋白酶具有广泛特异性TPCK,TLCK,抑蛋白酶醛肽α-巨球蛋白,烷化剂胃蛋白酶酸蛋白酶广泛特异性胃蛋白酶抑制素 胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶在K或R之后TLCK,PMSF,抑蛋白酶醛肽抑肽酶,α巨球蛋白人体20种氨基酸及其英文缩写
名称三字符号单字符号 丙氨酸Ala A 精氨酸Arg R 天冬氨酸Asp D 半胱氨酸Cys C 谷氨酰胺Gln Q 谷氨酸Glu/Gln E 组氨酸His H 异亮氨酸Ile I 甘氨酸Gly G 天冬酰胺Asn N 亮氨酸Leu L 赖氨酸Lys K 甲硫氨酸Met M 苯丙氨酸Phe F 脯氨酸Pro P 丝氨酸Ser S 苏氨酸Thr T 色氨酸Trp W 酪氨酸Tyr Y 缬氨酸Val V 【生化】特异性蛋白酶的酶切位点 胰蛋白酶arg、lys，得到以arg、lys为C末端残基的肽段。胰凝乳蛋白酶phe、trp、tyr 等疏水aa。胃蛋白酶phe、trp、tyr等疏水aa。木瓜蛋白酶arg、lys。葡萄球菌蛋白酶，磷酸缓冲液ph7.8时断裂glu、asp。碳酸氢铵缓冲液ph7.8或醋酸铵缓冲液ph4.0时断裂glu。梭菌蛋白酶arg，用于不溶性蛋白的长时间裂解。CNBr断裂Met。羟胺断裂asn—gly间的肽键。二硫键可以用巯基化合物还原法或者过甲酸氧化法断裂.。 木瓜蛋白酶（Papain），又称木瓜酶，是一种蛋白水解酶。木瓜蛋白酶是番木瓜（Carieapapaya）中含有的一种低特异性蛋白水解酶，广泛地存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，属于巯基蛋白酶，它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，因此在食品、医药、饲料、日化、皮革及纺织等行业得到广泛应用。 木瓜蛋白酶是一种蛋白水解酶，分子量为23406，由一种单肽链组成，含有212个氨基酸残基。至少有三个氨基酸残基存在于酶的活性中心部位，他们分别是Cys25、His159和Asp158，另外六个半胱氨酸残基形成了三对二硫键,且都不在活性部位。纯木瓜蛋白酶制品可含有：（1）木瓜蛋白酶，分子量21000，约占可溶性蛋白质的10%；（2）木瓜凝乳蛋白酶，分子量26000，约占可溶性蛋白质的45%；（3）溶菌酶，分子量25000，约占可溶性蛋白质的20%；及纤维素酶等不同的酶。 番木瓜未成熟果实中含有木瓜蛋白酶(Papain)、木瓜凝乳蛋白酶A(Chymopapain A )、木瓜凝乳蛋白酶B(Chym opapain B )、木瓜肽酶B (PapayaPeptidase B ) 等多种蛋白水解酶。且已知四种半胱氨酸蛋白酶的一级结构具有高度的同源性。其中，木瓜蛋白酶属巯基蛋白酶，可水解蛋白质和多肽中精氨酸和赖氨酸的羧基端，并能优先水解那些在肽键的N-端具有二个羧基的氨基酸或芳香L-氨基酸的肽键。
胰蛋白酶活性测定
实验一胰蛋白酶活性测定 实验目的：掌握测定胰蛋白酶浓度、活性、比活的原理与方法。 实验原理：胰蛋白酶相对分子量23.7 KD，主要水解肽链中碱性氨基酸与其它氨基酸相连接的肽键，此外还能水解碱性氨基酸形成的酯键，如把人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（N-benzuyl-L-argine ethyl ester, BAEE）水解为H-苯甲酰-L-精氨酸（BA）。 胰蛋白酶所催化的上述反应中，产物BA对253 nm 的光吸收远大于BAEE，因此可以在实验起始点把253 nm 的消光值调为零，然后记录反应体系对253 nm 的消光值的增量，并把这个增量作为测定胰蛋白酶的活性指标。 酶活单位定义：在底物BAEE浓度1m mol/L，光程1 cm，波长253nm，温度25 0C，测量体积3mL,.条件下吸光值每分钟递增0.001（A/min=0.001）为1个BAEE酶活单位。 胰蛋白酶制剂中蛋白质浓度含义： 胰蛋白酶含量一般E1%表达。这个值的含义是：浓度为1% 酶蛋白，在1cm光径下，对紫外280nm 的消光值。不同厂家、不同产品的E1%值有很大差别。E1% 值越高，表明酶制剂中酶蛋白含量越高。 由于酶制剂中蛋白质含量各不相同，所以用酶制剂配制E1%的蛋白质溶液时，按照厂家对产品的E1% 的测定值配制溶液。 在本实验中，胰蛋白酶酶蛋白样品采用SIGMA 公司生产的产品,生产公司对展品的描述是对280nm紫外吸收值15.3，配制胰蛋白酶标准溶液可根据厂家的这个说明。 器材以试剂：器材，电子天平，紫外分光光度计，微量加样器。试剂：标准胰蛋白酶，N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯，HCI, Tris。 1．胰蛋白酶活性测定： 1）配制E1%的胰蛋白酶溶液
重组人胰蛋白酶
重组人胰蛋白酶 Cat. No.: RHT03 CAS: 9002-07-7 EC:3.4.21.4 来源：人胰蛋白酶，基因工程生产，大肠杆菌表达 1. 重组生产，无动物源性 重组人胰蛋白酶，氨基酸序列及性质与人胰蛋白酶完全相同。无动物源性，无病毒污染。可用于干细胞治疗、肿瘤的细胞治疗等过程中，无抗原性。 2. 优势 安全性高 重组生产，无动物源性的病毒污染，如猪流感病毒、猪细小病毒等； 特殊工艺，无内源性病毒污染，无细菌、真菌、支原体污染； 冻干粉，运输及储存安全，活性不易损失； 不含任何蛋白酶抑制剂，如PMSF等。
?纯度高 HPLC纯化； 活性特异，无其它蛋白酶活性。 ?活性高 比活性不低于2500 USP u/mg。 3.用途范围 胰蛋白酶是一种内肽酶，可用于赖氨酸及精氨酸C末端剪切肽键，从而将大分子蛋白裂解为小肽。 胰蛋白酶广泛用于各种生物技术过程中，如：细胞培养各种组织的细胞分离；变性蛋白质的降解；蛋白质的酶解、测序；干细胞、肿瘤的细胞治疗等。 4.特性 来源重组大肠杆菌 纯化HPLC 产品性状白色或类白色冻干粉 纯度（HPLC）≥95% 比活不低于2500 USP u/mg 其他酶含量无糜蛋白酶、羧肽酶A等污染及活性 不含任何蛋白酶抑制剂无PMSF、EDTA等任何蛋白酶抑制剂
5.信息 产品名称比活包装产地 重组人胰蛋白酶≥2500 USP u/mg10mg,100mg,1g上海雅心 活力单位：25℃，pH7.6，反应体系3.0ml (1cm 光路)，每分钟酶解BAEE使253nm下的吸收值增加0.003定义为一个USP单位。 6.相关产品 重组猪胰蛋白酶； 重组胰蛋白酶细胞消化液。
02-重组赖氨酰内切酶 重组赖氨酰肽链内切酶(Lys C)
重组赖氨酰内切酶 ? 产品简介 赖氨酰内切酶（Lysyl Endopeptidase ，EC 3.4.21.50）属于丝氨酸蛋白酶，可特异性切割赖 氨酸残基羧基端的肽键。赖氨酰内切酶广泛用于 生物制药、生物分析、细胞培养等领域。 冀百康生物的系重组大肠杆菌表达、经多步分 离纯化后冷冻干燥而制成冻干粉，具有天然赖氨 酰内切酶相同的活力和特异性。本品为生物化学级别的基因工程酶，不含DFP 、PMSF 和TLCK 等酶抑制剂。丝氨酸蛋白酶抑制剂如PMSF 等抑 制酶活，但金属离子螯合剂如EDTA 不会抑制酶活。本品为无标签的赖氨酰内切酶，与天然的赖氨酰内切酶具有相同的氨基酸序列。 一种高纯度、高活性、高特异性的重组蛋白水解酶 ? 产品特性 活力单位：30℃， pH9.5条件下，每分钟催化底物生成1μmol 对硝基苯胺的酶量为1AU 。 ? 产品优势 ● 无动物源性：产品无病毒污染，生产过程不 使用任何动物来源的材料。 ● 符合BP2019和EP8.8的标准。 ● 耐受性强：广泛的pH 耐受，较强的表面活 性剂耐受性。 ● 生产规模1000L 以上。 ● 质量稳定：可保证连续稳定的批量生产，批 间质量差异小。 ● 合规性：生产设备和生产环境符合相关法规 要求，符合GMP 指导原则。 ● 质量文件完整：按客户需求，可提供相关法 规支持文件。
SDS-PAGE电泳图谱35KD 27KD ?产品用途 ●蛋白药物的生产，如胰岛素及类似物生产， GLP-1类似物生产。 ●蛋白质结构与功能研究，如蛋白质质谱、测 序、肽图谱分析。 ●小分子蛋白或多肽的生产，如美容肽，抗菌 肽、食品风味肽的生产等。 ●Lys-X化合物的酶催化合成。 ●干细胞、原代细胞的培养，作用更加温和。 ?使用方法 ●推荐使用pH8.0~10.0的20mM Tris-HCl 溶 解冻干粉，酶：融合蛋白=2~100AU：1g， 最适pH9.0-10.0，最适温度25-35℃，反应 时间2~18h。 ●注意事项：高于0.1M的无机盐对酶活性会 有一定的影响，建议脱盐后再进行酶切反 应。如无法脱盐，建议增加酶的用量并延 长酶切时间。 ?产品规格 ?运输和储存稳定性 ●运输稳定性：冰袋保温运输，保证酶活稳定。 ●储存稳定性：于-15℃~ -20℃储存，24个月内 稳定；当Tris-HCl缓冲液配制成酶溶液时，于-20℃储存反复冻融10次无活性损失，在4℃和-20℃能稳定存放一周。 ?相关产品 重组赖氨酰内切酶（含组氨酸标签）冻干粉；重组胰蛋白酶冻干粉；重组羧肽酶B（含组氨酸标签）。重组赖氨酰内切酶用于融合蛋白的酶切 35KD 27KD
南极磷虾胰蛋白酶的结构分析及适冷性机制研究
南极磷虾胰蛋白酶的结构分析及适冷性机制研究 周婷婷，王锡昌，李燕 （上海海洋大学食品科学与工程学院，上海 201306） 摘要：本文基于酶的纯化鉴定、动力学分析、序列比对和结构预测，对南极磷虾胰蛋白酶的结构及适冷性进行研究，通过与其他几种适冷、中温胰蛋白酶进行差异性分析，探讨南极磷虾胰蛋白酶等适冷酶在催化反应过程中应对低温环境的机制。结果显示适冷胰蛋白酶和中温胰蛋白酶的催化中心严格保守，遵循一致的催化机制；但南极磷虾胰蛋白酶等适冷酶为了适应低温环境，各级结构都表现出一定的应对机制：疏水性残基含量偏高、带正负电荷残基含量偏低，分子内部疏水作用增强、盐桥减少，这些因素致使适冷胰蛋白酶蛋白质分子内的相互作用减弱，分子柔性增强。适冷胰蛋白酶具有更高比例的呈松散状的无规卷曲结构，一定程度提高了其柔性；底物专一性口袋周围空间位阻更小，底物更容易接近活性中心，这也是加快催化反应的关键因素。 关键词：胰蛋白酶；适冷性；酶动力学参数；南极磷虾；结构预测 文章篇号：1673-9078(2016)5-27-33 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2016.5.05 Structure and Cold-adaptation Mechanism of Trypsin Purified from the Krill (Euphausia superba Dana, 1852) ZHOU Ting-ting, W ANG Xi-chang, LI Y an (College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China) Abstract: The molecular characterization of trypsin purified from Euphausia superba (Dana, 1852) was investigated in this research. Aspects such as thermodynamic activation parameters, sequence alignment, and molecular model allowed an in-depth understanding of its activity at low temperatures. Conserved residues were compared between cold-adapted trypsin and its warm-adapted counterparts, and the results showed that their active cores were almost identical. Strategies adopted by trypsin for molecular adaptation to low temperatures may be as follows. A higher proportion of hydrophobic residues and lower proportion of charged residues in the enzyme probably diminish the number of intramolecular interactions, resulting in improved structural flexibility. Increased number of loose random coils may also contribute to improve structural flexibility. Reduced steric hindrance is also a key factor that allows the substrate to easily access the active site, thus promoting the catalytic reaction. Key words: trypsin; cold-adapted; enzyme kinetic parameters; Euphausia superba ; molecular modeling 南极磷虾生活于南极冰下，资源丰富，我国于20世纪80年代中期开始对南极磷虾进行调查和研究，于2009年开始进行大规模的商业捕捞。南极磷虾生活的水域温度一般维持在-1.7 ℃至-3 ℃，属于嗜冷水性动物，体内的酶普遍具有适冷性，在催化反应过程可能遵循着一定的应对低温环境的机制。其体内高效的蛋白质降解酶系统主要分布于南极磷虾的胃和肝脏中， 在较低温度下仍具有活性，能够迅速降解各种蛋白质， 27 收稿日期：2015-05-03 基金项目：国家高新技术研究发展（863）计划海洋技术领域主题项目（2011AA090801） 作者简介：周婷婷（1985-），女，博士研究生在读，研究方向：食品科学与工程 通讯作者：王锡昌（1964-），男，教授，博士研究生，研究方向：食品科学与工程 对复杂蛋白质的降解活性比所有的商品酶均高[1]；南 极磷虾死亡后，即使在低温环境保存，虾体也易于自溶、变质、腐败，这些现象可能都与南极磷虾体内蛋白酶的适冷性有着密切的关系。胰蛋白酶是甲壳动物体内主要的蛋白酶之一，能够专一性地切断多肽链中赖氨酸和精氨酸残基羧基端的肽键，Osnes 等[2]的研究表明，南极磷虾蛋白酶具有的高效催化性，大约40%来源于胰蛋白酶的作用。 适冷酶通过特殊的应对机制能够在低温环境下保持一定的活性，相对中温酶表现出了更加优越的催化性能，已被广泛地应用于食品加工和化工领域。有研究表明适冷酶的某些氨基酸含有比例与其适冷性有着密切的关系；适冷酶关键氨基酸残基的取代可能会改变其局部区域分子间的作用力，使分子结构的紧密程度发生变化，从而影响到其在低温环境中的催化能力
胰蛋白酶-CaCl2溶液(0.1%)
北京雷根生物技术有限公司 https://www.360docs.net/doc/224725061.html, 胰蛋白酶-CaCl 2溶液(0.1%) 简介： 胰蛋白酶(Trypsin)是由胰脏产生没有活性的胰蛋白酶原分泌到小肠后，小肠内的肠肽酶会活化该酶原，形成胰蛋白酶。胰蛋白酶的特点在于已经活化的胰蛋白酶，能够继续活化更多胰蛋白酶原，这种过程即自动催化。胰蛋白酶在小肠工作，它会将蛋白质水解为肽，进而分解为氨基酸，其最适温度约为37℃。Trypsin-CaCl 2 solution 主要由0.25%胰酶、0.1%氯化钙等组成，经过滤除菌。本试剂可以直接用于培养细胞的消化，或者一些组织的消化，通常室温下1min 左右就可以消化下大多数贴壁细胞。 组成： 操作步骤(仅供参考)： 1、贴壁细胞的消化 ①吸除培养液，用无菌PBS 、Hanks 液或无血清培养液洗涤细胞一次，以去除残余的血清。 ②加入少量Trypsin-CaCl 2 solution ，略盖过细胞即可，室温放置，不同的细胞消化时间有所不同。 ③显微镜下观察，细胞明显收缩，并且肉眼观察培养器皿底部发现细胞的形态发生明显的变化；或者用枪吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来，吸除胰酶细胞消化液。 ④如果发现消化不足，则加入Trypsin-CaCl 2 solution 重新消化。 ⑤如果发现细胞消化时间过长，未及吹打细胞，细胞已经有部分直接从培养器皿底部脱落，直接用胰酶细胞培养液把细胞全部吹打下来。 2、组织的消化 不同的组织需要消化的时间相差很大，通常以消化后可以充分打散组织为宜。 注意事项： 1、 尽量减少反复冻融的次数，以免失效。 2、 在使用胰酶细胞消化液的过程中，要特别注意避免消化液被细菌污染。 3、 胰酶细胞消化液消化细胞时间不宜过长，否则细胞铺板后生长状况会较差。 4、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 编号 名称 IH0330 Storage Trypsin-CaCl 2 solution 100ml -20℃ 使用说明书 1份
胰蛋白酶活力测定
实验胰蛋白酶活力测定 一、原理 福林—酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸，在碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色化合物（钨蓝和钼蓝）。 蛋白质中含具酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用胰蛋白酶水解蛋白底物，生成含酚基的氨基酸与福林—酚试剂反应，生成蓝色化合物，在一定的范围内，蓝色化合物颜色的深浅与酶活力的大小成正比。 二、实验仪器 试管 7220分光光度计 恒温水浴锅 三、实验试剂 福林试剂B：见福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度部分(冰箱中) 0.55mol/L碳酸钠溶液：58.3g无水碳酸钠溶于蒸馏水，稀释并定容至1000ml 10%三氯乙酸溶液 0. 2mol/L磷酸缓冲液(pH7.5)： 0.5% 酪素溶液：称取0.5g酪素，以0.5mol/L氢氧化钠1ml湿润，再
加少量0. 2mol/L 磷酸缓冲液稀释。在水浴中煮沸溶解，冷却，稀释并容至100ml ，冷藏在(冰箱)里。 500ug/L 酪氨酸溶液 胰蛋白酶溶液(冰箱中) 四、实验步骤 标准曲线的制作：按下表加入试剂： 0.20.40.60.81.0蒸馏水 1.0 0.80.60.40.20500ug/L 酪氨酸溶液6 54321管号 各管中加0.5%酪素2ml ，于37℃水浴中反应15分钟，然后加入10%三氯乙酸3ml ，过滤除去沉淀，取清液1ml ，加入0.55mol/L 碳酸钠5ml ，再加入福林试剂1ml ，于37 ℃水浴中显色15分钟，测OD 680。 以光密度为纵坐标，酪氨酸的微克数为横坐标绘制标准曲线。 样品测定：取干燥的试管2支，按下表加入试剂
0 OD6801 1福林试剂B 5.0 5.0 0.55mol/L碳酸钠溶液 37水浴中显色15分钟1 1上清液 过滤3.0 3.0 10%三氯乙酸溶液1.0 0 2mg/ml胰酶溶液0 1.0 0. 2mol/L磷酸缓冲液 37水浴中酶解15分钟2.0 2.0 0.5%酪素溶液 备注2 1 管号 五、结果计算 酶活力：在37℃下每分钟水解酪素产生lug酪氨酸为一个活力单位。样品中含酶活力单位=A/15 ╳F A—样品测定光密度查曲线得相当酪氨酸ug数 F—酶液稀释倍数 原始数据：（注：7号为待测液） 液体编 号 0 1 2 3 4 5 7 分光光 度计值 0 0.057 0.172 0.201 0.255 0.373 0.919 分光光 度计值 0 0.057 0.173 0.194 0.263 0.386 0.928 分光光 度计值 0 0.068 0.174 0.194 0.271 0.391 0.934
胰蛋白酶
胰蛋白酶简介 一、介绍 胰蛋白酶（C6H15O12P3）为蛋白酶的一种。在脊椎动物中，作为消化酶而起作用。在胰脏是作为酶的前体胰蛋白酶原而被合成的。作为胰液的成分而分泌，受肠激酶，或胰蛋白酶的限制分解成为活化胰蛋白酶，是肽链内切酶，它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。它不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。是特异性最强的蛋白酶，在决定蛋白质的氨基酸排列中，它成为不可缺少的工具。 牛的胰蛋白酶氨基酸残基223个，分子量23800，活性部位的丝氨酸残基是不可缺少的丝氨酸蛋白酶。除存在于脊椎动物外，还存在于蚕、海盘车、蝲姑、放线菌等范围广泛的生物体中。另外与高等动物的血液凝固和炎症等有关的凝血酶、纤溶酶、舒血管素等蛋白酶在化学结构和特异性等方面与胰蛋白酶具有密切的关系，可以认为这些酶是从共同的祖先酶在进化过程中分化而来的。胰糜蛋白酶与弹性蛋白酶在结构和催化机制方面也具有密切关系，但其特异性则完全不同。 胰蛋白酶系自牛、羊或猪胰中提取的一种蛋白水解酶。中国药品标准规定按干燥品计算，每1mg 的效价不得少于2500单位。由牛、羊、猪胰脏提取而得的一种肽链内切酶，只断裂赖氨酸或精氨酸的羧基参与形成的肽键。白色或米黄色结晶性粉末。溶于水，不溶于乙醇、甘油、氯仿和乙醚。分子量24 000，pI 10.5，最适pH值7.8～8.5左右。pH>9.0不可逆失活。Ca2+对酶活性有稳定作用；重金属离子、有机磷化合物、DFP、天然胰蛋白酶抑制剂对其活性有强烈抑制。临床用于抗炎消肿，工业上用于皮革制造、生丝处理、食品加工等。 胰蛋白酶的分子量与其酶原接近（23300），其等电点约为pH10.8，最适pH7.6～8.0，在pH=3时最稳定，低于此pH时，胰蛋白酶易变性，在pH>5时易自溶。Ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用。重金属离子，有机磷化合物和反应物都能抑制胰蛋白酶的活性，胰脏、卵清和豆类植物的种子中都存在着蛋白酶抑制剂。最近发现在一些植物的块基（如土豆、白薯、芋头等）中也存在有胰蛋白酶抑制剂。胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。此外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酰胺键或酯键，其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。胰蛋白酶对这些键的敏感性次序为：酯键> 酰胺键> 肽键。因此可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物作为底物来测定胰蛋白酶的活力。目前常用苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺（简称BAPA）和苯甲酰-L-精氨酸-β-萘酰胺（简称BANA）测定酰胺酶活力。用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（简称BAEE）和对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（简称TAME）测定酯酶活力。本实验以BAEE为底物，用紫外吸收法测定胰蛋白酶活力。酶活力单位的规定常因底物及测定方法而异。从动物胰脏中提取胰蛋白酶时，一般是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出来，然后再根据等电点沉淀的原理，调节pH以沉淀除去大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋白酶原）沉淀析出。经溶解后，以极少量活性胰蛋白酶激活，使其酶原转变为有活
(人)胰蛋白酶
重组人胰蛋白酶 Cat.No.:RHT03 CAS:9002-07-7 EC:3.4.21.4 来源：人胰蛋白酶，基因工程生产，大肠杆菌表达 1.重组生产，无动物源性 重组人胰蛋白酶，氨基酸序列及性质与人胰蛋白酶完全相同。无动物源性，无病毒污染。可用于干细胞治疗、肿瘤的细胞治疗等过程中，无抗原性。 2.优势 安全性高 重组生产，无动物源性的病毒污染，如猪流感病毒、猪细小病毒等； 特殊工艺，无内源性病毒污染，无细菌、真菌、支原体污染； 冻干粉，运输及储存安全，活性不易损失； 不含任何蛋白酶抑制剂，如PMSF等。 上海雅心生物技术有限公司
?纯度高 HPLC纯化； 活性特异，无其它蛋白酶活性。 ?活性高 比活性不低于2500USP u/mg。 3.用途范围 胰蛋白酶是一种内肽酶，可用于赖氨酸及精氨酸C末端剪切肽键，从而将大分子蛋白裂解为小肽。 胰蛋白酶广泛用于各种生物技术过程中，如：细胞培养各种组织的细胞分离；变性蛋白质的降解；蛋白质的酶解、测序；干细胞、肿瘤的细胞治疗等。 4.特性 纯化HPLC 产品性状白色或类白色冻干粉 纯度（HPLC）≥95% 比活不低于2500USP u/mg 其他酶含量无糜蛋白酶、羧肽酶A等污染及活性 不含任何蛋白酶抑制剂无PMSF、EDTA等任何蛋白酶抑制剂 上海雅心生物技术有限公司
5.信息 产品名称比活包装产地 重组人胰蛋白酶≥2500USP u/mg10mg,100mg,1g上海雅心 活力单位：25℃，pH7.6，反应体系3.0ml(1cm光路)，每分钟酶解BAEE使253nm下的吸收值增加0.003定义为一个USP单位。 6.相关产品 重组猪胰蛋白酶； 重组胰蛋白酶细胞消化液。 上海雅心生物技术有限公司
提取与重组胰蛋白酶的不同
胰蛋白酶与重组胰蛋白酶药典标准比较 胰蛋白酶药典标准历史 2014年之前，只有从猪或牛胰腺提取的胰蛋白酶的标准，活性标准为2500USP units/mg，目前临床已不应用。在2011年左右，通过了胰蛋白酶:糜蛋白酶（6:1）配方，用于消化道疾病的治疗。在2013年12月出版了修订稿的“用于生物医药制造过程的辅助材料”，重组胰蛋白酶作为一个例子，给出标准。2017年2月，FDA正式颁布胰蛋白酶的药典标准。 2010版中国药典第二部规定: 药品的安全性保障得到进一步加强。凡例中规定所有来源于人或动物的供注射用的原料药均增订“制法要求”。在总则十四规定：（1）来源于动物组织提取的药品，其所用动物种属要明确，所用脏器均应来自经检疫的健康动物，涉及牛源的应取自无牛海绵状脑病地区的健康牛群；来源于人尿的药品，均应取自健康人群。上述药品均应有明确的病毒灭活工艺要求以及质量管理要求。（2）直接用于生产的菌种、毒种、来自人和动物的细胞、DNA重组工程菌及工程细胞，来源途径应经国务院药品监督管理部门批准并应符合国家有关的管理规范。 2010版中国药典第三部规定: 2010版药典对安全性问题更加重视。增修订细菌内毒素检查的品种达112种；药典三部增订了逆转录酶活性检查法等。培养细胞用牛血清应来源于无牛海绵状脑病地区的健康牛群，其质量应符合本药典的有关规定；在生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程中，应提供细胞培养液的详细成分，如使用人或动物源成分，如血清、胰蛋白酶、乳蛋白水解物
胰蛋白酶重组胰蛋白酶
外观形状白色或类白色溶解性可溶 溶解性可溶生物载量NMT100CFU/ml 微生物限量- 比活力 (USP units/mg pro.) NLT3800 金黄色葡萄球 菌阴性纯度（HPLC） NLT70%β-trysin, NMT20%α -trypsin 绿脓假单胞菌阴性 沙门氏菌阴性 干燥失重不高于5.0% 灼烧残渣不高于2.5% 糜蛋白酶限量不高于5.0% 活性不低于2,500USP units/mg 美国药典中，两种胰蛋白酶的标准的主要不同点: 项目胰蛋白酶2014美国药典 来源 动物来源： 从猪或牛的胰腺提取重组（无动物源性）：DNA来源产品 纯度检测方法无HPLC 活性2,500USP units/mg比活性：3800USP units/mg pro.
胰蛋白酶最适PH及其稳定性
重组胰蛋白酶最适pH和pH稳定性 样品：重组胰蛋白酶（RPT），比活4500USP units/mg pro.（上海雅心生物技术有限公司），纯度如图1所示，BAEE（Sigma）. 图1.重组胰蛋白酶的纯度的SDS-PAGE鉴定 1.最适pH的研究 准备pH为3.0~12.0的底物BAEE（0.25mM），分别测定RPT纯酶液的活性，最后结果表示为测定数值占最高酶活的百分比。缓冲液成分依次为25mM NaAc-HAc(pH3.0~6.0)，25mM Tris-HCl(pH7.0~8.0)，25mM Gly-NaOH(pH9.0~12.0)，所有缓冲液均为25℃下配制。底物在25℃温浴10分钟后，开始测活。 2.pH稳定性的研究 取浓度为10mg/ml纯酶液，分别在pH3.0~12.0缓冲液中稀释10倍，在25℃下温浴2h，取样品测定酶活，以水浴前酶液初始活性作为100%，计算残余活性。缓冲液依次为25mM NaAc-HAc (pH3.0~6.0)，25mM Tris-HCl(pH7.0~8.0)，25mM Gly-NaOH(pH9.0~12.0)，所有缓冲液均为25℃下配制。
图2.a,RPT最适pH曲线；b,RPT的pH稳定性 分别在pH3.0~12.0不同的pH条件下，测定RPT活性。结果见上图2a，最适pH范围是7.0~11.0，而pH为9.0时测得RPT活性为最大值，这与天然提取的猪胰酶不同（天然胰酶最适pH为7.6-9.0），几乎接近极值，确定该值为测活最适条件，但是底物在碱性条件易降解，所以底物尽量要现用现配。 分析不同pH环境对RPT活性的影响，如图2b所示，RPT在pH3.0NaAc-HAc缓冲液里最为稳定。随着pH的升高，RPT酶活的损失程度也随之提高。在测定RPT最适pH值时发现，pH≤5.0底物条件下，RPT蛋白几乎无活性，如图2a所示。而图1b所示，在pH≤5.0的缓冲液中，2小时后依然保持较高的活性。说明在pH≤5.0，RPT稳定，自降解的速率大大降低，酶分子处于相对稳定的状态。此时把酶液转入到pH7.6的测活体系中，此时酶分子的构象瞬间发生变化，重新暴露出活性位点，于是又恢复了活性。此外，RPT对碱性环境有一定时间的耐受性，在pH<9.0环境中，2小时后依然有80%以上的酶活残余，从这一点讲，RPT扩大了胰酶的应用pH范围，有很大的意义。但是pH>10.0环境中，活性损失非常快。
胰蛋白酶(Trypsin)试剂盒说明书
货号: QS2303 规格：50管/48样胰蛋白酶（Trypsin）试剂盒说明书 紫外分光光度法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： 胰蛋白酶选择性水解变性蛋白质中由赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，是一种重要的消化酶。此外，胰蛋白酶还广泛应用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤等所产生的局部水肿、血肿及脓肿等的辅助治疗。 测定原理： 胰蛋白酶催化水解BAEE的酯键，生成BA，BA在253nm处有吸收峰，通过测定253nm 吸光度增加速率，即可计算出胰蛋白酶的活性。 自备实验用品及仪器： 紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 试剂组成和配制： 试剂一：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加5mL蒸馏水充分溶解。 试剂三：液体50mL×1瓶，4℃保存。 粗酶液提取： 组织样品：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）冰浴匀浆，8000g，4℃离心10min，取上清，即粗酶液。 测定操作： 1. 分光光度计预热30 min，调节波长到253 nm，蒸馏水调零。 2. 试剂二置于37℃水浴预热30min。 3. 空白管：取1mL石英比色皿，加入10μL蒸馏水，100μL试剂二，900μL试剂三，迅速混匀于253nm测定0s和60s的吸光度A1和A2，△A空白= A2-A1。 4. 测定管：取1mL石英比色皿，加入10μL粗酶液，100μL试剂二，900μL试剂三，迅速混匀于253nm测定0s和60s的吸光度A3和A4，△A测定= A4-A3。 胰蛋白酶活性计算公式： (1) 按照蛋白浓度计算 活性单位定义：37℃每毫克蛋白质每分钟催化253nm处吸光值增加1为1个酶活单位。 胰蛋白酶（U/mg prot）= (△A测定-△A空白) ×V反总÷（Cpr×V1）÷T =101×(△A测定-△A空白) ÷Cpr Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；V1：加入反应体系中粗酶液体积（mL），10μL=0.01 mL；V反总：反应总体积，1.01mL；T：反应时间（min），1min。 （2）按照样本质量计算 活性单位定义：37℃每克组织每分钟催化253nm处吸光值增加1为1个酶活单位。 胰蛋白酶（U/g鲜重）= (△A测定-△A空白) ×V反总÷（W×V1÷V2）÷T 第1页，共2页
重组胰蛋白酶
Cat.No.：RPT0201 CAS：9002-07-7 EC：3.4.21.4 储存温度：2-8℃ 来源：重组猪胰蛋白酶，基因工程生产，大肠杆菌表达。 蛋白序列：氨基酸序列与猪胰腺来源的胰蛋白酶完全一致。 1.产品简介 胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，可特异切割赖氨酸及精氨酸C末端肽键。雅心重组猪胰蛋白酶是由重组大肠杆菌表达生产，氨基酸序列与猪胰腺来源的胰蛋白酶完全一致，重组猪胰蛋白酶具有与动物源性猪胰蛋白酶相同的酶学性质，可替代猪胰腺来源胰蛋白酶应用于各种生物技术过程中。重组胰蛋白酶分子量24kD，最适pH为7.0-11.0。活性受丝氨酸蛋白酶抑制剂如PMSF等的抑制，金属离子螯合剂如EDTA等抑制酶活。 2.产品特性 来源重组大肠杆菌 产品外观白色、类白色、类黄色粉末 比活≥3800USP units/mg pro. 纯度（蛋白电泳）单一主条带 分子量（蛋白电泳）24.0±2.4kDa 活力单位：25℃，pH7.6，反应体系3.0ml(1cm光路)，每分钟酶解BAEE使253nm下的吸收值增加0.003定义为一个USP单位。 3.使用方法 1mMHCl溶解，重组胰蛋白酶浓度为1-10mg/ml。使用时，酶量：目的蛋白=1：50-1：1000，最适pH为7.0-11.0。 4.储存和运输稳定性 储存稳定性：重组胰蛋白酶冻干粉存于2-8℃，24个月稳定； 1mM盐酸或50mM醋酸溶解后储存于-20℃，反复冻融10次，无活性损失。 运输稳定性：蓝冰保温运输，活性稳定。 5.产品优势 ●无动物源性：重组生产，无外源性的病毒污染，生产过程不使用任何动物源原料。 ●质量稳定：批量生产，可保证稳定连续的批次生产；产品批次间无差异，质量稳定。 ●纯度高：比活高；宿主蛋白残留小于生物制品限度要求。 ●冻干粉：易于储存和运输。 ●符合法规要求：生产设备和生产环境符合相关法规要求，生产过程完全遵循NSF ISO9001:2008质量 体系并符合GMP指导原则。 ●质量文件完整：按客户需求，可提供相关法规支持文件。
中国药典级重组胰蛋白酶简介
重组胰蛋白酶(液体)—药典级 Cat.No.：RPT0204 CAS：9002-07-7 EC：3.4.21.4 来源：重组猪胰蛋白酶，基因工程生产，与猪胰腺来源的胰蛋白酶氨基酸序列一致。 1.产品简介 胰蛋白酶可特异切割赖氨酸及精氨酸C末端肽键，可降解细胞间结合蛋白。雅心生物生产的重组猪胰蛋白酶的氨基酸序列与猪胰腺来源的胰蛋白酶一致，由重组大肠杆菌表达生产。可替代传统提取胰酶用于疫苗、干细胞、免疫细胞治疗、药物筛选、抗体等领域细胞消化过程。抑肽酶、大豆胰蛋白酶抑制剂等可抑制酶 活力单位：25℃，pH7.6，反应体系3.2ml(1cm光路)，每分钟酶解BAEE使253nm下的吸收值增加0.003定义为一个胰蛋白酶单位（USP）。 4.使用说明 1.溶液配制：重组胰蛋白酶室温下融化，根据COA中的蛋白含量，取适量胰蛋白酶，加入HBSS平衡液（或其他适宜细胞消化的缓冲液，如需要加入EDTA其终浓度推荐0-1mM，最好不超过2mM），推荐一般使用的胰蛋白酶浓度约为0.1-0.3mg/ml（浓度根据不同细胞进行调整），轻柔混匀；该步骤可在室温环境操作； 2.使用0.22μm滤膜对上述胰蛋白酶溶液过滤并转移至无菌容器中；该步骤可在室温环境操作； 3.过滤后的胰蛋白酶溶液应在当天按照要求直接使用（例如加入1ml至T25瓶，37℃消化细胞），该液体可在2-8℃条件下保存1-2周。
4.长期保存:配好的重组胰蛋白酶细胞消化液，若需长期保存，-20℃保存，可稳定保存12个月； 5.稳定性 储存稳定性：重组胰蛋白酶溶液保存在-20℃以下，12个月稳定； 运输稳定性：干冰保温运输，运输过程不融化，活性稳定。 6.产品用途 细胞培养方面： 1.组织块消化，原代细胞获取； 2.贴壁细胞的传代消化； 3.微载体方法培养的细胞消化； 4.干细胞温和消化； 5.免疫细胞治疗等。 重组蛋白方面： 1.重组胰岛素生产； 2.蛋白测序、肽谱图； 3.蛋白组学研究等特异性蛋白酶解过程。 7.相关产品 重组羧肽酶B； 序列分析纯胰蛋白酶； 重组人胰蛋白酶； 重组肠激酶。
胰蛋白酶溶液(0.25%)
胰蛋白酶溶液(0.25%) 简介： 胰蛋白酶(Trypsin)是由胰脏产生没有活性的胰蛋白酶原分泌到小肠后，小肠内的肠肽酶会活化该酶原，形成胰蛋白酶。胰蛋白酶的特点在于已经活化的胰蛋白酶，能够继续活化更多胰蛋白酶原，这种过程即自动催化。胰蛋白酶在小肠工作，它会将蛋白质水解为肽，进而分解为氨基酸，其最适温度约为37℃。 Leagene Trypsin solution(0.25%)主要由胰酶组成，不含EDTA ，经过滤除菌。本试剂可以直接用于培养细胞的消化，或者一些组织的消化，通常室温就可以消化下大多数贴壁细胞。 组成： 自备材料： 1、 PBS 、Hanks 液或无血清培养液 2、 显微镜 3、 离心机 操作步骤(仅供参考)： 1、贴壁细胞的消化 ①吸除培养液，用无菌PBS 、Hanks 液或无血清培养液洗涤细胞一次，以去除残余的血清。 ②加入少量Leagene Trypsin solution ，略盖过细胞即可，室温放置，不同的细胞消化时间有所不同。 ③显微镜下观察，细胞明显收缩，并且肉眼观察培养器皿底部发现细胞的形态发生明显的变化；或者用枪吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来，吸除胰酶细胞消化液。加入含血清的完全细胞培养液，吹打下细胞，即可直接用于后续实验。 ④如果发现消化不足，则加入Trypsin solution 重新消化。 ⑤如果发现细胞消化时间过长，未及吹打细胞，细胞已经有部分直接从培养器皿底部脱落，直接用胰酶细胞培养液把细胞全部吹打下来。离心，沉淀细胞，尽量去除胰酶细胞消化液后，加入含血清的完全培养液重新悬浮细胞，即可用于后续实验。 2、组织的消化 编号 名称 CC0133 Storage Trypsin solution(0.25%) 100ml -20℃ 使用说明书 1份
胰蛋白酶的制备及其在细胞培养中的应用研究
天然产物研究与开发N at Prod R es D ev 2009,21:101121014 文章编号:100126880(2009)0621011204 收稿日期:2009202216 接受日期:2009206202 基金项目:西北民族大学校级中青年项目(XBMU 220062BD 282)3通讯作者Tel:862931229383112609;E 2mail:li m ingsheng@xb mu .edu .cn 胰蛋白酶的制备及其在细胞培养中的应用研究 李明生 13 ,李 倬1,乔自林1,冯若飞1,马忠仁1,冯玉萍1,侯兰新1,张福梅 2 1 西北民族大学生物工程与技术国家民委重点实验室;2西北民族大学理科实验中心,兰州730030 摘 要:无菌采集健康牛胰脏,用0.125mol/L 的硫酸对牛胰脏进行预处理和保存,并对原材料的细菌、真菌、内毒素、支原体、噬菌体和一些病毒外源因子进行检测,筛选合格原料。通过盐析、C M 2Sephar ose 2FF 层析、超滤等方法对胰蛋白酶进行提取和纯化。结果表明:经筛选原料提纯的胰蛋白酶通过细胞传代实验240h 后,细胞生长良好,形态正常,而未经筛选直接提取的胰蛋白酶通过细胞传代实验144h 后,细胞出现拉丝、病变等异常情况。 关键词:胰蛋白酶;原料;控制中图分类号:Q814.1;Q814.9;R285 文献标识码:A Prepara ti on and Trypsi n i n Cell Culture Appli ed Research L IM ing 2sheng 13,L I Zhuo 1,Q I A O Zi 2lin 1,FE NG Ruo 2fei 1 ,MA Zhong 2ren 1,FE NG Yu 2p ing 1,HOU Lan 2xin 1,ZHANG Fu 2mei 2 1 Key B io 2engineering &Technology L aboratory of S tate Ethnic A ffairs Co mm ission of N orthw est U niversity for N ationalities ; 2 Science Experi m ent Center of N orthw est U niversity for N ationalities,L anzhou 730030,China Abstract:A sep tic acquisiti on healthy cattle pancreas,with 0.125mol/L sulfate of bovine pancreas p r ocessing and p res 2ervati on,and the ra w material of bacteria,fungi,endot oxin,Mycop las ma,phage and s ome virus detecti on of exogenous fact ors,screening qualified ra w materials .Thr ough salting 2out,FF 2C M 2Sephar ose chr omat ography,ultrafiltrati on method of tryp sin t o extract and purify,the results showed that the selecti on of ra w materials thr ough the purificati on of tryp sin and experi m ental cells 240h (5generati ons ),the cell gr owth good,nor malmor phol ogy,and without screening tryp sin di 2rectly fr om the cells thr ough the experi m ental 144h,the cells were drawing lesi ons such as abnor mal .Key words:tryp sin;ra w materials;contr ol 胰蛋白酶是一种动物来源的蛋白水解酶,广泛 存在于动物的胰脏,是一些生物制药的主要原辅材料。随着生物制药的不断发展,因胰蛋白酶质量问题造成生物制药的质量安全问题也越来越引起人们的关注。目前,胰蛋白酶在细胞工程方面的应用主要体现在疫苗的生产与研究,最终产品直接或间接的用于人体,因此,胰蛋白酶的质量好坏直接关系到人类的健康,甚至生命安全。要控制好胰蛋白酶的质量安全,对原材料的把关是关键,由于胰蛋白酶来源于生物体,其成分复杂,单靠检验标准很难达到质量安全。一旦由胰蛋白酶途经带入,会大大影响到细胞培养,甚至影响到疫苗的产量和质量。国内对细胞培养用胰蛋白酶制备尚不成熟,且大都对原材 料没有进行严格的筛选,质量控制的研究内容也不 够全面。本实验选择健康的牛源,在无菌环境下进行采集牛胰脏;采用合理、有效、安全的方法对原材料进行处理和保存,并对采集的原料进行细菌、真菌、内毒素、支原体、噬菌体和一些病毒外源因子的检测,通过检验筛选合格的原料,为后续的胰蛋白酶提取工艺和质量控制提供保障。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 主要材料试剂 牛胰脏、实验用所有细胞、实验用所有培养基(均由兰州民海生物工程有限公司提供)、N 2苯甲酰2L 2精氨酸乙酯盐酸盐(上海如吉科技发展有限公司)、胰蛋白酶1:250(Hycl one )、鲎试剂(湛江,安度斯)