《生物制药技术》实验指导-实验一

《生物制药技术》实验指导

实验一金霉素链霉菌培养基的制备（验证型）

实验目的：

1、学会培养基的配制

2、掌握灭菌方法。

实验原理：

金霉素链霉菌（Streptomyces aureofaciens）亦称“金色链霉菌”，放线菌门(Actinobacteria)，放线菌纲(Actinobacteria)，放线菌目(Actinomycetales)，链霉菌科(Streptomycetaceae)，链霉菌属(Streptomyces)。在固体培养基上产生金色色素，故名。其菌落为草帽型, 菌落直径一般为3～5毫米, 表面较平坦, 中间有隆起。菌落开始为白色，长孢子后变青色。在显微镜下可以看到短杆状的菌丝。抗菌素工业上用以生产金霉素。

放线菌是一类介于细菌与真菌之间的单细胞微生物。放线菌在土壤中分布最多，大多数生活在含水量较低、有机质丰富和微碱性的土壤中。多数情况下，泥土中散发出的“泥腥味”就是由放线菌中链霉菌产生的土腥素造成的。放线菌大都好氧，属于化能异养，菌丝纤细，分枝，常从一个中心向周围辐射生长。因其生长具辐射状，故名放线菌。放线菌能像真菌那样形成分枝菌丝，并在菌丝末端产生外生的分生孢子，有些种类甚至形成孢子囊，因而曾被误认是真菌。但其菌落较小而致密，不易挑取。不少菌种在医药、农业和工业上广泛应用，可产生抗菌素，现已发现和分离出的由放线菌产生的抗生素多达4 000多种，其中，有50多种抗生素已经广泛地得到应用，如链霉素、红霉素、土霉素、四环素、金霉素、卡那霉素、氯霉素等用于临床治疗人的多种疾病；有些可生产蛋白酶、葡萄糖异构酶；有的用于农业生产，如灭瘟素、井冈霉素、庆丰霉素等。

四环素类抗生素是由链霉菌生产或经半合成制取的一类广谱抗生素。抗菌谱极广，包括革兰氏阳性和阴性菌、立克次体、衣原体、支原体和螺旋体。品种主要包括金霉素、四环素和土霉素。四环素早在1948年即开始用于临床，至今已有50余年历史。现在四环素已被收入中国药典2005版，还被收入美国、英国、日本等许多国家的药典。上世纪70～80年代四环素产销处于全盛时期，我国有上百家企业生产，临床用量很大。多年来由于四环素类的广泛应用，临床常见病原菌对金霉素耐药现象严重。1950年，国外有报道四环素族药物引起牙着色，病因是在牙的发育矿化期服用四环素族药物，可被结合到牙组织内，使牙着色。四环素还可在母体通过胎盘引起乳牙着色。其后又后续报道四环素沉积于牙、骨骼以至指甲等，而且还能引起釉质发育不全。在这方面，国内直至70年代中期方引起注意。自20世纪80年代后期起，因细菌耐药性增加以及新的抗生素大量上市等原因，四环素产销逐渐萎缩，市场疲软。因为副作用大，只外用，用于治疗结膜炎、沙眼。

材料、试剂和器材：

试剂：

NaBr母液（100 g／L）

KCl母液（100 g／L）

M-促进剂母液（2.5 g／L）

器材：

1ml移液枪；不锈钢锅；电炉；台秤、天平

其它物品：

蒸馏水、250ml三角瓶、500ml三角瓶、钥匙、烧杯、玻璃棒、量筒、纱布、剪刀、棉花塞、报纸、线绳、皮筋、记号笔、1.5mL离心管、1ml移液枪头、枪头盒

实验步骤：

1．种子培养基

种子培养基(g／L)：可溶性淀粉40，黄豆饼粉20，酵母粉5，蛋白胨5，CaCO34，(NH4)2SO4 3，MgSO4·7H2O 0.25，KH2PO4 0.25。

先称取黄豆饼粉20g，单独煮沸10分钟，加入少量凉水降温，4层纱布压榨取汁，与其它称好的各成分混合，定容至1L。

每50ml分装到250ml三角瓶中，每组2瓶。

2．定向发酵培养基

发酵培养基(g／L)：可溶性淀粉100，黄豆饼粉40，蛋白胨15，CaCO3 5，(NH4)2SO4 3，酵母粉2.5，MgSO4·7H2O 0.25，α—淀粉酶0.1。

配制方法同种子培养基，配好后分装到500ml三角瓶中，每瓶100ml，分别加入如下成分，比较它们对四环素产量的影响：

(1)对照(不加其他成分)；

(2)加入NaBr母液至终浓度为2g／L；

(3)加入KCl母液至终浓度为2g／L；

(4) 加入NaBr母液至终浓度为2g／L及M-促进剂母液至终浓度为0.025g／L。

每两组配一套。

3．灭菌

将封好口的培养基121℃灭菌30min。同时灭1ml 剪口移液枪头、1.5mL离心管。

（总过程：称量——溶化——定容——分装——封口——灭菌）

注意事项：

1．黄豆饼粉煮沸取汁。

2．培养基封口最好用8层纱布或棉花塞，最好不用橡胶塞，以增加透气性。

3．灭菌时锅内要补足水分。由于灭菌锅较大，升温排气一定要充分（10min）。

补充阅读：

工业发酵中利用生产菌发酵得出最终产物是一个逐级放大的过程，各个不同的阶段对于营养成分的要求也各有特点，根据发酵不同阶段的要求，培养基可分为孢子培养基、种子培养基和发酵培养基三种。

孢子培养基孢子培养基是供菌种繁殖孢子的一种常用固体培养基，对这种培养基的要求是能使菌体迅速生长，产生较多优质的孢子，并要求这种培养基不易引起菌种发生变异。所以对孢子培养基的基本配制要求是：第一，营养不要太丰富（特别是有机氮源），否则不易产孢子。如灰色链霉在葡萄糖－硝酸盐－其它盐类的培养基上都能很好地生长和产孢子，但若加入0.5%酵母膏或酪蛋白后，就只长菌丝而不长孢子。第二，所用无机盐的浓度要适量，不然也会影响孢子量和孢子颜色。第三，要注意孢子培养基的pH和湿度。生产上常用的孢子培养基有：麸皮培养基、小米培养基、大米培养基、玉米碎屑培养基和用葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏和食盐等配制成的琼脂斜面培养基。大米和小米常用作霉菌孢子培养基，因为它们含氮量少，疏松、表面积大，所以是较好孢子培养基。

种子培养基种子培养基是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌体长得粗壮，成为活力强的“种子”。所以种子培养基的营养成分要求比较丰富和完全，氮源和维生素的含量也要高些，但总浓度以略稀薄为好，这样可达到较高的溶解氧，供大量菌体生长繁殖。种

子培养基的成分要考虑在微生物代谢过程中能维持稳定的pH，其组成还要根据不同菌种的生理特征而定。一般种子培养基都用营养丰富而完全的天然有机氮源，因为有些氨基酸能刺激孢子发芽。但无机氮源容易利用，有利于菌体迅速生长，所以在种子培养基中常包括有机及无机氮源。最后一级的种子培养基的成分最好能较接近发酵培养基，这样可使种子进入发酵培养基后能迅速适应，快速生长。

发酵培养基发酵培养基是供菌种生长、繁殖和合成产物之用。它既要使种子接种后能迅速生长，达到一定的菌丝浓度，又要使长好的菌体能迅速合成需产物。因此，发酵培养基的组成除有菌体生长所必需的元素和化合物外，还要有产物所需的特定元素、前体和促进剂等。但若因生长和生物合成产物需要的总的碳源、氮源、磷源等的浓度太高，或生长和合成两阶段各需的最佳条件要求不同时，则可考虑培养基用分批补料来加以满足。