四种常用基桩完整性检测方法对比分析

四种常用基桩完整性检测方法对比分析
四种常用基桩完整性检测方法对比分析

四种常用基桩完整性检测方法对比分析某高速公路桥梁工程桩,桩径:1600 mm;桩长:43.5 m,桩型钻孔灌注桩。桩基验收检测方案为超声波透射法检测,分别对次桩依次采用:超声波透射法检测,低应变反射波法检测,钻孔取芯完整性检测,钻孔电视检测四种检测方法对其进行完整性判定。

一、超声波透射法检测

检测目的:基桩的完整性

仪器型号:RSM-SY7(F)

采用四只45KHz超声波跨孔探头,一次提升同时完成四管,六剖面的测试,从超声波测试结果来看,发现有五个剖面在6.8-7.0米处,出现幅值超判据情况。

再对该桩6.9米处异常点波形观察,异常点信号首波幅值和后续谐振波信号都偏弱,但其声速正常。由于是在同深度,多剖面信号异常,在与施工方沟通排除声测管焊接因素的影响,在做钻孔取芯前,使用低应变反射波法检测进一步查明缺陷情况。

二、低应变反射波法检测

检测目的:基桩的完整性

仪器型号:RSM-PRT(M)

采用加速度传感器,通过改变不同的锤击频率及不同的采样间隔对该桩的 6.8米处的,缺陷进行核查判断。

采用加速度传感器,通过改变不同的锤击频率及不同的采样间隔对该桩的 6.8米处的,缺陷进行核查判断。

第一次采集结果:信号在6.8米处有较小幅值的同相反射。

第二次采集结果:变换传感器安装位置信号在 6.8米处有较大幅值的同相反射,并可见第二次、第三次缺陷反射。

第三次采集结果:采用频率较高的钢筋敲击,提高缺陷位置精度,同相缺陷反射幅值较小,但也很清晰,可见微弱第二次缺陷反射。最终低应变检测核定其缺陷位置在距

桩顶 6.8米处,与超声波投射法检测缺陷深度相符,因低应变数据缺陷较为严重,

怀疑桩大面积断桩,决定采用钻孔取芯进一步验证其缺陷情况。

三、钻孔取芯完整性检测

检测目的:基桩的完整性

仪器型号:钻孔取芯机

采用钻机对该桩进行钻孔取芯检测,着重观察该桩 6.9米处混凝土完整性情况,但通过对芯样的目测观察,在 6.9 米处未取出连续较完整的芯样,以钻孔取芯检测结

果出具报告也很难判定该桩缺陷情况。

四、钻孔电视摄像检测

检测目的:基桩的完整性

仪器型号:SR-DCT(W)

采用SR-DCT(W)对桩钻芯孔,进行摄像检测,观察测试图片,清晰可见在6.9 米处,出现环状裂纹。可以最终判定该桩距桩顶6.9米处,局部断裂缺陷。

五、总结

本案例为多种检测方法对基桩完整性判定的案例,采用的这几种检测方法,由于其检测原理不同,对同个缺陷所反应的信号差异也显现的较为明显,简单概括不同的方法有具体以下特点:

超声波透射法检测:

检测深度不受限制,可以覆盖整桩,由于是超声换能器按一定的移距逐点检测,通过对逐点信号声速和波幅的变化情况,对桩的混凝土完整性进行判断,相对低应变反射波法,其检测范围和数据精度要高很多。

但超声波检测也存在一定的盲区,比如声测管以外的混凝土,横向裂缝或深度范围小的层状缺陷。

本案例所遇到的桩缺陷就是横向裂缝缺陷,估计是由于混凝土初凝阶段,后续施工造成的。超声波检测如采样移距设置不合适,很容易造成漏判,其信号反应不明显,但在同深度,都有声幅降低的情况。遇到这样缺陷,虽也可以采用超声波的斜侧方法对其进一步判定,但由于缺陷深度范围较小,估计测试效果不会太明显。

低应变反射波法检测:

检测深度受桩周土(岩)力学特性和锤击能量影响,对小尺寸缺陷反应不明显,缺陷的分辨能力和测试深度范围不及超声波检测。

但对如案例中所遇到的横向裂缝缺陷,低应变的分辨能力强,从实测信号来看,同相缺陷反射波清晰,并可见二次三次反射,是对该桩缺陷类型和程度进一步判定的数据补充。

钻孔取芯法检测:

钻孔取芯检测是基桩完整性检测最直接的方法,除判定基桩完整性外,可对对桩底沉渣和持力层情况进行判定,通过压力试验机对取芯芯样的实验还可以对桩身混凝土强度进行判定。

此方法的准确度受到取芯孔在桩的横截面方位和取芯芯样的连续性影响。本案例取芯结果就很难对其桩做局部断裂的判定,芯样不完整,裂缝的接口处无法核定。

钻孔电视测试:

钻孔电视测试方法,其实是对钻孔取芯法检测的一种验证,现在普遍应用于基桩完整性检测。可以快速的核定取芯检测的结果,在几种方法存在结果疑义的时候,最直观的反应混凝土的真实情况。对该桩的最终判定起到关键性作用。

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桩检百科筑龙岩土1周前

来源:桩检百科

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钻(冲)孔灌注桩

成孔过程采用就地造浆或制备泥浆护壁,以防止孔壁塌。

混凝土灌注采取带隔水栓的导管水下灌注混凝土工艺。灌注过程操作不当容易出现以下问题:

1. 由于停电或其他原因浇灌混凝土不连续,间断一段时间后,隔水层混凝土凝固形成硬壳,后续的混凝土下不去,只好拔出导管,一旦导管下口离开混凝土面,泥浆就会进入管内形成断桩。如果采用加大管内混凝土压力的方法冲破隔水层,形成新隔水层,老隔水层的低质量混凝土残留在桩身中,形成桩身局部低质混凝土;

2. 对于有泥浆护壁的钻(冲)孔灌注桩,桩底沉渣及孔壁泥皮过厚是导致承载力大幅降低的主要原因;

3. 水下浇注混凝土时,施工不当如导管下口离开混凝土面、混凝土浇注不连续时,桩身会出现断桩的现象,而混凝土搅拌不均、水灰比过大或导管漏水均会产生混凝土离析;

4. 当泥浆比重配置不当,地层松散或呈流塑状,导致孔壁不能直立而出现塌孔时,或承压水层对桩周混凝土有侵蚀时,桩身就会不同程度的出现扩径、缩径或断桩现象;

5. 桩径小于600mm的桩,由于导管和钢筋笼占据一定的空间,加上孔壁和钢筋的摩擦力作用,混凝土上升困难,容易堵管,形成断桩或钢筋笼上浮;

6. 对于干作业钻孔灌注桩,桩底虚土过多是导致承载力下降的主要原因,而当地层稳定性差出现塌孔时,桩身也会出现夹泥或断桩现象;

7. 导管连接处漏水将形成断桩。

P 预防措施

1. 钻孔灌注桩施工前必须进行试成孔,以便了解地质情况、检验所用设备的性能、施工工艺等。如测得孔径易缩或塌孔,沉渣过厚等,采取相应的补救措施或采用重新考虑成孔工艺,修改工艺操作方法;

2. 桩位复测防止桩位放错或漏桩现象的出现;

3. 钻杆的垂直度:钻头中心与桩位中心、护筒中心应在同一垂直线上,在开钻前必须满负荷调试运转,钻孔灌注桩应采用跳打方式,防止相邻桩穿孔;

4. 清孔质量控制:采用二次换浆清孔的方法.。在一次清孔后,提出钻杆,测量孔深,抓紧时间安放钢筋笼和混凝土导管,通过混凝土导管压入清浆,进行二次清孔。其目的是清除在安放钢筋笼及混凝土导管时产生的沉渣,清孔后的检查泥浆比重在 1.15~1.2

5.清孔后,再检查沉渣厚度(摩擦桩沉渣厚度≤150㎜;端承桩沉渣厚≤50㎜);

5. 下钢筋笼:保持与孔垂直,不能与孔壁相碰,钢筋笼接长焊接保证钢筋搭接倍数,焊缝连续保满。焊缝应做到连续、饱满,不得有气孔、夹渣、裂缝、焊瘤。

?钻孔设备

? 桩位十字线

? 成孔成槽示意图

? 钢筋笼吊放

? 排渣方式示意图

(a) 正循环排渣;(b) 反循环排渣

1-钻杆;2-送水管;3-主机;4-钻头;5-沉淀池;6-潜水泥浆泵;7-泥浆泵;8-砂石泵;9-抽渣管;10-排渣胶管

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沉管灌注桩

沉管灌注桩具有设备简单,施工速度快等优点,但是这种桩质量不够稳定,容易出现质量问题,其主要问题有:

1. 锤击和振动过程的振动力向周围土体扩散,靠近沉管周围的土体以垂直振动为主,一定距离外的土体以水平振动为主,再加上侧向挤土作用易把初凝固的邻桩振断。尤其在软、硬土层交界处最易发生缩径和断桩;

2. 拔管速度快是导致沉管桩出现缩径、夹泥或断桩等质量问题的主要原因,特别是在饱和淤泥或流塑状淤泥质软土层中成桩时,控制好拔管速度尤为重要;

3. 当桩间距过小时,邻桩施工易引起地表隆起和土体挤压,产生的振动力、上拔力和水平力会使初凝的桩被振断或拉断,或因挤压而缩径;

4. 在地层存在有承压水的砂层,砂层上又覆盖有透水性差的粘土层,孔中浇灌混凝土后,由于动水压力作用,沿桩身至桩顶出现冒水现象,凡冒水桩一般都形成断桩;

5. 当预制桩尖强度不足,沉管过程中被击碎后塞入管内,当拔管至一定高度后下落,又被硬土层卡住未落到孔底,形成桩身下段无混凝土的吊脚桩。对采用活瓣桩尖的振动沉管桩,当活瓣张开不灵活,混凝土下落不畅时,也会产生这种现象;

6. 不是通常配筋的桩,钢筋笼埋设高度控制不准,常在破桩头时找不到钢筋笼,成为废桩。

P 预防措施

1. 设置桩尖和桩管:按照施工放样的桩位中心,先设置预制钢筋混凝土桩尖。桩架安装必须水平,桩管应垂直套入桩尖,二者在同一轴线上;

2. 沉管:在振动沉管过程中,不得有偏心,并随时检查预制钢筋混凝土桩尖有无破损,桩管有无偏移或倾斜,若有上述情况应立即纠正。桩管内不允许进入水或泥浆,当有水或泥浆进入时,应灌入1.5m高的封底混凝土后再开始沉桩;

3. 灌注混凝土:每次向管桩内灌注混凝土时应尽量多灌,用长桩管打短桩时,混凝土可一次灌足;打长桩时第一次灌入桩管的混凝土应尽量灌满;

4. 拨管:开始拨管时,应测得混凝土确已流出桩管后,才可进行继续拨管。由于采用了预制桩尖振动沉入的桩管,应先振5~10秒再开始拨管,边振边拨。每上拨1m,应停拨并振动5~10秒。如此反复操作至桩管全部拨出。拨管速度应控制在0.8m/min以内;

5. 桩帽:管桩打设完成后,按设计图纸要求设置桩帽钢筋、支立模板,浇注桩帽砼,及时覆盖养护。

1-桩锤钢丝绳;2-桩管滑轮组;3-吊斗钢丝绳;4-桩锤;5-桩帽;6-混凝土漏斗;7-桩管;8-桩架;9-混凝土吊斗;10-回绳;11-行驶用钢管;12-预制桩尖;13-卷扬机;14-枕木

? 振动沉管示意图

1-导向滑轮;2-滑轮组;3-激振器;4-混凝土漏斗;5-桩管;6-加压钢丝绳;7-桩架;8-混凝土吊斗;9-回绳;10-活瓣桩尖;11-缆风绳;12-卷扬机;13-行驶用钢管;14-枕木

? 施工过程

(a)就位;(b)沉钢管;(c)开始灌注混凝土;(d)下钢筋骨架继续浇筑混凝土;(e)拔管成型

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人工挖孔桩

人工挖孔桩出现的主要质量问题有:

1. 混凝土浇注时,施工方法不当将造成混凝土离析,如将混凝土从孔口直接倒入孔内或串筒口到混凝土面的距离过大(大于

2.0m)等等;

2. 当桩孔内有水,未完全抽干就灌注混凝土,会造成桩底混凝土严重离析,进而影响桩的端阻力;

3. 干浇法施工时,如果护壁漏水,将造成混凝土面积水过多,使混凝土胶结不良,强度降低;

4. 地下水渗流严重的土层,易使护壁坍塌,土体失稳塌落;

5. 在地下水丰富的地区,采用边挖边抽水的方法进行挖孔桩施工,致使地下水位下降,下沉土层对护壁产生负摩擦力作用,易使护壁产生环形裂缝;当护壁周围的土压力不均匀时,易产生弯矩和剪力作用,使护壁产生垂直裂缝;而护壁作为桩身的一部分,护壁质量差、裂缝和错位将影响桩身质量和侧阻力的发挥。

P 预防措施

1. 桩位定位质量控制(±20mm),根据建设单位的测量基准点和测量基线放样定位,经监理复核,准确定桩的中心位置,并测出高程;

2. 严格控制垂直度(0.5H%mm)和直径(±50mm),每施工完三节护壁就要复核垂直度和中心位置。底部扩大段要按设计要求挖成圆台状,且保证尺寸(0~50mm),桩终孔要保证设计桩长和入岩深度;

3. 护壁质量控制(±20mm),采用钢筋砼护壁,每节高度为50-100cm,厚度按照设计要求尺寸施工,混凝土等级与桩一致。在施工中要保证钢筋的数量及上下节的搭接长度;

4. 水文地质条件控制,孔口四周挖排水沟,做好排水系统;及时排除地表水,搭好孔口雨篷。若孔口地层松软,为防止孔口坍塌,应在孔口用混凝土护壁,高出0.5m. ,防止土、石、杂物流入孔内伤人;

5. 灌注混凝土质量控制。成孔验收合格后,用汽车吊吊起钢筋笼徐徐放入孔内,钢筋笼外侧固定有预制的砂浆垫块,以保证混凝土保护层的厚度;

从孔底及附近孔壁渗入的地下水的上升速度较小(参考位6 mm/min)时,可采用在空气中灌注混凝土桩的方法,注意以下事项:

A. 混凝土坍落度,当孔内无钢筋骨架时,宜小于6.5 cm;当孔内设置钢筋骨架时,宜为7~9cm。如用导管灌注混凝土,可在导管中自由坠落,导管应对准中心;

B. 桩内砼底部2m范围内灌注混凝土,可依靠自由坠落捣实,不必再用人工捣实。其余部位应按1.5米为一层次进行振捣;

C. 孔内的混凝土尽可能一次连续灌注完毕;如施工缝不可避免时,应按照施工规范关于施工缝处理规定处理;

D. 混凝土灌注桩顶后,应即将表面已离析的混合物和水泥浆等清除干净。

低应变法检测桩身完整性

低应变反射波法 目前国内外普遍采用瞬态冲击方式,实测桩顶加速度或速度响应时域曲线。籍一维波动理论分析来判定基桩得桩身完整性,这种方法称之为反射波法(或瞬态时域分析法)。 传感器得安装方法: 实心桩得激振点位置应选择在桩中心,测量传感器安装位置宜为距桩中心 2/3 半径处; 空心桩得激振点与测量传感器安装位置宜在同一水平面上,且与桩中心连 线形成得夹角宜为90 度,激振点与测量传感器安装位置宜为桩壁厚得1/2 处。

传感器藕合: 把藕合剂抹在传感器底部,再把传感器放入桩顶部,松手后传感器不会移动与侧斜为佳。传感器安装地点,一点要平整。不然会影响采集效果,藕合可以用牙膏,黄油,口香糖,但不可用泥巴。 敲击: 敲击以力棒自由落体来敲击桩头,力棒落到桩头反弹后,立马抓住力棒。落距为5cm—15cm 为佳。视桩得长度而定,桩稍长可稍加大落距。长桩用得锤头最好为橡胶头,短桩用铝合金头。 波形分析完整桩:入射波与反 射波同相

也有桩底反射与初始入射波先反相再同相得扩底桩 下图为,某小区得住宅楼,长7、2 米人工挖孔桩,设计砼强度为C25。V=3675,经检测桩底反射明显,底部扩底属完整桩 缩径桩:在时程曲线上反映比较规则,缩径部位与缺陷呈先同相再反相,或仅现其同相反射信号,视严重程度,可能有多次反射,此类缺陷 桩一般可见桩底信号

离析:由于离析部位得混凝土松散,对应力波能量吸收较大,形成缺 陷波不规则,后续信号杂乱,而且频率较低,波速偏小,通常很难瞧到 桩底反射。 断桩:测试曲线呈等距多次同相反射。上部断裂往往趾呈高频多次同 时反射,反射幅值较高,衰减较慢,中部断裂反映为多次同相反射, 缺 陷得反射波幅值较低,而深部断裂波形反映下,类就是摩擦桩桩底反射,但算得得波速明显高于正常桩得波速。

常用细胞凋亡检测方法(图)

常用细胞凋亡检测方法(图) 转载请注明来自丁香园 发布日期:2012-02-16 13:41 文章来源:丁香通 关键词:丁香园生物专题义翘神州细胞培养点击次数:951 一、细胞凋亡的形态学检测 1、光学显微镜和倒置显微镜 ①未染色细胞:凋亡细胞的体积变小、变形,细胞膜完整但出现发泡现象,细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 ②染色细胞:常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化,核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。 2、荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA 特异性染料有:HO 33342 (Hoechst 33342),HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种种染料与DNA的结合是非嵌入式的,主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。Hoechst是与DNA特异结合的活性染料,储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度,使用时用PBS稀释,终浓度为10 ug/ml。DAPI为半通透性,用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度,使用终浓度一般为10 ug/ml。结果评判:细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期:Ⅰ期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased),部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体(图1)。 3、透射电子显微镜观察 结果评判:凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期(pro-apoptosis nuclei)的细胞核内染色质高度盘绕,出现许多称为气穴现象(cavitations)的空泡结构(图2);Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;细胞凋亡的晚期,细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。 二、磷脂酰丝氨酸外翻分析(Annexin V法) 磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)正常位于细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素(FITC、PE)或biotin标记,以标记了的Annexin-V作为荧光探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。 碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而使细核红染。因此将Annexin-V 与PI匹配使用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。 方法

常见的微生物检测方法

常见的微生物检测 方法

摘要:微生物的检测,无论在理论研究还是在生产实践中都具有重要的意义,本文分生长量测定法,微生物计数法,生理指标法和商业化快速微生物检测简要介绍了利用微生物重量,体积,大小,生理代谢物等指标的二十余种常见的检测方法,简要介绍了这些方法的原理,应用范围和优缺点。 概述: 一个微生物细胞在合适的外界条件下,不断的吸收营养物质,并按自己的代谢方式进行新陈代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用,则其原生质的总量(重量,体积,大小)就不断增加,于是出现了个体的生长现象。如果这是一种平衡生长,即各细胞组分是按恰当的比例增长时,则达到一定程度后就会发生繁殖,从而引起个体数目的增加,这时,原有的个体已经发展成一个群体。随着群体中各个个体的进一步生长,就引起了这一群体的生长,这可从其体积、重量、密度或浓度作指标来衡量。微生物的生长不同于其它生物的生长,微生物的个体生长在科研上有一定困难,一般情况下也没有实际意义。微生物是以量取胜的,因此,微生物的生长一般指群体的扩增。微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映。因此生长繁殖情况就可作为研究各种生理生化和遗传等问题的重要指标,同

时,微生物在生产实践上的各种应用或是对致病,霉腐微生物的防治都和她们的生长抑制紧密相关。因此有必要介绍一下微生物生长情况的检测方法。既然生长意味着原生质含量的增加,因此测定的方法也都直接或间接的以次为根据,而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。微生物生长的衡量,能够从其重量,体积,密度,浓度,做指标来进行衡量。 生长量测定法 体积测量法:又称测菌丝浓度法。 经过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是,取一定量的待测培养液(如10毫升)放在有刻度的离心管中,设定一定的离心时间(如5分钟)和转速(如5000 rpm),离心后,倒出上清夜,测出上清夜体积为v,则菌丝浓度为(10-v)/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放,简便,快速,但需要设定一致的处理条件,否则偏差很大,由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物,结果会有一定偏差。 称干重法:

细胞凋亡试验常用的方法

细胞凋亡试验常用的方法(MTT法、荧光法、DNA琼脂糖凝胶电泳法与流式细胞仪检测法) (一)药物对肿瘤细胞的抑制效应的MTT法: 用培养基将肿瘤细胞调整至2 X108个/L,在96孔板中每孔加入100ul细胞悬液于37℃、5% CO2下培养过夜。 次日每孔加入不同浓度的药物100mg/L作为试验组,设加完全培养基不加药物的阴性对照,并用功能明确的药物为阳性对照和0.5%的乙醇溶剂对照,每组均设4-6个复孔(平行孔)、37℃、5% CO2继续培养。 培养至12h、24h、48h、实验终止前4-6h加入10ulMTT(5g/L),培养4-6h后,阴性对照孔中已形成明显的蓝紫色颗粒结晶时加100ul/孔SDS-HCl终止反应,于37℃存放过夜。 用酶标仪在A570波长下测吸光度值,按下式计算抑制率 抑制率(%)=(1-试验组平均吸光度值/阴性对照组平均吸光度值)x 100%。 (二)荧光法: 选用上述最佳浓度作用于肿瘤细胞,培养细胞48h后,收货细胞用PBS洗2-3次后用0.4%多聚甲醛室温下固定30min。 弃去固定液,并用PBS洗2次后,用1%Triton X-100作用4min加入适量的0.5mg/L DAPI 荧光染色60min,用PBS冲洗3次,取10ul滴片,干燥后于荧光显微镜下检测断裂的颗粒和片状荧光。 (三)DNA琼脂糖凝胶电泳法: 1、DNA提取: 用大方瓶培养肿瘤细胞,每瓶10ml,细胞浓度为3 x 108个/ml,每隔药物浓度、作用时间均设2瓶,共分3个时间段,4个药物浓度。共培养26瓶细胞。 分别于细胞中加入不同浓度的药物,于37℃、5% CO2中分别培养12h、24h、48h,收货细胞,用PBS洗2-3次。 于-20℃将细胞冷却处理10min后将细胞收集至离心管中,加1ml细胞裂解液,再加蛋白酶K,轻轻振摇使悬液混匀,成黏糊状,50℃过夜。 冷却后加入等体积的饱和酚溶液,混合后10000r/min离心10min,吸出上层水相,移至另一离心管中,再加入等体积饱和酚溶液重复抽提一次,直到无蛋白为止。 吸上清加入氯仿/异戊醇(24:1)按上述方法再抽提一次。 吸取水相层加入1/10体积的3mol/L的醋酸钠溶液,混匀。 再加入2.5倍体积冷无水乙醇,混合置-20℃处理30min后,10000r/min离心10min,沉淀部分为提供的DNA,弃去无水乙醇后用70%乙醇漂洗2次,将离心管倒扣在吸水纸上,吸干乙醇。 加入200ulTE缓冲液融解DNA,再加入25ul的RNA酶,置37℃作用30min,置4℃冰箱保存。 2、琼脂糖凝胶电泳: TBE缓冲液配制1.8%琼脂糖凝胶。在微波炉内煮沸至琼脂糖融解,待冷却至60℃时,加入溴化乙锭,使其终浓度为0.5mg/ml,混匀后灌胶。 待凝胶固定后放入含TBE电泳液的电泳槽内,使TBE电泳液盖过凝胶。 取10-15ul提取的各组DNA样品液与上样缓冲液按4:1比例混匀后点样。 60V电泳1h,用紫外透射仪观察梯形条带。

实验14-细胞凋亡的诱导和检测

实验14 细胞凋亡的诱导和检测 20世纪60年代人们注意到细胞存在着两种不同形式的死亡方式:凋亡(apoptosis)和坏死(necrosis)。细胞坏死指病理情况下细胞的意外死亡,坏死过程细胞膜通透性增高,细胞肿胀,核碎裂,继而溶酶体、细胞膜破坏,细胞容物溢出,细胞坏死常引起炎症反应。 细胞凋亡apoptosis一词来源于古希腊语,意思是花瓣或树叶凋落,意味着生命走到了尽头,细胞到了一定时期会像树叶那样自然死亡。凋亡是细胞在一定生理或病理条件下遵守自身程序的主动死亡过程。凋亡时细胞皱缩,表面微绒毛消失,染色质凝集并呈新月形或块状靠近核膜边缘,继而核裂解,由细胞膜包裹着核碎片或其他细胞器形成小球状凋亡小体凸出于细胞表面,最后凋亡小体脱落被吞噬细胞或邻周细胞吞噬。凋亡过程中溶酶体及细胞膜保持完整,不引起炎症反应。细胞凋亡时的生化变化特征是核酸切酶被激活,染色体DNA被降解,断裂为50~300 kb长的DNA片段,再进一步断裂成180~200bp整倍数的寡核苷酸片断,在琼脂糖凝胶电泳上呈现“梯状”电泳图谱(DNA Ladder)。细胞凋亡在个体正常发育、紫稳态维持、免疫耐受形成、肿瘤监控和抵御各种外界因素干扰等方面都起着关键性的作用。 1.细胞凋亡的检测方法 凋亡细胞具有一些列不同于坏死细胞的形态特征和生化特征,据此可以鉴别细胞的死亡形式。细胞凋亡的机制十分复杂,一般采用多种方法综合加以判断,同时不同类型细胞的凋亡分析方法有所不同,方法选择依赖于具体的研究体系和研究目的(表?)。

形态学观察方法:利用各种染色法可观察到凋亡细胞的各种形态学特征: (1)DAPI时常用的一种与DNA结合的荧光染料。借助于DAPI染色,可以观察细胞核的形态变化。 (2)Giemsa染色法可以观察到染色质固缩、趋边、凋亡小体形成等形态。 (3)吖啶橙(AO)染色,荧光显微镜观察,活细胞核呈黄绿色荧光,胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜侧,可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 (4)吖啶橙(A())/溴化乙啶(EB)复染可以更可靠地确定凋亡细胞的变化,AO只进入活细胞,正常细胞及处于凋亡早期的细胞核呈现绿色;EB只进入死细胞,将死细胞及凋亡晚期的细胞的核染成橙红色。 (5)台盼蓝染色对反映细胞膜的完整性,区别坏死细胞有一定的帮助,如果细胞膜不完整、破裂,台盼蓝染料进入细胞,细胞变蓝,即为坏死。如果细胞膜完整,细胞不为台盼蓝染色,则为正常细胞或凋亡细胞。使用透射电镜观察,可见凋亡细胞表面微绒毛消失,核染色质固缩、边集,常呈新月形,核膜皱褶,胞质紧实,细胞器集中,胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 (6)木精-伊红(HE)染色是经典的显示细胞核、细胞质的染色方法,染色结果清晰。发生凋亡的细胞经HE染色后,其细胞大小的变化及特征性细胞核的变化:染色质凝集、呈新月形或块状靠近核膜边缘,晚期核裂解、细胞膜包裹着核碎片“出芽”凸出于细胞表面形成凋亡小体等均可明显显示出来。 DNA凝胶电泳:细胞发生凋亡或坏死,其细胞DNA均发生断裂,细胞小分子 质量DNA片段增加,高分子DNA减少,胞质出现DNA片段。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间,出现180~200 bp DNA片段,而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片段,利用此特征可以确定群体细胞的死亡,并可与坏死细胞区别。

细胞凋亡实验步骤及注意事项

细胞凋亡实验步骤及注意事项 一、实验目的 1、掌屋凋亡细胞的形态特征 2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞与坏死 细胞的方法 二、实验原理 细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡与坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界,在生物个体与生存中起着非常重要的作用。它就是细胞在一 定生理条件下一系列顺序发生事件的组合,就是细胞遵循一定规律自己结束生命 的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学与生物化学特征。 在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触,细胞变园,细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网与细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体,凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外,不会影响其它细胞,因而不引起炎症反应。 在生物化学上,多数细胞凋亡的过程中,内源性核酸内切酶活化,活性增加。核DNA 随机地在核小体的连接部位被酶切断,降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳,可显示以180-200bp为基数的DNA ladder(梯状带纹)的特征。 相比之下,坏死就是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期 即丧失质膜完整性,各种细胞器膨胀,进而质膜崩解释放出其中的内容物,引起炎症反应,坏死过程中细胞核DNA虽也降解,但由于存在各种长度不等的DNA片断,不能形成梯状带纹,而呈弥散状。 一些温与的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡,通常这些因素在诱导凋亡的同时,也可产生细胞坏死,这取决于损伤的剧烈程度与细胞本身对刺激的敏感 程度。 三尖杉酯碱(HT)就是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病,急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0、02~5μg/ml范围内作用2小时,即可诱导HL-60细胞凋亡,并表现出典型的凋亡特征。本实验用1μg/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡,同时也有少数细胞发生坏死。用 Hoechst33342与碘化丙啶(propidium iodide,PI)对细胞进行双重染色,可以区别凋亡、坏死及正常细胞。 细胞膜就是一选择性的生物膜,一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时,质膜不完整,PI就进入细胞内部,它可嵌入到DNA或RNA中,使坏死细胞着

(完整)常见细胞凋亡检测的方法与注意事项

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常见细胞凋亡检测的方法与注意事项 大家常把细胞凋亡和细胞坏死混淆,其实两者是不同的细胞死亡形式,大家可以在死亡细胞的形态、生化和分子指标上将二者区分开来,细胞凋亡检测的方法不少,这里就总结下几种常用的检测方法. 细胞凋亡检测更多详情,点击查看不可不知的细胞检测方法——MTT 一、细胞凋亡的形态学检测 根据凋亡细胞固有的形态特征,人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。 1 光学显微镜和倒置显微镜 (1) 未染色细胞:凋亡细胞的体积变小、变形,细胞膜完整但出现发泡现象,细胞凋亡晚期可见凋亡小体。 贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落. (2)染色细胞:常用姬姆萨染色、瑞氏染色等.凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化,核膜裂解、染色质分割 成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。 2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 常用的DNA特异性染料有:HO 33342 (Hoechst 33342),HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种染料与DNA的结合是非嵌入式的,主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。 Hoechst是与DNA特异结合的活性染料,储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度,使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。 DAPI为半通透性,用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度,使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。 结果评判:细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期:Ⅰ期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased),部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体(图1)。 3 透射电子显微镜观察 结果评判:凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期(pro—apoptosis nuclei)的细胞核内染色质高度盘绕,出现许多称为气穴现象(cavitations)的空泡结构(图2);Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;细胞凋亡的晚期,细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。 图2

生物检查法

1 1 0 0 生物检查法 1 1 0 1无菌检查法 无菌检查法系用于检査药典要求无菌的药品、生物制 品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。 无菌检查应在无菌条件下进行,试验环境必须达到无菌 检査的要求,检验全过程应严格遵守无菌操作,防止微生物污染,防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区、工作台面及环境应定期按医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度确认。隔离系统应定期按相关的要求进行验证,其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。日常检验还需对试验环境进行监控。 培养基 硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌的培养,也可用于 需氧菌的培养;胰酪大豆胨液体培养基用于真菌和需氧菌的培养。 培养基的制备及培养条件 培养基可按以下处方制备,亦可使用按该处方生产的符 合规定的脱水培养基或成品培养基。配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在2〖25°C、避光

的环境,若保存于非密闭容器中,一般在3 周内使用;若保存于密闭容器中,一般可在一年内使用。 1. 硫乙酵酸盐流体培养基 胰酪胨 15_ 0g 氣化钠 2. 5g 酵母浸出粉5. 0g 新配制的0. 1 % 刃天 无水葡萄糖 5.0g 青溶液1.0ml L-胱氨酸 0. 5g 琼脂0. 75g 硫乙醇酸钠0.5g 水1000ml (或硫乙醇酸)(0_3ml) 除葡萄糖和刃天青溶液外,取上述成分混合,微温溶 解,调节p H 为弱碱性,煮沸,滤清,加人葡萄糖和刃天青溶液,摇匀,调节p H , 使灭菌后在2 5 ° C的p H 值为 7.1 土0.2。分装至适宜的容器中,其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层(粉红色)不超过培养基深度的1/2。灭菌。在供试品接种前,培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5,否则,须经100°C水浴加热至粉红 色消失(不释过2 0分钟),迅速冷却,只限加热一次,并防止被污染。 除另有规定外,硫乙醇酸盐流体培养基置3 0〖3 5 C 培养。 2.胰酪大豆胨液体培养基 胰酪胨1 7 .0g 氣化钠 5.0g

细胞凋亡检测方法

细胞凋亡检测方法 一、细胞凋亡的形态学检测 1 光学显微镜和倒置显微镜 (1)未染色细胞:凋亡细胞的体积变小、变形,全面皱缩,细胞膜完整但出现发泡现象,细胞凋亡晚期可见凋亡小体,凋亡小体为数个圆形小体围绕在细胞周围。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 (2)染色细胞: 姬姆萨(Giemsa)染色、瑞氏染色等:正常细胞核色泽均一;凋亡细胞染色质浓缩、边缘化,核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态;坏死细胞染色浅或没染上颜色。 苏木素-伊红(HE)染色:细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色、胞浆呈淡红色(凋亡细胞),正常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色,坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失。 2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 常用的DNA特异性染料有:Hoechst 33342,Hoechst 33258,DAPI。三种染料与DNA 的结合是非嵌入式的,主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。 Hoechst是与DNA特异结合的活性染料,能进入正常细胞膜而对细胞没有太大细胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高。 DAPI为半通透性,用于常规固定细胞的染色。 PI和Hoechst33342双标:PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA(或RNA)结合。但PI不能通过正常细胞膜,Hoechst则为膜通透性荧光染料,故细胞在处于坏死或晚期调

亡时细胞膜被破坏,这时可为PI着红色。正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色,但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形,淡兰色,内有较深的兰色颗粒;而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色,或核呈分叶,碎片状,边集。故PI着色为坏死细胞;亮兰色,或核呈分叶状,边集的Hoechst着色的为调亡细胞。 凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩。细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期:Ⅰ期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased),部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体(图1)。 3 透射电子显微镜观察 凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期(pro-apoptosis nuclei)的细胞核内染色质高度盘绕,出现许多称为气穴现象(cavitations)的空泡结构(图2);Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;细胞凋亡的晚期,细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。 二、磷脂酰丝氨酸外翻分析(Annexin V法) 磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine, PS)正常位于细胞膜内侧,但在细胞凋亡早期,PS可从细胞膜内侧翻转到细胞膜表面,暴露在细胞外环境中。磷脂酰丝氨酸的转位发生在凋亡早期阶段,先于细胞核的改变、DNA断裂、细胞膜起泡。体内的吞噬细胞可通过识别

细胞凋亡的几种检测方法

细胞凋亡的几种检测方 法 Company number:【WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998】

细胞凋亡的几种检测方法 1、形态学观察方法 (1)HE(苏木精—伊红染色法)染色、光镜观察:凋亡细胞呈圆形,胞核深染,胞质浓缩,染色质成团块状,细胞表面有“出芽”现象。 (2)丫啶橙(AO)染色,荧光显微镜观察:活细胞核呈黄绿色荧光,胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧,可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 (3)台盼蓝染色:如果细胞膜不完整、破裂,台盼蓝染料进入细胞,细胞变蓝,即为坏死。如果细胞膜完整,细胞不为台盼蓝染色,则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性,区别坏死细胞有一定的帮助。 (4)透射电镜观察:可见凋亡细胞表面微绒毛消失,核染色质固缩、边集,常呈新月形,核膜皱褶,胞质紧实,细胞器集中,胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 2、 DNA凝胶电泳 细胞发生凋亡或坏死,其细胞DNA均发生断裂,细胞内小分子量DNA片断增加,高分子DNA减少,胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规

律的发生在核小体之间,出现180-200bpDNA片断,而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断,利用此特征可以确定群体细胞的死亡,并可与坏死细胞区别。 正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状(LADDER)条带;坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带 3、酶联免疫吸附法(ELISA)核小体测定 凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成,可由ELISA法检测。 检测步骤 1、将凋亡细胞裂解后高速离心,其上清液中含有核小体; 2、在微定量板上吸附组蛋白体’ 3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘ 4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’ 4、加酶的底物,测光吸收制。 用途 该法敏感性高,可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器,

表面微生物检测方法[1]

空气、食品接触面微生物检验方法、检验标准 1、目的: 检测生产车间空气、操作人员手部、与食品有直接接触面的机械设备的微生物指标,生产区域环境当中病原微生物的监控,达到规定标准,以控制食品成品的质量。 2、参照标准: 中华人民共和国国家标准《一次性使用卫生用品卫生标准》GB15979-1995、《HACCP原理与实施》、中华人民共和国国家标准《公共场所空气微生物检验方法细菌总数测定》GB/T 18204.1-2000、中华人民共和国进出口商品检验行业标准SN 0169-92/SN 0172-92/ SN 0170-92、出入境检验检疫局二000四年《出入食品微生物检验培训教材》中《出入食品生产厂卫生细菌检验方法》、日本东京冷冻食品检验方法。 3、采样与检测方法: 3.1空气的采样与测试方法 3.1.1样品采集: (1)取样频率: a)车间转换不同卫生要求的产品时,在加工前进行采样,以便了解车间卫生清扫消毒情况。 b)全厂统一放长假后,车间生产前,进行采样。 c)产品检验结果超内控标准时,应及时对车间进行采样,如有检验不合格点,整改后再进行采样检验。 d)实验性新产品,按客户规定频率采样检验。 e)正常生产状态的采样,每周一次。 (2)采样方法 在动态下进行,室内面积不超过30 m2,在对角线上设里、中、外三点,里、外点位置距墙1 m;室内面积超过30 m2,设东、西、南、北、中五点,周围4点距墙1 m。采样时,将含平板计数琼脂培养基的平板(直

径9 cm)置采样点(约桌面高度),并避开空调、门窗等空气流通处,打开平皿盖,使平板在空气中暴露5 min。采样后必须尽快对样品进行相应指标的检测,送检时间不得超过6h,若样品保存于0~4℃条件时,送检时间不得超过24h。 3.1.2菌落培养: (1)在采样前将准备好的平板计数琼脂培养基平板置37℃±1℃培养24 h,取出检查有无污染,将污染培养基剔除。 (2)将已采集样品的培养基在6 h内送实验室,细菌总数于37℃±1℃培养48h观察结果,计数平板上细菌菌落数。 (3)菌落计算: a) 记录平均菌落数,用“个/皿”来报告结果。用肉眼直接计数,标记或 在菌落计数器上点计,然后用5~10倍放大镜检查,不可遗漏。 b) 若培养皿上有2个或2个以上的菌落重叠,可分辨时仍以2 个或2个 以上菌落计数。 3.2工作台(机械器具)表面与工人手表面采样与测试方法: 3.2.1样品采集: (1)取样频率: a)车间转换不同卫生要求的产品时,在加工前进行擦拭检验,以便了解车 间卫生清扫消毒情况。 b)全厂统一放长假后,车间生产前,进行全面擦拭检验。 c)产品检验结果超内控标准时,应及时对车间可疑处进行擦拭,如有检验 不合格点,整改后再进行擦拭检验。 d)实验新产品,按客户规定擦拭频率擦拭检验。 e)对工作表面消毒产生怀疑时,进行擦拭检验。 f)正常生产状态的擦拭,每周一次。 (2)采样方法: a) 工作台(机械器具):用浸有灭菌生理盐水的棉签在被检物体表面(取 与食品直接接触或有一定影响的表面)取25cm2的面积,在其内涂抹10次,然后剪去手接触部分棉棒,将棉签放入含10mL灭菌生理盐水的

桩身完整性的评价方法讨论

桩身完整性的评价方法讨论 摘要:本文根据桩身完整性检测目前桩基工程验收的一项必备资料,主要表现在桩类划分依据,桩类名称方面。 关键词:桩的波速;桩身质量;测试对比 1前言 桩身完整性检测目前已作为桩基工程验收的一项必备资料,甚至作为主要验收资料来验收。但在检测报告中对桩的评价方面,其方法、标准及名称不一,致使有关各方对检测结果的理解不同,从而导致存在质量事故的隐患及桩基工程验收工作的混乱。其主要表现在桩类划分依据、桩类名称等方面: 1.1桩类划分依据方面 根据评价的依据不同,即在评价依据上,目前应力波反射法的评价方法可主要大致分为缺陷类、波速类、强度类,如波速类评价方法是以所测的整桩波速作为桩的评价分类标准,根据波速的大小对桩进行评价分类,其比较有代表的分类标准为:>4120m/s优质;4120-3300m/s;3300-2750m/s可疑;1900-m/s较差;<1920m/s很差。 1.2桩类名称方面 在桩类别的划分上,表现为分类的级别数不同、桩类名称众多,如有的分为“优质(优良/很好/完整)、良好(较好)、合格(一般/尚可/轻微缺陷)、较差(可疑/局部缺陷)、不合格(很差/报废/严重缺陷)”等五类,甚至有的仅分为“合格、不合格”两类。 2问题讨论 2.1应力波反射法的检测对象和内容 由动测法检测桩的完整性的基本原理和做法看出,应力波反射法检测的对象仅仅是桩基础组成之一——桩(或基桩)而不是整个桩基础,因此,应力波反射法仅能对所检测的对象即基桩进行评价而不能评价整个桩基工程,利用应力波反射法检测“XX桩基工程”或将整个桩基工程质量评为“优良”或“不合格”,这是基本概念的混淆和错误。根据应力波反射法的基本原理,应力波反射法所能检测的内容仅仅是桩身阻抗相对变化情况,其检测结果也就仅能对桩的桩身阻抗变化情况进行评价,用应力波反射法涌测试的内容如桩的承载力等来对桩进行评价显然是与其基本原理相违背的。另外,工程桩的验收包括诸多方面,如对于钻孔灌注桩而言,就包括成孔尺寸、原材料检验、混弹簧土试块强度、钢筋笼尺寸、桩的位置、桩垂直度等方面当然桩身完整性及桩的承载力也包括在内,单对某一

细胞凋亡的几种检测方法

细胞凋亡的几种检测方法 1、形态学观察方法 (1)HE(苏木精—伊红染色法)染色、光镜观察:凋亡细胞呈圆形,胞核深染,胞质浓缩,染色质成团块状,细胞表面有“出芽”现象。 (2)丫啶橙(AO)染色,荧光显微镜观察:活细胞核呈黄绿色荧光,胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧,可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 (3)台盼蓝染色:如果细胞膜不完整、破裂,台盼蓝染料进入细胞,细胞变蓝,即为坏死。如果细胞膜完整,细胞不为台盼蓝染色,则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性,区别坏死细胞有一定的帮助。

(4)透射电镜观察:可见凋亡细胞表面微绒毛消失,核染色质固缩、边集,常呈新月形,核膜皱褶,胞质紧实,细胞器集中,胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 2、DNA凝胶电泳 细胞发生凋亡或坏死,其细胞DNA均发生断裂,细胞内小分子量DNA片断增加,高分子DNA减少,胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间,出现180-200bpDNA片断,而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断,利用此特征可以确定群体细胞的死亡,并可与坏死细胞区别。正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状(LADDER)条带;坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带 3、酶联免疫吸附法(ELISA)核小体测定

凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成,可由ELISA法检测。 检测步骤 1、将凋亡细胞裂解后高速离心,其上清液中含有核小体; 2、在微定量板上吸附组蛋白体’ 3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘ 4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’ 4、加酶的底物,测光吸收制。 用途 该法敏感性高,可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器,

细胞凋亡的检测(含图片) 陈英玉

细胞凋亡的检测 细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式,根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别,可以将二者区别开来。细胞凋亡的检测方法有很多,下面介绍几种常用的测定方法。 一、细胞凋亡的形态学检测 根据凋亡细胞固有的形态特征,人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。 1 光学显微镜和倒置显微镜 (1)未染色细胞:凋亡细胞的体积变小、变形,细胞膜完整但出现发泡现象,细胞凋亡晚期可见凋亡小体。 贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 (2)染色细胞:常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化,核膜裂解、染色质分割 成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。 2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 常用的DNA特异性染料有:HO 33342 (Hoechst 33342),HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种染料与DNA的结合是非嵌入式的,主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。 Hoechst是与DNA特异结合的活性染料,储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度,使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。 DAPI为半通透性,用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度,使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。 结果评判:细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期:Ⅰ期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased),部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体(图1)。

工程桩应进行单桩承载力和桩身完整性抽样检测

复合地基荷载试验要点 1、复合地基荷载试验用于测定承压板下应力主要影响范围内复合土层的承载力和变形参 数。复合地基荷载试承压板应具有足够风度。单桩复合地基载荷试验的承压板可用圆形或方形。 面积为一根桩承担的处理面积:多桩复合地基荷载试验的承压板可用方形或矩形,其尺寸按实际桩数所承担的处理面积确定。桩的中心(或形心)应与承压板中心保持一致,并与荷载作用点相重合。 2、试验加载等级可分为8~12级。最大加载压力不应小于设计要求压力值2倍,每加一级 荷载前后均应各读记承压板沉降量一次,以后每半个小时读记一次。当一小时内沉降量小于0.1mm,即可加下一级荷载。 3、当出现下列现象之一可终止试验。 ①沉降急剧增大,土被挤出或承压板周围出现明显的隆起; ②承压板的累计沉降量已不于其宽度或直径的6%; ③当达不到极限荷载,而最大加载压力已不子设计要求压力值的2倍。 4、复合地基承载力特征的确定: ①当压力一沉降曲线上极限荷载能确定,而其值不小于对应比例界限的2倍时,可取比例界限;当其值小于对应比例界限的2倍时,可取极限荷载的一半; ②当压力一沉降曲线是平缓的光滑曲线时,可按相对变形值确定,按相对变形值确定的承载力特征值不应大于最大加载压力的一半。 5、试验点数不少于3点。 工程桩应进行单桩承载力和桩身完整性抽样检测。 基桩检测方法应根据检测目的按表选择。 检测方法及检测目的

桩身完整性宜采用两种或两种以上的检测方法进行检测。 基桩检测除应在施工前和施工后进行外,尚应采取符合本规范规定的检测方法或专业验收规范规定的其他检测方法,进行桩基施工过程中的检测,加强施工过程质量控制。 检测工作程序 检测工作的程序,应按图进行: 接受委托 调查、资料收集阶段宜包括下列内容: 1收集被检测工程的岩土工程勘察资料、桩基设计图纸、施工记录;了解施工工艺和施工中出现的异常情况。 2进一步明确委托方的具体要求。 3检测项目现场实施的可行性。 应根据调查结果和确定的检测目的,选择检测方法,制定检测方案。检测方案宜包含以下内容:工程概况,检测方法及其依据的标准,抽样方案,所需的机械或人工配合,试验周检测前应对仪器设备检查调试。 检测用计量器具必须在计量检定周期的有效期内。 检测开始时间应符合下列规定: 1当采用低应变法或声波透射法检测时,受检桩混凝土强度至少达到设计强度的70%,且不小于15MPa。 2当采用钻芯法检测时,受检桩的混凝土龄期达到28d或预留同条件养护试块强度达到设计强度。 3承载力检测前的休止时间除应符合第2款规定外,尚不应少于表规定的时间。 休止时间

细胞凋亡检测方法

细胞凋亡的检测方法 一、细胞凋亡概念: 细胞凋亡是指为维持内环境的稳定,有基因控制的细胞自主的程序性死亡。 细胞凋亡不是一件被动的过程,而是主动过程,它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用;它并不是病理条件下,自体损伤的一种现象,而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。 细胞凋亡与胚胎发育、自身免疫耐受、肿瘤发生、病毒感染等生理、病理过程密切相关,近年来一直是生物医学领域各专业的研究热点。选择合适的凋亡检测方法是研究细胞凋亡研究的关键。 二、细胞凋亡的检测方法: 1. 磷酯酰丝氨酸(PS)外翻法(Annexin V 法) 在凋亡细胞中,磷酯酰丝氨酸 (PS) 从质膜内侧转移到外侧,暴露在细胞外环境中。 荧光基团或荧光蛋白标记的膜联蛋白V 可与暴露在质膜外侧的PS 结合,用于识别凋亡细胞。碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V 与PI 匹配使用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。 应用实例:以FITC Annexin V/ PI Apoptosis Kit 为例子 2. Caspase-3活性的检测: 半胱氨酸蛋白酶caspase 家族蛋白的激活是凋亡进程中的一个必要的决定性事件。其中caspase-3的激活在凋亡信号传导的许多途径中发挥着关键的作用。Caspase-3正常以酶原(32KDa )的形式存在于胞浆中,在凋亡的早期阶段,它被激活,活化的Caspase-3由两个大亚基(17KDa )和两个小亚基(12KDa )组成, 图1. 使用10 μM 喜树碱处理Jurkat 细胞4 小时作为阳性实验组(右图),同时设置未处理组做阴性对照(左图)。使用FITC Annexin V/ PI Apoptosis Kit 对以上两组细胞进行相应的实验处理,流式细胞仪进行观察。

桩身完整性检测技术规定(内部)

桩身完整性检测技术规定(内部) 一、编制的主要依据 1、《建筑地基基础设计规范》(GB50007-2002) 2、《建筑地基基础设计规范》(DBJ50-047-2006) 3、《建筑桩基检测技术规范》(JGJ106-2003、J256-2003) 4、《建筑桩基技术规范》(JGJ106-94) 二、一般情况下的检测数量及方法(D表示桩径) (一)柱下单桩 检测数量:全数检测 检测方法: 1、大直径灌注桩 (1)当800mm1200MM ②地基基础设计等级为甲级 ③地质条件复杂,成桩质量可靠性较低. 2、非大直径灌注桩 采用低应变法全数检测。 注:筒体筏板下多桩的检测按柱下单桩要求执行。 (二)柱下多桩

检测数量:每个承台下的抽检桩数不得少于一根。 检测方法:按(一)条检测方法执行。 (三)墙(承台梁)下多桩 检测数量: 1、地基基础设计等级为甲级,或地质条件复杂、成桩质 量可靠性较低的灌注桩,抽检数量不少于总桩数的30%(不得少于20根)。 2、其他桩基工程抽检数量不少于总桩数的20%(不得少 于10根)。 3、地下水位以上且终孔后桩端持力层已通过核验的人工 挖桩,抽检数量不少于总桩数的10%(不少于10根)。检测方法:按(一)条检测方法执行。 三、当发现检测数据异常时,不得随意进行处理,应查 找原因,重新组织检测,必要时还可根据实际情况采 用其它适宜的方法进行验证检测。 四、当工程出现特殊情况时,桩身完整性检测方案应专 题研究后进行编制,按程序审批通过后方可实施。 重庆市万州区建设工程质量监督站 二00七年七月十九日

TUNEL法检测细胞凋亡

针对问题2( TUNEL法的实验原理是什么?): 基本原理:对不同组织切片先增加细胞膜通透性,然后让rTDT和bio标记的dUTP进入细胞内,在rTDT的辅助下dUTP与核断裂的DNA 3’-OH结合,再用HRP标记的链霉亲和素与dUTP上的biotin结合(每个链霉亲和素至少可以再结合3个biotin分子),最后用DAB、过氧化氢与SP上的辣根过氧化物酶HRP发生氧化、环化反应,形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色,最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。 工作原理:简单说就是——TUNEL细胞凋亡检测试剂盒是用来检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况。 其原理是;生物素(biotin)标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT Enzyme)的作用下,可以连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3'-OH末端,并可与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素(Streptavidin-HRP)特异结合,在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺(DAB)的存在下,产生很强的颜色反应(呈深棕色),特异准确地定位正在凋亡的细胞,因而在普通显微镜下即可观察和计数凋亡细胞;由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有3'-OH形成,很少能够被染色。 针对问题3(TUNEL实验中几个关键步骤是什么?): 1. 充分脱蜡和水化。脱蜡可以先60度20min,再用二甲苯两次5~10min;而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗,这些以便后面的结合反应充分、均匀; 2. 把握好细胞通透的时间。一般根据切片的厚薄,选择蛋白酶k的孵育时间,常用10~30min,几um切片用短时间;几十um切片用长时间,通过摸索达到既不脱片,有能够使后面的酶和抗体进入胞内。 3. 适当延长TUNEL反应液的时间。一般是37度1h,你也可以根据你的凋亡损伤程度,选择更长的时间,可长至2h,但要结合你最终的背景着色。 4. DAB显色条件的选择。一般DAB反应10分钟左右,结合镜下控制背景颜色,最长不超过30min;我不喜欢用promega公司提供的DAB液(桃红色),不利于辨认棕褐色。

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