荧光定量PCR仪操作指南eppendorf
目录：
1 安全预防法
2 安装
2.1 交货包装
2.2 仪器的安装
2.3 功能性单元
2.3.1 Mastercycler ep realplex
2.4 启动
2.4.1 realplex模块与热模块之间的连接
2.4.2 Mastercycler ep realplex 与计算机之间的连接2.4.3 与其它部件的连接
2.4.4 realplex软件的安装
2.4.4.1 安装主程序
2.4.4.2 数据恢复
2.4.4.3 开始realplex软件的运行
3. 操作
3.1 管理者登陆
3.2 登陆
3.3 用户变更
3.4 系统配置
3.4.1 对使用者的管理
3.4.1.1 新用户建立
3.4.1.2 编辑用户
3.4.1.3删除用户
3.4.2 用户层
3.4.3 循环仪
3.4.4 realplex 模块
3.4.5 系统层
3.4.5.1 特性
3.4.5.2 登陆出错信息
3.4.5.3 用户登陆
3.4.5.4 软件更新
3.5 检测项目管理
3.5.1 建立检测项目
3.5.2 打开检测项目
3.5.3 保存检测项目
3.5.4 保存模板文件
3.5.5 模板文件的使用
3.5.6 复制检测项目
3.5.7 检测项目的输出
3.5.8 检测项目的输入
3.5.9 建立文件夹
3.5.10 删除检测项目和文件夹
3.6 探针管理
3.7 染料管理
3.8 校准
3.8.1 背景校准
3.8.2 颜色校准
3.8.2.1 使用商业的校准工具包进行的颜色校准3.8.2.2 客户特有的染料的校准
3.9 数据库管理
3.9.1 当前数据库的自动保存
3.9.2 当前数据库的保存
3.9.3 输入数据库
3.9.4 数据库的归档
4 编程（检测项目的建立）
4.1 建立一个新的检测项目
4.2 建立板布局
4.2.1 染料的确定
4.2.2 参考染料的选择
4.2.3 样本容积输入
4.2.4 探针类型的确定
4.2.5 背景的确定
4.2.6 样品类型的定义
4.2.6.1 标准
4.2.6.2 阳性对照
4.2.6.3 阴性对照
4.2.6.4 未知样品
4.2.7 复制和标准系列的自动建立
4.2.8 定量的样品类型
4.2.9 相对定量的样品类型
4.2.9.1 多plex分析例子
4.2.9.2 单plex分析的例子
4.2.10 熔点分析中的样品类型
4.2.11 终点测定中的样品类型
4.2.12 +/-检测项目中的样品类型
4.2.13 基因辨识中的样品类型
4.2.12 样品的复制与剪切
4.2.15 删除样品
4.2.16 几个样品的归组
4.2.17 子检测项目的测定
4.2.18 板布局的删除
4.2.19 完整检测项目的板布局编辑
4.3 pcr程序的建立
4.3.1 用模板程序建立一个pcr程序
4.3.2 不用模板程序建立pcr程序
4.3.3 程序步的插入和编辑
4.3.3.1 温度
4.3.3.2 循环（1－5步循环）
4.3.3.3 保温
4.3.3.4 暂停
4.3.3.5 声音
4.3.3.6 熔解曲线
4.3.3.7 终点
4.3.4 程序的复制
4.3.5 程序的删除
4.3.6 测量点的确定
4.3.7 热盖设置
5 操作（监测）
5.1 样品的加载
5.2 模块温度控制
5.3 样品体积
5.4 启动检测项目
5.5 单个样品的选择
5.6 单个样品类型的选择
5.7 循环仪状态
5.8 当前运行检测项目的中断
5.9 继续运行检测项目
5.10 终止检测项目
5.11 mastercycler ep realplex 作为pcr的使用5.12 mastercycler ep realplex 作为荧光计的使用
5.13 关闭
6 分析
6.1 概要
6.1.1 打开检测项目
6.1.1.1 打开在运行的检测项目
6.1.1.2 打开子检测项目
6.1.2 单一检测项目的选择
6.1.3 使样品处于不活动状态
6.1.4 样品类型的选择
6.1.5 分析模式的选择
6.1.6 图标缩放
6.1.7 存储默认设置
6.1.8 图表的保存和复制
6.1.9 样品数据的保存和复制
6.1.10 编辑报告
6.1.10.1 模板报告的应用
6.1.11 分析的保存
6.1.12 调用分析
6.2 定量
6.2.1 阈值确定
6.2.2 基准线测定
6.2.3 标准曲线
6.2.4 分析
6.2.5 multiplex 分析
6.3 相对定量
6.3.1 阈值的测定
6.3.2 多plex 分析的估算
6.3.3 单plex分析的估算
6.4 熔解曲线分析
6.4.1 阈值的测定
6.4.2 分析
6.5 终点测量
6.5.1标准曲线
6.5.2 分析
6.6 +/-检测项目
6.6.1 将终点测定作为数据源的+/-检测项目分析模式6.6.1.1 阈值的测定
6.6.2 pcr数据作为数据源的+/-assay
6.6.2.1 阈值测定
6.6.3 分析
6.6.4 多plex分析
6.7 基因测定
6.7.1 阈值测定
6.7.2 分析
7 维护
7.1 清洁仪器的一般方法
7.2 热模块的清洁
7.3 热模块的验证与校准
8 故障查找
8.1 一般故障
8.2 在sybr绿色分析中发生的错误
8.3 qrt－pcr过程中发生的错误
9.1 登陆
9.2 新用户的建立
9.3 创建一个检测项目
9.4 检测项目的保存
9.5 执行检测项目
9.5.1 概述
9.5.2 板布局
9.5.3 pcr程序
9.5.4 开始检测项目
9.5.5 当前运行检测项目的中断
9.5.6 继续运行检测项目
9.5.7 退出检测项目
9.5.8 分析
10 技术数据
2.3 功能性单元
2.3.1 Mastercycler ep realplex
图1：关闭的realplex模块前面观
1 realplex模块
2 状态显示
3 密封压板（锁住状态）
4 控制面板的挂钩（Mastercycler ep realplex不需要）
5 热模块
图2：打开的realplex模块前面观
1 密封压板（开启状态）
2 realplex模块
3 热模块
放入试验样本后，向前拉动realplex模块，覆盖住插入的试管。然后用压板密封，程序开始启动。注意在把密封压板归位时小心不要弄伤手指。
当realplex模块开启时，不要触碰盖子下端以防被灼伤。
2.4.4.3 开始realplex软件的运行
打开mastercycler ep realplex的开关，等待位于开关上部的LED灯将变为绿色。现在您可以开始运行realplex软件了。
您也可以在mastercycler ep realplex处于关断状态下运行realplex软件，甚至在不接任何硬件的状态下运行该软件。第二种情况下，软件将会提示一条错误信息，可以忽略该信息继续运行软件。
注意：当使用realplex软件时，不要运行其它会占用计算机大部分内存的软件（如：CD创建器或者媒体播放器等）！
决不可以使计算机工作在电池供电模式！调整计算机供电电源的设定值以保证在程序运行过程中，计算机不会进入待机状态。
3. 操作
3.1 管理者登陆
当realplex软件第一次被打开时，将会显示如图3.2所示的一个登陆对话框，提示软件管理者为Eppendorf命名并输入登陆密码。这项是仪器的出厂设置，如有需要用户可以在User Administrator对话框中对此项进行修改（详细情况请查阅3.4.2节）。此后软件再次被打开时，无论软件管理者还是其他的软件使用者，都必须建立一个用户才能登陆使用realplex软件。
3.2 登陆
在打开程序时，Mastercycler ep realplex用户都必须先登陆才能进一步使用软件。所有用户名都列在选取框中。我们要做的就是选出自己的用户名并输入相应密码。
新用户由软件管理者建立。（请参阅3.4.1.1节）
如果登陆密码输入错误，则会显示登陆失败（login failed）。点击OK键确认后，重新进入登陆程序。
如果点击Cancel键，则显示主屏幕（情参阅3.3节）。但是此时所有的功能键都会处于无效状态。为进入工作状态，使用者必须再次打开登陆对话框（情参阅3.2节）完成登陆手续。注意：登陆以后，用户可以对自己的文件夹和分析程序进行读或者写的操作，与Mastercycler ep realplex仪器连接后可以执行其他的实验操作。而对软件其他用户的文件夹和分析程序只有读的权限。如果想要执行或编辑其他用户的分析程序的话，可以将其复制到自己的文件夹中。
3.3 用户变更
当已有其他使用者登陆时，可以按照以下方法登陆系统：
通过点击该图标以退出登陆。
如果选择登陆图标，User login对话框将被弹出，使用者可以按照3.2节中描述的登陆步骤进行登陆。
以上两种功能也可以通过File菜单来实现。
软件在同一时刻仅允许一名用户登陆，新用户的登陆将自动使原来的使用者退出系统。
当前登陆用户将被显示在屏幕下方的状态栏内。
登陆后，主屏幕显示为Administror或者User。主屏幕包括向导区，工作区和状态区。如果在左边的向导栏内选定某一程序函数时，该程序函数则会显示在工作区内，而状态栏中将显示热模块的状态信息和当前使用者的用户信息。
1 菜单栏
2 工具栏
3 向导区
4 工作区
5 状态栏
通过选项show/hide navigator，向导区可以被显示或者隐藏。这一操作也可以通过setup 菜单实现。
注意：所有的对程序各个功能的操作以及对系统配置的操作，都可以通过工具栏或者菜单栏实现。选择性的操作还可以通过点击鼠标右键来实现。
3.4 系统配置
在setup菜单中选择system configuration项，则在菜单栏中显示realplex system configuration 对话框。其中对话框左边列出了所有的使用者名单以及处于连接状态的模块名单，此外还有系统设置及其功能的结点选项。在向导栏内不同的层次显示为不同的符号。当用光标选中某个结点时，从属文件夹将变为可见的，再选一次则可关闭该结点。如果某层或其从属文件夹被选中，将在对话框的右边显示出相应的窗口内容。
3.4.1 对使用者的管理
当选中User项，User Administration图表显示在对话框右边，列出所有的用户名单。软件管理者登陆系统以后，可以使用该对话框进行建立新用户，编辑和删除已建立的用户的操作。
3.4.3 循环仪
在cycler结点处，可以得到已连接的循环仪的信息。
设备特性被列在properties图表下。此外相应硬件的资料以及最后登陆的用户名，还有最后运行的程序都会在此栏下显示出来。
在incubate和lid图表下，可以调整热模块和加热盖的温度值。具体做法为首先在new temperature一栏中填入所需的温度值，然后选择incubate复选框以确认。如停止调温，则释放incubate复选框。
PCR程序文档信息在protocol图表下显示。
首先给出了启动PCR程序的登陆用户的信息以及该PCR程序的程序名和启动时间。接下来是相关的程序特性信息和热盖设置。除此之外，程序的运行各步骤也会在此显示出来。
如果选中这个功能键，则原始记录将被作为txt文件保存。
如果选中这个功能键，则原始记录将被与计算机相连的打印机打印出来。
在Cycler结点处双击鼠标，System结点就会显示出来，其中包含有模块的特性信息。
特性：properties栏中显示出模块的型号以及热模块的序列号，同时热模块被最后验定和校定的信息也会显示出来。
Sensors：显示当前传感器的温度值。
温度验定：通过温度传感器对仪器的温度值进行测量，属于仪器温度验定系统的一部分（请详见命令信息）。该过程在温度验定系统的操作手册中有具体描述。
温度校定：借助于温度传感器，对仪器的温度值进行的调整操作。其性能在温度验定系统的操作手册中有具体描述。
3.4.4 realplex 模块
在realplex module结点下将显示realplex模块的特定的系统信息。
除了显示mastercycler ep realplex仪器的版本信息和软件的版本信息以外，其他装配件的序列号也会在此显示出来。同时还有滤波器设备资料和光电倍增器所选电压值。Realplex module还会指明设置realplex模块的CAN总线地址以及热模块和realplex模块之间是否是通过CAN总线电缆相连的。Cover state一栏中显示出加热盖的当前位置。
在realplex module结点处双击鼠标左键打开下层各结点。Module log文件目录下记录了程序运行中出现的所有出错信息。这一图表中的出错信息可以通过选中save功能键以txt格式保存下来，或者选中print功能键通过已连接的打印机打印出来。
3.5 检测项目管理
在工具栏中可以实现以下的检测项目的管理功能：
1 新检测项目
2 打开检测项目
3 保存检测项目
4 打印报告
5 将文件输入当前的选中部分
6 将当前的选中部分输出
注意：以上提及的各个功能还可以通过file菜单，或者把鼠标放在向导栏中点击右键来实现。
3.5.1 建立检测项目
当选中new assay图标时，将出现一个空白的板块，标准的pcr程序将在工作区内被装载。
3.5.2 打开检测项目
当选中open assay图标以后，将弹出检测项目对话框：
如果一个用户或者文件夹处于选中状态时。除了文本名、建立时间和更新时间会在assays 面板上显示出来以外，所有保存其中的检测项目也都会在右边显示出来。而且还会提示出各文本的状态。
标有setup的文本代表从没被打开过。打开文本时，文本将被装载在assay setup和analysis 中，而且在analysis中没有数据资料。
标有template的文本可以作为建立新文本的模板文本使用。更多相关信息请详见3.5.4和3.5.5节的关于模板文本的建立日期和使用的介绍。
标有complete的文本代表数据获得已经发生过的文本。如果这样的文本被打开，数据将
会显示在analysis下。并且除非有其它文本当前正在被运行的情况下，该文本才会显示在assay setup中。详见6.1.1.1节中的介绍。
当某个文本被选中，该文本中保存的所有分析数据都将被显示在下方的analysis窗口中。数据建立和执行这些分析的用户名都会被在这里列出来。
因为断电或者系统发生错误等原因造成失败的文本都带有这个aborted的标志。如果在发生失败前获得了足够多的数据，那么该文本还是可以被拿来分析的。
3.5.3 保存检测项目
检测项目可以由登陆用户在他的结点下或者文件夹中执行保存操作。只有登陆用户才能执行对这些程序文件的编辑操作。而其他使用者只能对这些文件执行读或者复制的操作。
当save assay的图标被选中后，当前的检测项目被执行保存操作。
当要把一个检测项目保存在某目标文件夹下时，可以选中file菜单下的save as功能键，打
开相关对话框来实现。
输入检测项目名后，文本通过复选框assay type被选中，点击ok以确认。
3.5.4 保存模板文件
当一个检测项目要在被创建以后多次重复使用时，该文件将被保存为模板文件。具体方法为在保存文件的过程时，复选框中选择template栏。
3.5.5 模板文件的使用
当创建简单的新检测项目时可以用到模板文件。具体方法：模板文件在assay setup通过功能键open assay中被装载，以检测项目的形式，命名后保存在用户结点下。
3.5.6 复制检测项目
用户可以复制其它用户的文本到自己的文件夹,对这些文本与模板进行启动和编辑。具体方法为：在assay对话框中使用open assay选中和打开其他用户文件夹下相关的检测项目，然后通过save as将文本复制到自己的结点下（请查阅3.5.3节）。
这时用户就可以在连接mastercycler ep realplex以后，直接启动和执行复制的检测项目了。
3.5.7 检测项目的输出
检测项目的输入输出功能用于几个工作站之间的文本交换。在此检测项目与板布局、PCR 程序和被测数据一同被输入输出。
图标export assay to file用来以ASY格式保存当前的检测项目到另一个工作站上的计算机上以便对文本做更多的处理。
在窗口的靠上一栏中选出检测项目的保存位置，然后输入文本的名字，并在file type一栏中选择realplex－exchange（*.asp）。
3.5.8 检测项目的输入
当选中图标import assay from file时，一个格式为ASY的检测项目就会被装载到一个空白的文本中。
当输入一个检测项目时，必须在窗口的靠上一栏内选中一个相关的保存位置，文件类型为
realplex－exchange（*.asp）。
3.5.9 建立文件夹
登陆用户可以在本人用户结点下建立文件夹，相关的文件和文本都在这个文件夹中保存，以方便日后的调用。根据如下的步骤建立文件夹：
通过图标open assay打开检测项目的对话框。
选中本人用户结点后，通过功能键new来添加一个新的文件夹。
可以首先通过选中文件夹，然后再点击功能键rename来重新命名。
然后检测项目就可以在建立的文件夹中进行复制和创建等操作了。（请查阅3.5.4和3.5.2节）
3.5.10 删除检测项目和文件夹
通过图标open assay，用户可以在检测项目对话框中，点击功能键delete来删除选中的检测项目，最后点ok确认删除操作。同样的删除操作可以用来删除文件夹。
选中一个检测项目或者文件夹后，可以通过点击功能键delete，和确认yes来删除该检测项目或者文件夹。
3.6 染料管理
选中dyes图标后，将会弹出相应对话框。
这个对话框用于实现对染料的管理。在荧光测量中，染料是必须被适当设定的。相应染料的最大发射波长对于用户选择适当滤光片(如FAM520nm与一号滤光片520+/-5 nm ）滤光片是非常重要的。请向各自的生产商咨询所需染料的最大放射量。
注意：在执行颜色校准（请查阅3.8.2节）前，必须先定义相应的染料。
染料名称
染料最大的发射波长，单位为纳米（nm）
染料检测通道。基于特定的染料波长有程序预先自动设定。
具体染料校准时的光电倍增器的敏感度。包含有四位数码，用来为四个滤光片中的每一个设定相应数值（1代表低敏感度，9代表高敏感度）。该数码由软件预先设置。
最后一次执行染料校准的用户
最后一次校准时间。
在点击此键以后所显示的对话框中，新染料的所有数据都可以在这里输入进来。
这个对话框用来输入新染料的名称和检测新染料的滤光片。滤光片必须与新染料的发射波长