电镜实验报告

贴壁培养细胞表面形貌的扫描电镜观察

【实验目的】

1.了解扫描电镜生物样品制备的基本过程

2.了解扫描电镜的基本操作

【实验原理】

扫描电镜的基本原理：扫描电子显微镜是以能量为1-30KV间的电子束，以光栅状扫描方式照射到被分析试样的表面上，利用入射电子和试样表面物质相互作用所产生的二次电子和背散射电子成象，获得试样表面微观组织结构和形貌信息。

其核心是电子光学系统，又分为两个部分：电子枪和透镜系统。

电子枪：提供电子束。来自热阴极或场发射阴极的电子被1-30KV的电压加速，由阳极孔射出，形成一交叉电子束。其交叉斑对于热阴极为10-50μm，对于场发射阴极为10-100nm。

透镜系统：由两个或三个电磁透镜组成，改变透镜的励磁电流可连续调节透镜的焦距，在透镜系统的作用下，能将电子枪形成的电子束交叉斑缩小，在样品的表面形成最小直径为3-10nm的电子束照射斑。

（图1）扫描电镜的基本构造示意图

相互作用：当电子束轰击样品表面时，一部分的能量转变成热能，还有部分的能量由于电子与样品原子的相互作用而发射出各种有用的信息，其中包括二次电子、背散射电子、俄歇电子等等。

二次电子：入射电子使样品原子激发所产生的电子，能量较低，一般小于50eV。具体来讲，它是由入射电子与核外松散的被束缚的外层电子之间发生非弹性散射的结果。松散的外层电子由于入射电子能量的降低而获得一定能量而脱离原有的轨道，而为人们所探测

到；但如果它们产生在样品表面以下100?的地方，则这些二次电子被样品强烈吸收，难以逃逸。因此二次电子反映样品表面以下100?的一个薄区域的情况。

成像原理：来自扫描发生器的扫描信号分别送给电子光学系统的扫描线圈和显象管的扫描线圈，让电子束与显象管的阴极射束做同步扫描，使阴极射束在荧光屏上的照射点与电子束在样品上的照射点一一对应，样品上的物点在电子束作用下所产生的信号被检测器随时检出，经视频放大器放大后控制显象管阴极射束的强度使荧光屏上象点的亮度受试样上物点所产生的信号的大小的调制，从而得到与样品性质有关的图象。

临界点干燥：临界点干燥技术是实验室中为保持较好的样品外形而常用的一种干燥方法，因为细胞或者组织如果在空气或真空环境中进行干燥，待观测表面将会塌陷或遭受其他损伤。干燥过程中，我们常用临界点较低的液化气体，一般采用液态CO2 取代乙酸异戊酯，然后升温，让液体瞬间汽化，将样品表面的其他物质都带走，实现干燥操作。

干燥器：主体是一个集成有加热冷却夹套的压力干燥器，干燥器上装有各种控制阀、温度计、压力表和支架，圆柱舱的一端装有可拆式观察窗，另一端装有可拆式进样门等等。在使用临界点干燥液取代载液乙酸戊酯之后，关闭所有阀门，开始水浴加热。此时，液/气弯界面将扩散消失，舱内仅剩下气体。稍稍开启排气阀，待气体排出后，组织样本的干燥即完成。

【实验仪器、材料、试剂及用品】

1) 仪器：扫描电镜（HITACHI S-4800）、临界点干燥仪（HITACHI HCP-2）、离子溅射镀膜仪（EIKO IB-3）

2) 材料：贴壁培养细胞（HeLa细胞）

3) 试剂：2.5%戊二醛溶液、磷酸缓冲液、乙酸异戊酯、乙醇、双蒸水等

4) 用品：培养皿、盖玻片、镊子、移液器、双面胶带、扫描电镜样品台等

【实验步骤】

1）取样、清洗：对多数的生物材料而言，要经过扫描电镜观察其表面，首先必须采用化学或物理方法将其固定、脱水和干燥，然后喷金以提高材料的导电性和二次电子产额。第一步则是将培养好的样品放入小培养皿中，用0.1mol/l的磷酸缓冲液把样品表面的附着物清洗干净。

2）固定：用移液枪取1ml的2.5%的戊二醛溶液固定1h，然后用0.1mol/l的磷酸缓冲液再次清洗。（理论上也可用1%的四氧化锇单固定，四氧化锇也可以良好地保存组织细胞

结构，增加材料的导电性和二次电子产额，提高扫描电子显微图像的质量。）

3）脱水、置换：用磷酸溶液和蒸馏水清洗之后，换用30%、50%、70%、80%、90%、95%、以及无水乙醇进行脱水处理，每次用移液枪注入1ml的液体，刚好浸没样品，换液时将原来的液体吸出，换上新的液体，每次干燥10分钟左右。然后再用乙酸异戊酯置换酒精，大约10分钟，将乙酸异戊酯移出。

4）干燥：临界点干燥法，将样品小心移入小样品盒中，将盖子盖好，然后放入干燥器的样品室，盖上盖子，然后打开阀门，注入60%左右的液体二氧化碳，关上阀门，在温度相对较低的情况下，让二氧化碳充分的溶解替换乙酸异戊酯，然后加热至35至40℃，让液体汽化，然后打开排气管，缓慢排气，直到压强降到一个大气压为止。

5）喷镀金属：将干燥的样品用导电性好的粘合剂或其他粘合剂粘在金属样品台上，然后放在真空蒸发器中喷镀一层金属膜,以提高样品的导电性和二次电子产额，改善图像质量，并且防止样品受热和辐射损伤。

6）显微成像：将样品小心放到扫描电镜操作台上显微成像，通过旋钮调焦，找到细胞，观察，照相。

【实验结果】

（图2）显微照相HeLa细胞

（图3）显微照相HeLa细胞

通过以上两张非常具有立体感的照片，我们可以看出细胞紧贴着盖玻片生长，几乎形成一片薄膜，且边缘有丝状延伸；细胞表面有很多微小的绒毛以及突起。

【结果分析】

1）表面裂痕：可能是由于干燥造成的损伤。Hela细胞贴壁生长的那一部分几乎只剩下细胞膜，容易断裂，特别是在经过多次脱水干燥之后。

2）丝状延伸：分析有可能是为吸附盖玻片所形成，经过脱水、干燥，细胞膜紧紧吸附玻璃表面。

3）微绒毛：极小的绒毛有可能就是细胞膜磷脂双分子层表面的成像，稍大一点的片状或条状的突起有可能是细胞表面的糖类物质，其识别通讯等作用。

4）瘤状突起：有可能只是细胞本身的形态，也有可能是外来物质诱发了细胞的胞吞和胞吐；通过大小的对比，也不能排除是微生物入侵细胞的可能。

【注意事项】

1 将样品待观察面向上放入临界点干燥室，在这之前一定要将多余的乙酸异戊酯事先吸收掉。

2 如果注液态二氧化碳的量过少，则压力大不到临界赶早点的要求；如果量过多则压

力过大，对实验仪器或者排气时间也有影响。所以注入的液体要适量，最好在60%左右。

3 排气阀和排液阀的作用是在进行液化气取代时实现充分的混合。如果要达到最佳的干燥效果，必须将组织样本中的载液完全去除并排出舱体。如果进液阀和排气（或排液）阀同时开启，舱内会立即产生湍流和奔涌。

4 为了确保样本不会出现液体二次凝结，我们建议在此操作时将温度控制于临界点之上至少5°C

5 扫描电镜样品的制备，必须满足以下要求：保持完好的组织和细胞形态；充分暴露欲观察的部位；良好的导电性和较高的二次电子产额；保持充分干燥的状态。