薄层色谱法测定标准操作规程

薄层色谱法测定标准操作规程

目的：建立薄层色谱法测定标准操作规程。（《中华人民共和国药典》2010版附录）

范围：适用于薄层色谱法的测定。

职责：检验员，QC主管。

内容：

1 简述：

薄层色谱法，是将适宜的固定相涂布于玻璃板上，成一均匀薄层。等点样、展开后，与适宜的对照物按同法所得的色谱图作对比，用以进行药品的鉴别，杂质检查或含量测定的方法。

2 仪器与材料：

2.1 薄层板：

2.1.1市售薄层板市售薄层板分普通薄层板和高效薄层板，按固定相种类又可分为硅胶G、硅胶GF254、硅胶H、微晶纤维素、硅藻土、氧化铝、聚酰胺薄膜等薄层板。

2.1.2 自制薄层板在保证色谱质量的前提下，如需对薄层板进行特别处理和化学改性，以适应供试品分离的要求时，也可用实验室自制的薄层板，自制薄层板系指手工（或借助涂布器）将固定相涂布于玻璃板或其他适宜载板上使成为有一定厚度的均匀薄层。常用的固定相有硅胶G、硅胶GF254、硅胶

H、微晶纤维素等，其粒径一般为10~40um。

2.2 点样器：采用手动、半自动或全自动点样器材，手动点样时一般采用微量毛细管。

2.3 展开容器：应使用适合薄层板大小的平底或双槽薄层色谱专用展开缸，并配有严密的盖子。水平展时使用专用水平展开缸。

2.4 显色与显色装置按各品种项下规定。可采用喷雾显色、浸渍显色或蒸气熏蒸显色，喷雾显色应使用玻璃喷雾瓶或专用喷雾器，要求用压缩气体使显色剂呈均匀细雾状喷出；浸渍显色可用玻璃容器或适宜的展开缸代替；蒸气熏蒸显色可用双槽展开缸或适宜大小的干燥器代替。

2.5 检视装置为装有可见光或紫外光（254nm及365nm）光源及相应的滤光片的暗箱，可附加摄像设备供拍摄色谱图用，暗箱内光源应有足够的光照度。

3 操作方法：

3.1 薄层板制备：

3.1.1 市售薄层板临用前一般应在110℃活化30min，聚酰胺薄膜不需活化。铝基片薄层板或聚酰胺薄膜均可根据需要剪裁，但须注意剪裁后的薄层板底边的涂层不得有破损，如在储放期间被空气中杂质污染，使用前可用甲醇、二氯甲烷与甲醇的混合溶剂在展开容器中上行展开预洗，取出，晾干，活化后使用。

3.1.2自制薄层板除另有规定外，将1份固定相和3份水或0.2%~0.5%羧甲基纤维素钠水溶液（取羧甲基纤维素钠适量，加水适量，放置使溶胀，加热煮沸至完全溶解，放置，取上清液，即得），在研钵中沿同一方向研磨混匀，去除表面的气泡后，置玻璃板上使涂布均匀，或倒入涂布器中，在玻板上平稳地移动涂布器进行涂布（涂层厚度为0.25、0.3或0.5mm）。取下涂好薄层的玻璃板，置水平台上

于室温下晾干，后在110℃烘30分钟。即置有干燥剂的干燥箱中备用。使用前检查其均匀度（可通过透射光和反射光检视）。

3.2 点样：除另有规定外，用点样器点样于薄层板上，一般为圆点，点样基线距底边2.0cm，点样直径为2——4mm，点间距离约为1.5—2.0cm，点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜。点样时必须注意勿损伤薄层表面。

3.3 展开：展开室如需预先用展开剂饱和，可在室中加入足够量的展开剂，并在壁上贴二条与室一样高、宽的滤纸条，一端浸入展开剂中，密封室顶的盖，使系统平衡或按正文规定操作。将点好样品的薄层板放入展开室的展开剂中，浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.5—1.0cm（切勿将样点浸入展开剂中），密封室盖，等展开至规定距离（一般为10—15cm），取出薄层板，晾干，按各品种项下的规定检测，如需用薄层扫描仪对色谱斑点作扫描检出，或直接在薄层上对色谱斑点作扫描定量，则可用薄层扫描法。薄层扫描的方法，除另有规定外，可根据各种薄层扫描仪的结构特点及使用说明，结合具体情况，选择吸收法或荧光法，用双波长或单波长扫描。由于影响薄层扫描结果的因素很多，故应在保证供试品的斑点在一定浓度范围内呈线性的情况下，将供试品与对照品在同一块薄层上展开后扫描，进行比较并计算定量，以减少误差。各种供试品，只有得到分离度和重现性好的薄层色谱，才能获得满意的结果。

4 系统适用性实验

按各品种项下要求对色谱条件进行系统适用性试验，即用供试品和对照物对色谱条件进行试验和调整，应达到规定的检测灵敏度、分离度和重复性等要求。

4.1 检测灵敏度用于限量检查时，采用供试品溶液和对照品溶液与稀释若干倍的对照品溶液在规定的色谱条件下，于同一薄层板上点样、展开、检视，后者应显清晰的斑点。

4.2 分离度用于鉴别时，供试品溶液与对照溶液色谱中相邻的斑点，均应清晰分离。采用薄层扫描仪扫描进行限量检查和含量测定时，要求定量峰与相邻峰之间有较好的分离度，分离度（R）的计算公式为：

R=2（d2-d1）/（w1+w2）

式中d2为相邻两峰中后一峰与原点的距离；

d1为相邻两峰中前一峰与原点的距离；

W1及w2为相邻两峰个各自的峰宽。

除另有规定外，分离度应大于1.0。

4.3 重复性用于含量测定时，同一供试品溶液在同一薄层板上平行点样，待测成分峰面积测量值的相对标准偏差应不大于3.0%；需显色后测定的相对标准偏差应不大于

5.0%。

5 测定法

5.1 鉴别取适宜浓度的供试品溶液与对照溶液，在同一薄层板上点样、展开与检视，供试品色谱所显斑点（或主板点）的颜色（或荧光）和位置（Rf）应与对照色谱的斑点一致。

5.2 限度检查采用定量配制的对照品溶液为对照，供试品色谱中待检查的斑点与对照品色谱的相应斑点比较，其颜色（或荧光）和大小，不得更深（或不得更强）和更大；或强薄层色谱扫描法操作，其峰面积值不得大于对照品的峰面积值。必要时应规定检查的斑点数和限量值。

5.3 含量测定照薄层色谱扫描法，测定供试品中相应成分的含量。

测定时可根据不同波长扫描仪的结构特点，按照规定凡是扫描测定，一般选择反射方式，采用吸收法或荧光法。扫描时，应沿展开方向扫描，不可横向扫描。除另有规定外，含量测定应使用市售薄层板。

按照各品种项下规定，扫描方法可采用单波长扫描或双波长扫描。如采用双波长扫描，应选用待测斑点无吸收或最小吸收的波长为参比波长，供试品色谱中待测斑点的比移值（Rf）、光谱扫描得到的

吸收光谱图或测得的光谱最大吸收与自小吸收波长应与对照品相符，以保证测定结果的准确性。

薄层色谱扫描用于含量测定时，通常采用线性回归两点法计算，如线性范围很窄时可采用多点线性回归法。供试品溶液和对照品溶液应交叉点于同一薄层板上，展开，扫描，测定和计算。每份供试品点样不得少于2个，对照品每一浓度点样不得少于2个。供试品斑点的量应在两个浓度对照品斑点的量之间，必要时可适当调整供试品溶液的点样量。2份平行测定数据的相对平均偏差应不大于5%。

6 注意事项：

6.1 薄层板的活化与保存自制薄层板和市售薄层板在使用前一般应进行活化，活化后的薄层板应立即于置有干燥剂的干燥器中保存，保存时间不宜过长，做好随用随制，放入干燥器中保存仅作为使用前的一种过渡。

6.2 供试品溶液的备注建立方法时应选择适宜的溶剂进行提取，杂质较多时，应选择适宜的方法进行前出来了。以克服薄层色谱背景较深，斑点不清晰的现象。

6.3 点样一般手动点样时，溶剂选择是否合适，影响点样远点及分离后斑点的性状，因此一般选择极性小的溶剂；若使用极性较大的溶剂反复点样时，应待每次点样溶剂挥干后再点时应注意避免加热，以免对检测成分的破坏。

薄层板上样品容积的负荷量极为有限，普通薄层板的点样量在10μl一下为宜，高效薄层板在5μl一下。点样量过多可造成原点“超载”，展开剂产生绕行现象，使斑点拖尾或造成与对照斑点比移植不一致的现象。对相对湿度要求严格的品种，可将点样后的薄层板放入特点相对湿度的器皿中，密闭一定时间后取出，立即依法展开。点样时必须勿损坏薄层表面。

6.4 点样环境实验环境的相对湿度和温度对薄层分离效果有着较大的影响（实验室一般要求相对湿度在65%以下为宜），因此应保持实验环境的相对恒定。对温、湿度要求较高的品种必须按品种项下的规定，严格控制实验环境的温、湿度。

6.5 展开展开缸预先饱和可避免边缘效应。展开距离不宜过长。除另有规定外，通常为10cm以下。

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