转基因植物产品检测实验室一览

转基因植物产品检测实验室一览

序号仪器名称用途参考品牌型号与配置大大致预算

1 高速冷冻离心机生物样品的高速分离

（冷冻保持样品生活

活性）。

德国eppendorf；美国

Thermo；德国Sigma；

德国Herolab。

50000 120000

2 定性PCR扩增仪

微量基因片段

（DNA/RNA）的扩增

德国Peqlab、美国ABI、

德国eppendorf、美国

Bio-rad。

50000 110000

定量CR扩增仪

（荧光定量PCR）

扩增的同时对基因片

段做定量检测。

美国ABI、德国

eppendorf、美国

Bio-rad。

250000 780000

3 PCR专用工作台保证PCR时的无污

染。（或建设标准的

PCR层流实验室）

德国Peqlab。

（国产超净台也可替

代。）

10000 34000

4 电泳槽、电泳

仪

基因片段扩增之后跑

凝胶。

德国Peqlab、美国

Bio-rad。或北京六一。

15000 40000

5 凝胶成像系统对凝胶进行分子量、

等定性分析

法国VL，美国Bio-rad、

或国产。

350000 150000

6 紫外透射仪国产6000 15000

7 制冰机国产20000 35000

8 CO2培养箱美国Tehrmo。美国

shellab

20000 50000

9 液氮罐国产。4000 10000

10 超纯水

美国millipore；美国

Tehrmo。

40000 76000 双蒸馏水发生

器

国产

4000 18000

11 分子生物常用耗

材与试剂

5000 10000

12 转基因专用试剂5000 10000

其他设备：

细胞融合仪、核酸提取仪、紫外分光光度计、核酸蛋白检测仪磁力搅拌机杂交仪、-30℃低温冰箱、超低温冰箱、漩涡混合器、超声波细胞粉碎仪、自动恒温酶标。

7 操作步骤

抽样

参照NY/T672 转基因植物及其产品检测通用要求和NY/T673 转基因植物及其产品检测抽样。

制样

参照NY/T672 转基因植物及其产品检测通用要求和NY/T673 转基因植物及其产品检测抽样（按照GB 5491中四分法制备样品进行送检）。

DNA模板的制备

a称取200-400 mg试样，在液氮中磨碎，装入已经用液氮预冷的ml离心管中。

b加入1ml预冷至4 ℃的抽提液，剧烈摇动混匀后，在冰上静置5分钟，用13 000 r/min离心机，4 ℃离心15 min，弃去上清液。

c加入600 μl 预热到65 ℃的抽提裂解液，用玻棒搅拌上下颠倒充分混匀，在65 ℃的水浴锅中裂解40 min。

d用13 000 r/min离心机室温离心10 min，将上清液转至另一离心管中，加入5 μl RNase A （10 mg/ml），

37 ℃水浴30 min。

e分别用等体积苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）和氯仿：异戊醇（24：1）各抽提一次。

f用13 000 r/min离心机室温离心10 min，将上清转至另一离心管中。加入2/3体积异丙醇，1/10 体积3M乙酸钠（pH ），-20 ℃放置2-3 h，充分沉淀DNA。

g13 000 r/min，4 ℃离心15 min，用70%乙醇洗沉淀一次，倒出乙醇，晾干DNA。加入50 μl TE（）溶解DNA。

h把DNA溶液浓度用重蒸馏水调制为100ng/μl，储存于-20 ℃备用。

注意：

I 1 g试样（如棉花种子）提取的DNA量应不小于200 μg。

II DNA的OD260/OD280的比值应在左右，且OD260的值应在曲线的最高峰。

PCR反应

7.4.1 试样的PCR反应

在PCR反应管中按表1依次加入反应试剂, 用手指轻弹混匀，再加约50 μL石蜡油（有热盖设备的PCR仪可以不加石蜡油）。每个试样3次重复。

在台式离心机离心10s后，将PCR管插入PCR仪中。95℃变性5 min；进行35次循环扩增反应（Sad1基因、nos终止子、CaMV35S启动子：94℃,30 s；56℃,30 s；72℃,30s；cry1Ac基因、cry1Ab基因、以及cry1Ac与cry1Ab融合基因：94℃,1 min；56℃, 1 min；72℃, 1 min ）；然后72℃恒温7 min，取出PCR反应管，对反应产物进行电泳检测或在4℃下保存。

表1 PCR反应体系

试剂终浓度单样品体积

ddH2O

10×PCR 缓冲液1× 5 µl

25 mM MgCl2mM 5 µl

10 mM dNTPs mM 1 µl

10 µM Primer 1 µM µl

10 µM Primer 2 µM µl

5 U/µl Taq 酶U/µl µl

100 ng/µl DNA 模板 5 ng/µl µl

总体积50 µl

7.4.2 对照的PCR反应

在试样PCR反应的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照。