蛋白质分离技术的发展及意义

蛋白质分离技术的发展及其意义

中国科学院病毒研究所王春林201328012415044

摘要：蛋白质作为生命活动的承担者，在生物体的生活周期中扮演了至关重要的角色。因此针对蛋白质的研究技术是生命科学领域中的一个关键点。为了对蛋白质进行进一步的研究，首先我们要通过分离蛋白，得到纯化的蛋白样品，才能对其进行结构大小物理及化学性质等的鉴定研究。本文主要介绍了几种常用的分离技术：层析技术、电泳技术、沉淀技术、超滤技术、色谱技术等。蛋白质分离技术的发展，对人类探索生物奥妙起到了很大的推动作用，促进了生命科学的快速发展。

关键词：蛋白质、分离纯化、层析、电泳、色谱技术

The Development and Significance of Protein Separation Technology WuHan Institute of Virology, CAS Wang Chunlin 201328012415044

Abstract: In recent decades, biological research has made a great progress .Therefore , the technology for protein research is a key points in life sciences. In order to have further studies, we h--ave to get the purified protein samples by separation technology. Then, we can identify th

e ph--ysical and chemical properties o

f the protein. In this article, We have introduced several normal separation methods, such as chromatography, electrophoresis, precipitation,ultrafiltrati on, and chromatogram. The development of protein separation technology has play a role to he

lp human to reveals the mysteries of biology, as well as promoting the rapid growth of life scienc es.

key words:protein, isolation, chromatography, electrophoresis, chromatogram

蛋白质存在于一切生物生物体中，是非常重要的大分子。是生物功能的执行者，担负着生物催化、物质运输远动防御调控及记忆识别等多种生理功能。由于深入研究蛋白质的结构与功能需要用到高纯度的蛋白质，因此蛋白质分离与纯化技术是生物产业中的核心技术。然而该技术难度、成本均高；例如一个生物药品的成本75%都花在下游蛋白质分离纯化当中。所以对该项技术的改良与创新在实际应用中具有重要意义。

1 蛋白质分离纯化技术

1.1超滤

超滤技术由于具有通量高,操作条件温和,易于放大等特点,特别适合生物活性大分子的分离。在生物技术领域,超滤技术目前已广泛应用于细胞收集分离、除菌消毒、缓冲液置换、分级(fractionation)、脱盐及浓缩[1]。近年来越来越多的研究表明,通过选择适当的膜或膜表面改性,以及对分离过程进行优化,充分利用和调控膜-蛋白质以及蛋白质-蛋白质之间的静

电相互作用,可以实现分子量相近的两种蛋白质的高选择性超滤分离[2-7]。蛋白质超滤分离快，,通过脉冲进样技术,载体相超滤技术、参数连续变化超滤技术以及在这些技术基础上建立的

超滤分离快速优化新方法,克服了常规蛋白质超滤分离过程优化中存在的实验工作量大、蛋白质消耗多、费时以及费用高等缺点[8]。应用萃取一超滤两步法从过期人血中提取人血红蛋白[9]。

1.2沉淀法

1.2.1有机溶剂沉淀法

有机溶剂能降低溶液的电解常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度的降低；另外，有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法，称“有机溶剂分段沉淀法”，它常用于蛋白质或酶的提纯。常用的有机溶剂是乙醇和丙酮，由于有机溶剂的加入易引起变性失活，尤其乙醇和水混合释放热量，操作一般宜在低温下进行，且在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以免局部浓度过大[10]。分离后的蛋白质沉淀应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂的浓度。操纵时的pH值大多数控制在待沉淀蛋白质等电点四周。有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度，减少变性和进步分离的效果。一般在有机溶剂沉淀时添加中性盐的浓度在0.05mol

左右,过多不仅耗费有机溶剂,而且可能导致沉淀不好。沉淀的条件一经确定,就必须严格控制,才能得到重复性结果。有机溶剂浓度通常以有机溶剂和水容积比或用百分浓度表示。故操纵条件比盐析法严格。

1.2.2等电点沉淀法

等电点沉淀法是利用蛋白质在等电点时溶解度最低而各种蛋白质又具有不同等电点的特点进行分离的,因为等电点是蛋白质的溶点最低。胡天桥等利用等电点沉淀法有效沉淀人血清中高丰度大分子量蛋白，证明是一种分离血清部分小分子量蛋白质简便、经济、有效的前期处理方法[11]。正是由于他有快捷、简便、高效的特点，常用于一些日常的蛋白检测。例如利用酪蛋白等电点法快速鉴别市面上的奶粉和乳清制粉，以酸调节待测样品水溶液pH 值至416附近,若该溶液是奶粉溶液,将形成大量的白色絮状凝块从溶液中沉淀出来,若该溶液是乳清粉溶液,由于不存在酪蛋白,将无此沉淀反应(乳清蛋白在该pH值或更低pH值时均不发生类似的沉淀反应[11]),利用这个现象立即就可以将奶粉和乳清区别开来。[12]本法耗时极少,不到1分钟即可完成鉴定,操作简便快捷,试剂耗用量少,无需特别培训,甚至无需天平称量,不受现场温度影响,在查货现场即可进行检验鉴定。由于本法直接从产品的成份及工艺入手,因而具很高的可靠性。[13]

1.3盐析

所谓盐析沉淀就是在蛋白质溶液中加入中性盐使其沉淀析出的过程。通过破坏蛋白质分子表面水膜或中和蛋白质分子表面水膜使蛋白质凝聚沉淀。此法多用于血浆蛋白的提取。

具有成本低，不需要什么特别昂贵的设备；操作简单，安全；对许多生物活性物质具有稳定作用。但沉淀物中含有大量的盐析剂。常常用的中性盐有饱和硫酸铵、辛酸-硫酸铵、饱和

硫酸钠等。不同的的蛋白底物，采用的中性盐不同。岳喜庆等选取饱和硫酸铵、辛酸-硫酸铵、饱和硫酸钠三种盐析方法,对牛血清中的免疫球蛋白进行分离提取,得到免疫球蛋白的粗提物。通过比较三种方法的提取得率和产品回收率确定采用饱和硫酸铵沉淀法提取效果最佳。其提取得率为9.06g/L,产品回收率为91%,是最适合对血清中免疫球蛋白进行粗提的盐析方法。[14]因此针对性的选取中性盐和优化各种其他条件都会给提取带来帮助。择中性盐应注意的问题应使酶沉淀完全、收率高；且有利于酶的提纯，而本身又易去除。对酶无毒性，应用不受影响。价格低廉，废水处理容易。

1.4层析技术

本世纪初,俄国植物学家Tswett,用石油醚萃取植物色素,然后注入填有碳酸钙的玻璃柱,

以石油醚冲洗,得到分离的黄色、绿色区带,所以称为色谱[15]。到60年代,由于开发出适用于

生物物质分离纯化的层析固定相,层析技术才被用于生物物质的分离纯化并得到迅速发展。

蛋白质层析技术进展表现在以下三方面:新型层析方法、新型层析固定相和对层析过程进行

数学模拟的深入研究。[16]层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。所有

的层析系统都由两个相组成：一是固定相，另一是流动相。当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组分的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量比）不同，且随流动相向前移动，各组分不断地在两相中进行再分配。分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组分，从而达到将各组分分离的目的。

1.4.1羟磷灰石层析

羟磷灰石层析简称HA，一般用于分离结构差异很小的蛋白质，在实际工业和实验室应

用时候是离子交换层析、凝胶柱层析的补充方法。吸附剂羟磷灰石可用于分离蛋白质和核酸。蛋白质中带负电基团与羟磷灰石晶体表面的钙离子结合，而带正电基团与磷酸基相互

作用，羟磷灰石对蛋白质的吸附容量比较大。因此，根据蛋白质分子与吸附剂羟磷灰石之

问的吸附能力和解吸性质的不同而达到分离的目的。

1.4.2疏水作用层

蛋白质表面一般有疏水与亲水集团，疏水层析是利用蛋白质表面某一部分具有疏水性，与带

有疏水性的载体在高盐浓度时结合。在洗脱时，将盐浓度逐渐降低，因其疏水性不同而逐个地先后被洗脱而纯化，可用于分离其它方法不易纯化的蛋白质。但是疏水层析的某些洗脱条件可能导致蛋白质的变性，而且还存在不可预测性，对某些蛋白质分离效果很好，对另一些则不好。因此，近年来发展的新方法，常用硫酸铵沉淀、离子交换和亲和层析之后，进行疏水层析的样品不需要透析、凝胶过滤等方式脱盐。

1.4.3离子交换柱层析

离子交换层析是通过带电的溶质分子与离子交换层析介质中可交换离子进行交换而达

到分离纯化的方法，也可以认为是蛋白质分子中带电的氨基酸与带相反电荷的介质的骨架相互作用而达到分离纯化的方法。离子交换层析法主要依赖电荷间的相互作用，利用带电分

子中电荷的微小差异而进行分离，具有较高的分离容量。由于离子交换层析法分辨率高，工作容量大，并容易操作，以成为蛋白产物分离纯化的重要方法。

1.4.4凝胶柱层析

凝胶层析法(gel chromatography)也称分子筛层析法，是指混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高，除常用于分离纯化蛋白质外还用于分离纯化核酸、多糖、激素等物质并且还可用于测定蛋白质的相对分子质量，以及样品的脱盐和浓缩等。由于整个层析过程中一般不变换洗脱液，有如过滤一样，故又称凝胶过滤。凝胶是一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，象筛子，直径大于孔径的分子将不能迸入凝胶内部，便直接沿凝胶颗粒的间隙流出，称为全排出。较小的分子在容纳它的空隙内，自由出入，造成在柱内保留时间长。这样，较大的分子先被洗脱下来，而较小的分子后被洗脱下来，从而达到相互分离的目的。洗脱时峰的位置和该物质相对分子质量有直接的定量关系。在一根凝胶柱中，颗粒间自由空间所含溶液的体积为外水体积V。不能进入凝胶孔径的那些大分子，当洗脱体积为V。时，出现洗脱峰。凝胶颗粒内部孔穴的总体积称为内水体积Vi ，能全部渗入凝胶的那些小分子，当洗脱体积为V。+Vi

时出现洗脱峰。

1.4.5亲和层析

将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液，改变结合条件将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分离纯化蛋白质的方法称为亲和层析。利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其

它分子的层析技术。在选取载体时有基本的要求：①不溶于水，但高度亲水；②惰性物质，非特异性吸附少；③具有相当量的化学基团可供活化；④理化性质稳定；⑤机械性能好，具有一定的颗粒形式以保持一定的流速；⑥通透性好，最好为多孔的网状结构，使大分子能自由通过；⑦能抵抗微生物和醇的作用。可以做为固相载体的有皂土、玻璃微球、石英微球、羟磷酸钙、氧化铝、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素和琼脂糖。在这些载体中皂土、玻璃微球等吸附能力弱，且不能防止非特异性吸附。纤维素的非特异性吸附强。聚丙稀酰胺凝胶是目前的首选优良载体。对于配体也有一定的要求，应具备这些性质：○1配体与待分离的物质有适当的亲和力。○2配体与待分离的物质之间的亲和力要有较强的特异性，也就是说配体与待分离物质有适当的亲和力，而与样品中其它组分没有明显的亲和力，对其它组分没有非特异性吸附作用。这是保证亲和层析具有高分辨率的重要因素。○3.配体要能

够与基质稳定的共价结合，在实验过程中不易脱落，并且配体与基质偶联后，对其结构没有明显改变，尤其是偶联过程不涉及配体中与待分离物质有亲和力的部分，对二者的结合没有

明显影响。○4配体自身应具有较好的稳定性，在实验中能够耐受偶联以及洗脱时可能的的较剧烈的条件，可以多次重复使用。

亲和层析法是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高并且是最有效的生物活性物质纯化方法，它对生物分子选择性的吸附和分离，可以取得很高的纯化倍数。此外蛋白在纯化过程中得到浓缩，结合到亲和配基后，性质更加稳定，其结果提高了活性回收率，同时它可以减少纯化步骤缩短纯化时间，对不稳定蛋白的纯化十分有利。但是它除特异性的吸附外，仍然会因分子的错误认别和分子间非选择性的作用力而吸附一些杂蛋白质，另洗脱过程中的配体不可避免的脱落进入分离体系。载体较昂贵，机械强度低，配基制备困难，有的配基本身要经过分离纯化，配基与载体耦联条件激烈等。[17]

1.5电泳法

电泳是一种分离蛋白质的常用手段。以SDS-PAGE为例，聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和交联试剂N，N′-甲叉双丙烯酰胺在有引发剂和增速剂的情况下聚合而成的一种三维立体网状结构的凝胶物质，是目前生化和分子生物学实验中常用的电泳支持介质。聚合反应时常用的催化剂或者引发剂有过硫酸铵、过硫酸钾及核黄素等物质。N，N，N′，N′-四甲基乙二胺（TEMED）、3-二甲胺丙腈等物质可作为聚合过程的增速剂。以聚丙烯酰胺凝胶为支持介质的电泳是依据蛋白质的分子量和带电性的差异而使不同分子量的蛋白质得到分离。通过不同的电泳方法，即可探求蛋白质分子的各种特性，如分子量、等电点、电荷分布、免疫行为、生化特性等。SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂，在电泳实验中作为变性剂和助溶剂，它能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质的二级和三级结构。在电泳样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚成多肽链。强还原剂如β-巯基乙醇则能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，由于SDS带有大量的负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而掩盖了不同种类蛋白质分子间原有电荷的差异，使蛋白质分子均带有相同密度的负电荷。蛋白质-SDS复合物在水溶液中的形状像一个长椭圆棒。不同的蛋白质的SDS复合物的短轴长度基本上是相同的，约为1.8nm。但长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比。因此这种复合物在SDS-聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴的长度，即蛋白质或亚基分子量的大小。由于SDS电泳分离蛋白质分子时，电泳迁移率只取决与分子解聚后SDS-蛋白质复合物的大小，即蛋白质分子量的大小，因此凝胶浓度的选择尤为重要。交联度为2.6%的条件下，在10%的凝胶中，蛋白质的分子量在25KD到200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。在15%的凝胶中，蛋白质的分子量在10KD至50KD之时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。因此，可以根据所测的分子量的范围选择合适的凝胶浓度以及相应。除此外还有不用SDS变性蛋白的，二维电泳分离法。

1.6色谱技术的运用

通过基因工程技术获得新型的蛋白药物，与日俱增。对于这些生物活性的药物的活性和纯度要求是及其严格，一种高效而且温和的分离技术成为累获得这类药物的关键技术。以上的诸多方法固然有的高效，但不够温和.但是色普分离满足了这些要求的唯一手段。[18]色谱分离技术又称层析分离技术或色层分离技术，是一种分离复杂混合物中各个组分的有效方法。它是利用不同物质在由固定相和流动相构成的体系中具有不同的分配系数，当两相作相对运动时，这些物质随流动相一起运动，并在两相间进行反复多次的分配，从而使各

物质达到分离。色谱有多种，按固定相类型和分离原理可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、亲和色谱、大孔吸附树脂、凝胶色谱、聚焦色谱等。最常用的是吸附色谱分离技术,吸附色谱法是指混合物随流动相通过吸附剂（固定相）时，由于吸附剂对不同物质具有不同的吸附力而使混合物中各组分分离的方法。此法特别适用于脂溶性成分的分离。被分离的物质与吸附剂、洗脱剂共同构成吸附层析的三要素，彼此紧密相连。

2结论

目前，除上述技术外，如移动界面电泳，各种形式的区带电泳，特别是圆盘凝胶电泳、毛细管电泳以及等电聚焦点用等均具有很高的分辨率，都可用于蛋白质的分离纯化。纤维素离子交换剂Sephadex离子交换剂的离子交换层析，HPLC和亲和层析法都是有效的分离纯化方法。实际上整个生物工程中，不同的分离技术有其优缺点。不同的实验方案及目的，加上各方面的因素都会影响到所选择的的分离方法，这就要求我们要考虑以上许多影响下游过程的因素也是上游工作本身必需加以考虑的需优化的因素。在操作的过程中也是影响分离消息的一个因素之一。有时对于分离同种蛋白需要很多种方法进行比较。以上分离的方法不仅运用分离纯化蛋白，也可以运用于其他的物质分离。这些技术都在不同程度上推动了生物科技的进步，在基于这些技术的的原理上开发出了很多相应的分离仪器。可以说是生物研究的需要促使了这些技术的的出现，反过来这些分离技术有推动科学的进步与发展。虽然现有的分离技术还不能满足科学研究的需要，但是一定还会开发出更多更好的分离技术。

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