高效液相色谱法习题
高效液相色谱法习题
一、思考题
1．从分离原理、仪器构造及应用范围上简要比较气相色谱及液相色谱的异同点。
2．液相色谱中影响色谱峰展宽的因素有哪些? 与气相色谱相比较, 有哪些主要不同之处? 5．液-液分配色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？
6．液-固分配色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？
7．化学键合色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？
8．离子交换色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？
9．离子对色谱的保留机理是什么?这种类型的色谱在分析应用中,最适宜分离的物质是什么?
10．空间排阻色谱的保留机理是什么？这种类型的色谱在分析应用中，最适宜分离的物质是什么？
11．在液-液分配色谱中，为什么可分为正相色谱及反相色谱？
12．何谓化学键合固定相？它有什么突出的优点？
14．何谓梯度洗提？它与气相色谱中的程序升温有何异同之处？
15．高效液相色谱进样技术与气相色谱进样技术有和不同之处？
16．以液相色谱进行制备有什么优点？
二、选择题
1．液相色谱适宜的分析对象是（）。
A 低沸点小分子有机化合物
B 高沸点大分子有机化合物
C 所有有机化合物
D 所有化合物
4．液相色谱定量分析时，不要求混合物中每一个组分都出峰的是＿。
A 外标标准曲线法
B 内标法
C 面积归一化法
D 外标法
5．在液相色谱中，为了改善分离的选择性，下列措施（）是有效的？
A 改变流动相种类
B 改变固定相类型
C 增加流速
D 改变填料的粒度
7．分离结构异构体，在下述四种方法中最适当的选择是（）。
A 吸附色谱
B 反离子对色谱
C 亲和色谱
D 空间排阻色谱
8．分离糖类化合物，选以下的柱子（）最合适。
A ODS柱
B 硅胶柱
C 氨基键合相柱
D 氰基键合相柱
9．在液相色谱中，梯度洗脱适用于分离（）。
A 异构体
B 沸点相近，官能团相同的化合物
C 沸点相差大的试样
D 极性变化范围宽的试样
10．在高效液相色谱中，采用254 nm紫外控制器，下述溶剂的不能使用的为（）。
A 甲醇210 nm
B 乙酸乙醋260 nm
C 丙酮330 nm
11吸附作用在下面哪种色谱方法中起主要作用（）。
A 液一液色谱法
B 液一固色谱法
C 键合相色谱法
D 离子交换法
13．在液相色谱中，提高色谱柱柱效的最有效途径是（）。
A 减小填料粒度
B 适当升高柱温
C 降低流动相的流速
D 增大流动相的流速
16．如果样品比较复杂，相邻两峰间距离太近或操作条件不易控制稳定，要准确测量保留值有一定困难时，可选择以下方法（）定性。
A 利用相对保留值定性
B 加入已知物增加峰高的办法定性
C 利用文献保留值数据定性
D 与化学方法配合进行定性
17．液相色谱中通用型检测器是（）。
A 紫外吸收检测器
B 示差折光检测器
C 热导池检测器
D 荧光检测器
19．高压、高效、高速是现代液相色谱的特点，采用高压主要是由于（）。
A 可加快流速，缩短分析时间
B 高压可使分离效率显著提高
C 采用了细粒度固定相所致
D 采用了填充毛细管柱
22．在液相色谱中，下列检测器可在获得色谱流出曲线的基础上，同时获得被分离组分的三维彩色图形的是（）。
A 光电二极管阵列检测器
B 示差折光检测器
C 荧光检测器
D 电化学检测器
23．不同类型的有机物，在极性吸附剂上的保留顺序是（）。
A 饱和烃、烯烃、芳烃、醚
B 醚、烯烃、芳烃、饱和烃
C 烯烃、醚、饱和烃、芳烃
D 醚、芳烃、烯烃、饱和烃
24．氧化铝固定相色谱柱不适合选哪种物质作流动相（）。
A 甲醇
B 正己烷
C 煤油
D 环烷酸
31．键合相的键合基团的碳链长度增长后（）。
A 极性减小
B 极性增大
C 载样量增大
D 载样量减小
33水在下述色谱中，洗脱能力最弱（作为底剂）的是（）。
A 正相色谱法
B 反相色谱法
C 吸附色谱法
D 空间排斥色谱法
三、填空题
1．高效液相色谱仪一般可分为、、、和
等部分。
2．常用的高效液相色谱检测器主要是、、、
和检测器等。
3．高效液相色谱中的技术类似于气相色谱中的程序升温，不过前者连续改变的是流动相的，而不是温度。
4．高效液相色谱柱按内径大小大致可分为三种类型：内径小于mm的称为细管或微管径柱；内径在mm范围内的是常规高效液相色谱柱；内径大于mm 的一般成为半制备柱或制备柱。
5．高效液相色谱固定相的性质和结构的差异，使分离机理不同而构成各种色谱类型，主要有、、、和等。6．在液－液分配色谱中，对于亲水固定液采用流动相，即流动相的极性_______________固定相的极性称为正相分配色谱。
7．正相分配色谱适用于分离化合物、极性的先流出、极性的后流出。
8．流动相常用的脱气方法有、、和。
9．高压输液泵是高效液相色谱仪的关键部件之一，按其工作原理分为和两大类。
13．在液相色谱中，溶质分子与极性吸附中心的相互作用，会随溶质分子上官能团极性的__________或官能团数目的而增加，这会使溶质在固定相上的保留值______。14．色谱操作时，如果超载，即进样量超过柱容量，则柱效迅速_______，峰变________。15．、、是现代液相色谱的显著特点，其固定相多采用。
16．高效液相色谱的发展趋势是减小和以提高柱效。17．在液相色谱中，为改善分离度并调整出峰时间，可通过改变流动相和______的方法达到。
19．通过化学反应，将键合到表面，此固定相称为化学键合固定相。
25．在正相色谱中，极性的组分先出峰，极性的组分后出峰。
（）
高效液相色谱法在水质检测中的应用
高效液相色谱法在水质检测中的应用 摘要：液相色谱仪已广泛应用于水环境监测中，逐步成为常规检测方法，其适用于分子量大、挥发性低、热稳定性差的有机污染物的分离和分析，具有准确、快速等特点。 关键词：液相色谱仪；水环境监测；有机污染物 1、引言 高效液相色谱法 ( high performance liquid chro-matography，简称 HPLC)，具有下列主要优点：固定相颗粒细且规则均匀，传质阻抗小，组分间分离效率高；利用高压泵输送流动相，大大缩短分析时间；使用高灵敏检测器，提高了检测灵敏度，在分析速度、分离效能、检测灵敏度和操作自动化方面，达到了和气相色谱法相媲美的程度，气相色谱法仅适于分析蒸汽压低、挥发性高、沸点低、热稳定性好的样品。在全部已知的有机化合物中仅有20%的样品符合这些条件，近80%的有机化合物属于挥发性低、易受热分解或者大分子化合物，适合于高效液相色谱分析，因此，HPLC 应用前景更为广阔。 在环境监测中，高翔液相色谱法已逐步上升为常用的监测方法，如检测多环芳烃类、酚类、多氯联苯、苯胺类、阴离子和非离子表面活性剂、有机农药除草剂等。随着经济的快速发展，人们在获取大量化学物质以满足经济、生产和生活需要的同时，也将一些典型的有毒有害的有机污染物带入环境，其中部分有机污染物已经直接或间接被证明具有致癌、致畸和致突变的作用，给人类健康和自然生态环境带来了严重、持久、潜在的危害。根据发达国家的经验和我国经济发展
伴随的污染现状，有毒有机污染物也必将成为我国环境监测的重要目标。 2、实验部分 2.1主要仪器 岛津公司生产的高效液相色谱仪（LC-20A），包括： (1)CBM-20A—系统控制器； (2)CTO-20A—色谱柱柱温箱； (3)LC-20A—溶液传输单元； (4)SPD-20A—紫外可见光检测器； (5)RF-20A—荧光检测器； (6)SIL-20A—自动进样器； (7)DGU-20A3R—在线脱气机 (8)数据处理：LC-LabSolutions工作站软件。 (9)色谱柱：Shim-pack column size serial NO.VP-ODS。 2.2液相色谱原理简介 液相色谱法是在高压条件下溶质在固定相和流动相之间进行的 一种连续多次交换的过程，它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同引起排阻作用的差别使不同溶质得以分离。 2.3建立实验方法 研究液相色谱测定苯系物的实验方法，结合查找的资料及实验验证，确定检测苯系物的实验方法如下： (1) 进样量：10微升；色谱柱：Shim-pack column size serial NO.VP-ODS 柱。
高效液相色谱仪(HPLC)校正方法
高效液相色谱仪（HPLC）校正方法 0.1输液系统： 0.1.1梯度误差G C不超过±3% 0.1.2泵流量设定值误差 S s＜±2% 0.1.3流量稳定性误差 S R＜±2% 0.2紫外检测器性能 0.2.1基线噪声不超过5×10-4AU，基线漂移不超过5×10-3AU 0.2.2定量测量重复性误差（6次进样）RSD≤1.5% 0.2.3最小检测浓度不超过1×10-7g/ml萘/甲醇溶液 0.2.4可调波长紫外可见光检测器波长示值不超过±2nm(HP1100高效液相色谱仪可由仪器自身完成) 1校正条件 1.1环境温度10-30℃，相对湿度低于65% 1.2校正设备 1.2.1秒表分度值小于0.1 s 1.2.2分析天平最大称量200g,最小分度值0.1mg 1.2.3容量瓶 1.2.4微量注射器 1.3标准物质和试剂 1.3.1HPLC用甲醇、纯水，分析纯的丙酮 1.3.21×10-4g/ml，1×10-7g/ml的萘甲醇溶液 1.3.3紫外波长标准溶液 2校正方法 2.1梯度误差G C的校正 2.1.1进行梯度洗脱程序，A溶剂为水，B溶剂为0.1%丙酮的水溶液，B经5个阶段从0变到100%， 20%—40%—60%—80%—100%，重复测量两次，取平均值，求各段梯度误差Gci，取最大作为仪器梯度误差，公式：Gci=（Li—Lm）/Lm×100% Li：第i段信号值的平均值； Lm ：各段输出信号平均值的平均值 可接受标准： -3%≤Gci≤3% 2.2泵流量设定值误差Ss、流量稳定性误差S R的校正 2.2.1将仪器的输液系统、进样器、色谱柱和检测器联接好，以甲醇为流动相，按表一设定流量，待 流速稳定后，在流动相排出口用事先清洗称重过的容量瓶收集流动相，同时用秒表计时，准确的收集10-25
乳制品中三聚氰胺的高效液相色谱检测法
乳制品中三聚氰胺的高效液相色谱检测法 三聚氰胺（Melamine）是一种重要的三嗪类含氮杂环有机化工原料，主要用于生产三 聚氰胺-甲醛树脂，广泛用于木材加工、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革等行业，为白色晶体。三鹿奶粉事件引发了对三聚氰胺检测的广泛关注，国家质量监督检验检疫总局和国家标 准化管理委员会相继发布了《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》（GB/T22388-2008）和《原料乳中三聚氰胺快速检测液相色谱法》（GB/T22400-2008）的国家标准。本文参考了 以上标准并进行配制条件优化，建立了液相色谱检测法，前处理简单，检测限、精密度、重 现性以及回收率均符合国家标准。 1 实验部分 1.1 仪器与试剂 LC1620高效液相色谱仪（含UV1620紫外-可见检测器1台，P1620高压恒流泵1台，上海 舜宇恒平科学仪器有限公司）；AT-330色谱柱温箱（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；FA2004 分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；TGL-16G-A离心机（上海安亭科学仪器厂）； 三聚氰胺标准品(>99%，上海安谱)；辛烷磺酸钠(色谱纯，北京百灵威)；磷酸(分析纯)、乙 腈(色谱纯，美国Tedia)、纯净水(杭州娃哈哈)。 1.2 标准品溶液配制 精密称取三聚氰胺标准品，溶于50％的甲醇水溶液，配制称1.422mg/ml的标准储备液，于4℃避光保存。根据实验需要，用流动相逐级稀释成适当浓度的标准工作液。 1.3 样品前处理 称取2g酸奶样品与50ml具塞离心管中，加入乙腈：水＝50：50混合溶液15ml，充分混匀 后超声提取15min。取提取液250ul，加入0.1mol/l盐酸750ul，混匀，以12000r/min离心 5min，取上清液，0.22um滤膜过滤，作为HPLC测定溶液。 1.4 色谱条件： 色谱柱：Globalsil C18 5μm(ID4.6mm×250mm) 流动相：乙腈/缓冲盐=15/85（缓冲盐：10mM辛烷磺酸钠水溶液，含0.1％磷酸） 流速：1.0ml/min 波长：240nm 温度：40℃ 进样量：20μl 2 实验结果 2.1 精密度实验 取浓度为0.569μg/ml三聚氰胺标准工作液，按上述色谱条件，连续进样5次，以各成分峰 面积计算RSD(%)，所得结果如表1所示：保留时间相对标准偏差（RSD）为0.23％，峰面 积RSD为0.57％。 表1 精密度实验 time（min）Peak High Peak Area NO. Retention 1 11.933 289 4216.8 2 11.990 290 4264.2 3 11.928 287 4246.0 4 11.927 287 4242.8 5 11.923 284 4218.6 RSD(%) 0.23 0.82 0.57
高效液相色谱法简介
高效液相色谱法简介 “色谱”一词是由俄国科学家斯威特提出的。色谱法是基于补充物质在相对运动物的两相之间分布时，物理或物理化学性质的微小的差异而使混合物相互分离的一类分离或分析方法。发展与上世纪初，飞速发展于五十年代，有超过30位科学家家因为它而获得诺贝尔奖，其有自己的理论和研究方法，同时也有众多的应用领域。 色谱法常见的方法有：柱色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等。 柱色谱：柱色谱法是最原始的色谱方法，这种方法将固定相注入下端塞有棉花或滤纸的玻璃管中，将被样品饱和的固定相粉末摊铺在玻璃管顶端，以流动相洗脱。常见的洗脱方式有两种，一种是自上而下依靠溶剂本身的重力洗脱，一种是自下而上依靠毛细作用洗脱。收集分离后的纯净组分也有两种不同的方法，一种方法是在柱尾直接接受流出的溶液，另一种方法是烘干固定相后用机械方法分开各个色带，以合适的溶剂浸泡固定相提取组分分子。柱色谱法被广泛应用于混合物的分离，包括对有机合成产物、天然提取物以及生物大分子的分离。 薄层色谱：薄层色谱法是应用非常广泛的色谱方法，这种色谱方法将固定相图布在金属或玻璃薄板上形成薄层，用毛细管、钢笔或者其他工具将样品点染于薄板一端，之后将点样端浸入流动相中，依靠毛细作用令流动相溶剂沿薄板上行展开样品。薄层色谱法成本低廉操作简单，被用于对样品的粗测、对有机合成反应进程的检测等用途。
气相色谱：GC主要是利用物质的沸点、极性及吸附性质的差异来实现混合物的分离。待分析样品在汽化室汽化后被惰性气体（即载气，也叫流动相）带入色谱柱，柱内含有液体或固体流动相，由于样品中各组分的沸点、极性或吸附性能不同，每种组分都倾向于在流动相和固定相之间形成分配或吸附平衡。但由于载气是流动的，这种平衡实际上很难建立起来。也正是由于载气的流动，使样品组分在运动中进行反复多次的分配或吸附/解吸附，结果是在载气中浓度大的组分先流出色谱柱，而在固定相中分配浓度大的组分后流出。当组分流出色谱柱后，立即进入检测器。检测器能够将样品组分的与否转变为电信号，而电信号的大小与被测组分的量或浓度成正比。当将这些信号放大并记录下来时，就是气相色谱图了。气相色谱被广泛应用于小分子量复杂组分物质的定量分析。 高效液相色谱：高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9-107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。高效液相色谱（HPLC）是目前应用最多的色谱分析方法，高效液相色谱系统由流动相储液体瓶、输液泵、进样器、色谱柱、检测器和记录器组成，其整体组成类似于气相色谱，但是针对其流动相为液体的特点作出很多调整。HPLC的输液泵要求输液量恒定平稳；进样系统要求进样便利切换严密；由于液体流动相粘度远远高于气体，为了减低柱压高效
高效液相色谱法测定甲硝唑的含量
实验二高效液相色谱法测定甲硝唑的含 量 一、实验目的 1.熟悉高效液相色谱仪主要结构组成及功能。 2.了解反相色谱法的原理、优点和应用。 3.了解流动相的选择依据及配制方法。 4.掌握高效液相色谱法进行定性和定量分析的基本方法。 二、实验原理 高效液相色谱法是采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离，并依次进入检测器，由数据处理系统记录色谱信号。本实验以甲硝唑为测定对象，以反相HPLC来分离检测未知样中甲硝唑的含量。以甲硝唑标准系列溶液的色谱峰面积对其浓度进行线性回归，再根据样品中甲硝唑的峰面积，由线性方程计算其浓度。 三、实验内容 （一）实验仪器与材料 1.实验仪器：高效液相色谱仪、精密天平、50mL烧杯、玻璃棒、称量纸、10mL容量瓶、50mL 容量瓶、注射器、洗瓶。 2.实验材料：甲硝唑原料、蒸馏水、HCl（0.1mol/L）、乙腈、三氟乙酸、超纯水。 （二）实验内容 1、色谱操作条件的制定： 色谱柱：C18柱（250×4.6mm,5μm）； 流动相：乙腈：0.02%三氟乙酸水溶液（20：80） 流速：1mL/min 检测波长：277nm 柱温：35℃ 进样量：20μL 2、标准溶液配制 精密称取在105℃条件下干燥至恒重的甲硝唑对照品10mg，置于50mL容量瓶中，用0.1mol/L的HCl溶液溶解并定容至刻度，即得浓度为0.2mg/mL的甲硝唑标准储备液，备用。 3、标准曲线的建立 （1）精密量取甲硝唑标准储备液分别为0.3mL、0.5 mL、0.7 mL、0.9 mL、1.1 mL置于10 mL的容量瓶中，然后用0.1mol/L的HCl溶液定容至刻度，得到浓度梯度为6μg/mL、10μg/mL、14μg/mL、18μg/mL和22μg/mL的标准溶液，分别过0.22μm的微孔滤膜过滤，滤
高效液相色谱法的标准操作规程
高效液相色谱法的标准操作规程 1 定义及概述： 1.1 高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液作为流动相，用高压输液泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。由于应用各种性质的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高、分析速度快的特点。 1.2 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。有的药品需要在色谱分离前或后经过衍生化反应，方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等填充剂是有一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。 1.3 高效液相色谱仪基本由泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理组成。检测器最常用的为可变波长紫外检测器或紫外—可见检测器。色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。 2 高效液相色谱仪的使用要求： 2.1 按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程”的规定作定期检定，应符合规定。 2.2 仪器各部件应能正常工作，管路为无渗漏连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。 2.3 具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。
高效液相色谱方法的验证
高效液相色谱方法的验证 ?方法验证的目的 ?方法验证的内容 ?方法验证的项目及测定方法
方法验证的目的 目的：证明采用的方法适合相应检测的要求。 方法验证是实验室针对特定方法的研究过程，通过设计方案，有步骤、系统地收集、处理实验数据，最终形成文件，以证明所用试验方法准确、灵敏、专属并重现。同一分析方法用于不同的检测项目会有不同的验证要求。
方法验证的内容 ?准确度 ?精密度 ?专属性 ?检测限 ?定量限 ?线性和范围 ?耐用性
准确度 定义：方法测定结果与真实值或参考值的接近程度。一般用回收率%表示。 1. 主成分含量测定 原料药：对照品或方法比对 2. 制剂、中药：标准加样回收 杂质定量 测定：加样回收（n 3 9） 杂质对照品 方法比对 回收率 C-A %=′ B 100% 杂质与主成分的相对含量 A:试验供试品中被测成分的量 （通常为含量测定量的50%） B: 试验供试品中加入的对照品的量 （通常为±20%） C:试验测定值
精密度 定义：在规定测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。一般用偏差，相对偏差和相对标准偏差 1. 重复性（n 9） 3 2. 中间精密度 3. 重复性 测定：HPLC方法的精密度测试，应从样品制备开始，设计3个浓度， 分别平行制备3份，以测定含量计算相对标准偏差；或同一样品平行制备6份供试品，分别进样，以峰面积计算相对标准偏差。 同一份供试品连续进样6次，计算得到的相对标准偏差只能表征进样精密度，不能作为方法精密度。
专属性 定义：在其它成分可能存在下，方法能正确测定出被测物的特性。 1. 鉴别反应 2. 含量测定 杂质测定 测定： 限量检查 空白制剂，模拟复方 加速破坏试样测试 DAD峰纯度检查
(推荐)高效液相色谱法的分类及原理
高效液相色谱法的分类及其分离原理 高效液相色谱法分为：液-固色谱法、液-液色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法。 1.液-固色谱法（液-固吸附色谱法） 固定相是固体吸附剂，它是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分配的。 ①液-固色谱法的作用机制 吸附剂：一些多孔的固体颗粒物质，其表面常存在分散的吸附中心点。 流动相中的溶质分子X（液相）被流动相S带入色谱柱后，在随载液流动的过程中，发生如下交换反应： X（液相）+nS（吸附）<==>X（吸附）+nS（液相） 其作用机制是溶质分子X（液相）和溶剂分子S（液相）对吸附剂活性表面的竞争吸附。 吸附反应的平衡常数K为： K值较小：溶剂分子吸附力很强，被吸附的溶质分子很少，先流出色谱柱。 K值较大：表示该组分分子的吸附能力较强，后流出色谱柱。 发生在吸附剂表面上的吸附-解吸平衡，就是液-固色谱分离的基础。 ②液-固色谱法的吸附剂和流动相 常用的液-固色谱吸附剂：薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等。 一般规律：对于固定相而言，非极性分子与极性吸附剂（如硅胶、氧化铜）之间的作用力很弱，分配比k较小，保留时间较短；但极性分子与极性吸附剂之间的作用力很强，分配比k大，保留时间长。 对流动相的基本要求： 试样要能够溶于流动相中 流动相粘度较小 流动相不能影响试样的检测 常用的流动相：甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等。 ③液-固色谱法的应用 常用于分离极性不同的化合物、含有不同类型或不；数量官能团的有机化合物，以及有机化合物的不同的异构体；但液-固色谱法不宜用于分离同系物，因为液-固色谱对不同相对分子质量的同系物选择性不高。 2.液-液色谱法（液-液分配色谱法） 将液体固定液涂渍在担体上作为固定相。 ①液-液色谱法的作用机制 溶质在两相间进行分配时，在固定液中溶解度较小的组分较难进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定液中溶解度较大的组分容易进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离的目的。 液-液色谱法与液-液萃取法的基本原理相同，均服从分配定律：K=C固/C液 K值大的组分，保留时间长，后流出色谱柱。 ②正相色谱和反相色谱 正相分配色谱用极性物质作固定相，非极性溶剂（如苯、正己烷等）作流动相。 反相分配色谱用非极性物质作固定相，极性溶剂（如水、甲醇、己腈等）作流动相。
高效液相色谱
高效液相色谱 高效液相色谱仪 高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。 目录 化学信息 基本信息 性状描述 物理说明 药理作用 危险说明 历史 特点 主要类型 结构组成 综述 高压输液泵 色谱柱 进样器 检测器 馏分收集器 数据获取和处理系统 分离原理 液—固色谱法 离子交换色谱法 离子对色谱法
离子色谱法 空间排阻色谱法 流程 使用方法 综述 色谱柱的理论板数分离度 拖尾因子 测定方法 综述 面积归一化法 主成分自身对照法内标法 外标法 设备选型 综述 相对分子质量 溶解度 化学结构 仪器设备 综述 高压泵 梯度洗提 进样装置 色谱柱 检测器 应用实例 化学信息 基本信息 性状描述 物理说明 药理作用 危险说明 历史 特点 主要类型 结构组成 综述 高压输液泵 色谱柱 进样器 检测器 馏分收集器 数据获取和处理系统
分离原理 液—固色谱法 离子交换色谱法 离子对色谱法 离子色谱法 空间排阻色谱法 流程 使用方法 综述 色谱柱的理论板数 分离度 拖尾因子 测定方法 综述 面积归一化法 主成分自身对照法 内标法 外标法 设备选型 综述 相对分子质量 溶解度 化学结构 仪器设备 综述 高压泵 梯度洗提 进样装置 色谱柱 检测器 应用实例 展开 化学信息 基本信息 中文名称：葛根素(HPLC),98% 中文别名：葛根黄酮，8-beta-D-葡萄吡喃糖-4',7-二羟基异黄酮 英文名称：Puerarin 英文别名：8-(β-D-Glucopyranosyl-7-hydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one 纯度：98% CAS号：3681-99-0 分子式：C21H20O9 分子量：416.38
高效液相色谱法测定手册
高效液相色谱法测定手册 一目的：制定高效液相色谱法，规范高效液相色谱法的测定操作。 二适用范围：适用于高效液相色谱法的测定。 三责任者：品控部。 四正文 1 简述 高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液，作为流动相，用泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。由于应用了各种特性的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高，分析速度快的特点。 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。有的药品需在色谱分离前或后经过衍生化反应方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱；离子交换填料，用于离子交换色谱；具一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。 高效液相色谱仪基本由泵，进样器，色谱柱，检测器和色谱数据处理系统组成。检测器最常用的为可变波长紫外可见光检测器，其他检测器有如示差折光检测器和蒸发光散射检测器等。色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。 2 高效液相色谱仪的使用要求 2.1 按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程（JJG705—90）”的规定作定期检定，应符合规定。 2.2 仪器各部件应能正常工作，管路为无死体积连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。 2.3 具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。
实用高效液相色谱法的建立破解版
液相色谱方法开发（实例讲解） 2010? 未经许可，不得复制。转载请注明出处。 色谱分离与在线检测技术已经成为当今分析化学的一门重要学科，而因其衍生出的相关产品也日益丰富。对色谱工作者来说，在面对具体方法开发中如何获得适当的分离度则成为关注的焦点。本文仅从网络上的资源收集简要介绍反相液相色谱法的建立思路。 一、 基本术语基本术语 读者可跳过本部分内容，直接阅读实例讲解部分 在评价色谱分离的品质时，通常用以下相关术语来反映色谱特征（如图1.）： 图1. 典型色谱图 1. 保留因子(k)： t t t k R ?= (1) 用于反映化合物的色谱保留性质，跟化合物性质有密切关系。如图1，设t R1 =3.65min, t 0 =1.20min, 则峰1的保留因子为：(3.65-1.20)/1.20=2.04 2. 拖尾因子(T f )
液相色谱方法开发（实例讲解） 2010? 未经许可，不得复制。转载请注明出处。 a b a f W W W T 2+= (2) 图2. 典型拖尾峰 在理想情况下，色谱峰为高斯型对称峰，其拖尾因子为1.0，但在实际情况中，由于化合物的二次保留等其他因素，色谱峰大多会呈现一定程度的拖尾。如图2中，该色谱峰的拖尾因子可计算得：{(41.5-37.0)+(37.0-35.0)}/{2*(37.0-35.0)}=1.63. 3. 理论塔板数（N ）
液相色谱方法开发（实例讲解） 2010? 未经许可，不得复制。转载请注明出处。 图3. 峰高与峰宽的关系 2(16W t N R = (3) 或 2( 54.55 .0W t N R = (4) 注意：在上式中W 为图3中的W b ，为基线峰宽(4σ)，W 0.5 为峰高一半处的峰宽W h (2.335σ), 并非峰宽的一半(2σ)。 设图1中峰1的基线峰宽为0.25min, 则塔板数为：16*(3.65/0.25)^2=3410 4. 分离因子(α) 10 212t t t t k k R R ??= =α (5) 又称两个色谱峰的相对保留值。只有当α>1时，两个色谱峰才有分离的可能性。 设在图1中峰2的保留时间为6.50min, 则分离因子为: (6.50-1.20)/(3.65-1.20)=2.16
高效液相色谱法测定有机化合物的含量
实验四高效液相色谱法测定有机化合物的含量 [目的要求] 1、了解仪器各部分的构造及功能。 2、掌握样品、流动相的处理，仪器维护等基本知识。 3、学会简单样品的分析操作过程。 [基本原理] 高效液相色谱仪液体作为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的主色谱分离技术，在基本理论方面与气相色谱没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质差别。与气相色谱相比，高效液相色谱对样品的适用性强，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，可以弥补气相色谱法的不足。 液相色谱根据固定向的性质可分为吸附色谱、键合相色谱、离子交换色谱和大小排阻色谱。其中反相键合相色谱应用最广，键合相色谱法是将类似于气相色谱中固定液的液体通过化学反应键合到硅胶表面，从而形成固定相。若采用极性键合相、非极性流动相，则称为正相色谱；采用非极性键合相，极性流动相，则称为反相色谱。这种分离的保留值大小，主要决定于组分分子与键合固定液分子间作用力的大小。 反相键合相色谱采用醇-水或腈-水体系作为流动相，纯水廉价易得，紫外吸收小，在纯水中添加各种物质可改变流动相选择性。使用最广泛的反相键合相是十八烷基键合相，即让十八烷基（C18H37―）键合到硅胶表面，这也就是我们通常所说的碳十八柱。 [仪器试剂] 高效液相色谱仪（包括储液器、高压泵、自动进样器、色谱柱、柱温箱、检测器、工作站）、过滤装置 待测样品（浓度约100 ppm）、甲醇、二次水 [实验步骤] 1、仪器使用前的准备工作 （1）样品与流动相的处理 配好的溶液需要用0.45 μm的一次性过滤膜过滤。纯有机相或含一定比便例有机相的就要用有机系的滤膜，水相或缓冲盐的就要用水系滤膜。 水、甲醇等过滤后即可使用；水放置一天以上需重新过滤或换新鲜的水。含稳定剂的流动相需经过特殊处理，或使用色谱纯的流动相。 （2）更换泵头里清洗瓶中的清洗液 流动相不同，清洗液也不同，如果流动相为甲醇-水体系，可以用50%的甲醇；如果流动相含有电解质，通常用95%去离子水甚至高纯水。 如果仪器经常使用建议每周更换两次，如果仪器很少使用则每次使用前必须更换。（3）更换托盘里洗针瓶中的洗液 洗液一般为：50%的甲醇。
高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因(含问题分析)
实验二 高效液相色谱法测定饮料中的咖啡因 一、目的要求 1、学习高效液相色谱仪的操作。 2、了解高效液相色谱法测定咖啡因的基本原理。 3、掌握高效液相色谱法进行定性及定量分析的基本方法。 二、基本原理 咖啡因又称咖啡碱，是由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱，它属黄嘌呤衍生物，化学名称为1,3,7-三甲基黄嘌呤。咖啡因能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。咖啡中含咖啡因约为1.2~1.8%，茶叶中约含2.0~4.7%。可乐饮料、APC 药片等中均含咖啡因。其分子式为C 8H 10O 2N 4，结构式为： N N CH 3 H 3C O O N N CH 3 定量测定咖啡因的传统分析方法是采用萃取分光光度法。用反相高效液相色谱法将饮料中的咖啡因与其它组分（如：单宁酸、咖啡酸、蔗糖等）分离后，将已配制的浓度不同的咖啡因标准溶液进入色谱系统。如流动相流速和泵的压力在整个实验过程中是恒定的，测定它们在色谱图上的保留时间t R 和峰面积A 后，可直接用t R 定性，用峰面积A 作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测定饮料中的咖啡因含量。 三、仪器和试剂 1、Agilent 1100高效液相色谱仪。 2、色谱柱：Kromasil C18，5μ 150×4.6mm 。 3、流动相：30%甲醇（色谱纯）+70%高纯水；流动相进入色谱系统前，用超声波发生器脱气10min 。 4、 咖啡因标准贮备溶液：将咖啡因在110℃下烘干1h 。准确称取0.1000g 咖啡因，用二次蒸馏水溶解，定量转移至100mL 容量瓶中，并稀释至刻度。标样浓度1000μg·mL -1。 5、测饮料试液：可乐，茶叶，速溶咖啡。
高效液相色谱测定法标准操作规程
标准操作规程 STANDARD OPERATION PROCEDURE 1 目的：建立高效液相色谱测定法操作规程，以使检验操作规化。 2 适用围：适用于高效液相色谱测定法检验操作全过程。 3 责任：QC人员对本SOP实施负责。 4容 高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入色谱柱，各组分在柱被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。 4.1. 对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据 处理系统组成。色谱柱径一般为3.9~4.6mm，填充剂粒径为3~10μ m。超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。 4.1.1. 色谱柱反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合 物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。 正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常用的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。 手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。色谱柱的径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分 离物质的性质来选择合适的色谱柱。温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。 残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在2? 8 之间。残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH 值小于2 或大于8 的流动相。
(完整word版)高效液相色谱仪常用的检测器及其性能
高效液相色谱仪常用的检测器及其性能 (1)紫外吸收(UV)检测器 UV检测器是目前HPLC应用最广泛的检测器。它是依据光吸收原理，以适当的光路和电路，输出一个与试样组分浓度成正比的紫外一可见光吸收信号，其结构与一般光度计相似。其流通池是组分流过的光学通道，池体积一般为8μl，内径小于lmm，长度10mm左右。这种检测器灵敏度高，线性范围宽，对流速和温度变化不敏感，可用于梯度洗脱分离。紫外吸收检测要求被检测样品组分有紫外一可见光吸收，而使用的流动相无吸收，或在被测组分吸收波长处无吸收。一般选择在欲分析物有最大吸收的波长处进行检测，以获得最大灵敏度和抗干扰能力。在没有最大吸收时，可采用末端吸收。检测波长的选择除取决于待测物质的成分和分子结构外，还必须考虑流动相组成、共存组分干扰等因素。特别是各种溶剂都有一定的透过波长下限值，超过这个波长，溶剂的吸收会变得很强，以至于不能很好地测出待测物质的吸收强度。表1列出了HPLC中一些常用的溶剂透过波长的下限。 (2)光电二极管阵列(IJDA)检测器 PDA检测器又称为二极管阵列检测器(diode array UV detector，DAD)，这种检测器以光电二极管阵列作为检测元件，可进行多通道并行检测，在一次色谱测量中，可同时获得时间、波长、吸光度三者的关系，通过计算机处理，在荧光屏上显示出三维图谱，也可作出任意波长的吸光度一时问曲线和任意时间的吸光度一波长曲线。DAD的光路与紫外检测器不同，光源发出的光聚焦后先通过检测池，通过检测池的透射光由全息光栅色散成多色光，不同波长的色散光按波长顺序聚焦在阵列元件上，每个元件对应一定的纳米数。当光照射到光电二极管时，光电二极管产生讯号。由于色散过程及透射光的检测是全波长范围的，可在瞬间检测流经检测池的全吸收光谱，得到三维色谱一光谱图。计算机化的数据处理，还可进行色谱峰光谱相似性比较、峰纯度检测及利用谱图库对掣定样品进行检索等，为定性、定量分析提供更丰富的信息。 ①多通道多波长检测可以同时得到多个波长的色谱图，每个成分均可在最佳波长下检测定量。 ②光谱相似性比较在HPLC中，两个物质出峰时间一致并不能完全说明为同一物质，通过色谱峰紫外光谱一致性比较，可提高测定的可靠性。 ③峰纯度检测对色谱峰峰顶、上、下3个点的光谱进行比较，完全吻合意味这是1个单组分峰，不吻合则表示为未分离峰。并可计算出纯度系数PI，PI值在0~1之问，越接近1，表示峰纯度越好，PI可由计算机自动计算。 ④光谱检索与比较二极管阵列检测器得到的光谱图可分类存储到光谱库中，当测定类似成分时，可调出相关谱图，进行检索和比较，也可通过比较光谱相似系数比较相似性。
高效液相色谱测定法标准操作规程
标准操作规程 1目的：建立高效液相色谱测定法操作规程，以使检验操作规化。 2适用围：适用于高效液相色谱测定法检验操作全过程。 3责任：QC人员对本SOP实施负责。 4容 高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入色谱柱，各组分在柱被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。 4.1.对仪器的一般要求和色谱条件 高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。色谱柱径一般为3.9~4.6mm，填充剂粒径为3~10μm。超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。 4.1.1.色谱柱 反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。 正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常用的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。 手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。 色谱柱的径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分
离物质的性质来选择合适的色谱柱。 温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。 残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在 2?8之间。残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH 值小于2或大于8 的流动相。 4.1.2.检测器 最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与被测物质的量有关，还与其结构有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用检测器，对所有物质均有响应。结构相似的物质在蒸发光散射检测器的响应值几乎仅与被测物质的量有关。 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器的响应值与被测物质的量在一定围呈线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与被测物质的量通常呈指数关系，一般需经对数转换。 不同的检测器，对流动相的要求不同。紫外-可见分光检测器所用流动相应符合紫外-可见分光光度法（通则0401）项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器不得使用含不挥发性盐的流动相。 4.1.3.流动相 反相色谱系统的流动相常用甲醇-水系统和乙腈-水系统，用紫外末端波长检测时，宜选用乙腈-水系统。流动相中应尽可能不用缓冲盐，如需用时，应尽可能使用低浓度缓冲盐。用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时，流动相中有机溶剂一般不低于5％，否则易导致柱效下降、色谱系统不稳定。 正相色谱系统的流动相常用两种或两种以上的有机溶剂，如二氯甲烷和正己烷等。 品种正文项下规定的条件除填充剂种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱径与长度、填充剂粒径、流动相流速、流动相组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等，均可适当改变，以达到系统适用性试验的要求。调整流动相组分比例时，当小比例组分的百分比例X小于等于33%时，允许改变围为0.7X?1.3X；当X大于33%时，允许改变围为X—10%?X+10% 。
高效液相色谱法(HPLC)的概述
此帖与GC版的对应，是为了让大家更好的学习和了解LC 主要内容包括： 1.高效液相色谱法（HPLC）的概述 2. 高效液相色谱基础知识介绍（1——13楼） 3. 高压液相色谱HPLC发展概况、特点与分类 4. 液相色谱的适用性 5.应用 高效液相色谱法（HPLC）的概述 以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。其基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色信号或进行数据处理而得到分析结果。 由于高效液相色谱法具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）、色谱柱可反复使用的特点，在《中国药典》中有5 0种中成药的定量分析采用该法，已成为中药制剂含量测定最常用的分析方法。 高效液相色谱法按固定相不同可分为液-液色谱法和液-固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液-液色谱）和吸附色谱法（液-固色谱）等。 目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，不易流失是其特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。C18（ODS）为最常使用的化学键合相。 根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相
的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。 在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。 系统组成： （一）高压输液系统 由贮液罐、脱气装置、高压输液泵、过滤器、梯度洗脱装置等组成。 1.贮液罐 由玻璃、不锈钢或氟塑料等耐腐蚀材料制成。贮液罐的放置位置要高于泵体，以保持输液静压差，使用过程应密闭，以防止因蒸发引起流动相组成改变，还可防止气体进入。2.流动相 流动相常用甲醇-水或乙腈－水为底剂的溶剂系统。 流动相在使用前必须脱气，否则很易在系统的低压部分逸出气泡，气泡的出现不仅影响柱分离效率，还会影响检测器的灵敏度甚至不能正常工作。脱气的方法有加热回流法、抽真空脱气法、超声脱气法和在线真空脱气法等。 3.高压输液泵 是高效液相色谱仪的关键部件之一，用以完成流动相的输送任务。对泵的要求是：耐腐蚀、耐高压、无脉冲、输出流量范围宽、流速恒定，且泵体易于清洗和维修。高压输液泵可分为恒压泵和恒流泵两类，常使用恒流泵（其压力随系统阻力改变而流量不变）。 （二）进样系统 常用六通阀进样器进样，进样量由定量环确定。操作时先将进样器手柄置于采样位置（L OAD），此时进样口只与定量环接通，处于常压状态，用微量注射器（体积应大于定量环体积）注入样品溶液，样品停留在定量环中。然后转动手柄至进样位置（INJECT），使定量环接入输液管路，样品由高压流动相带入色谱柱中。 （三）色谱柱 由柱管和填充剂组成。柱管多用不锈钢制成。柱内填充剂有硅胶和化学键合固定相。在化学键合固定相中有十八烷基硅烷键合硅胶（又称ODS柱或C18柱）、辛烷基硅烷键合硅
高效液相色谱(HPLC)柱效测定
实验六高效液相色谱(HPLC)柱效测定 093858 张亚辉 一. 实验目的 1、学习高效液相色谱仪的基本操作方法。 2、了解高效液相色谱仪原理和条件设定方法。 3、了解高效液相色谱法在日常分析中的应用。 二. 实验原理 高效液相色谱法是以液体作为流动相，借助于高压输液泵获得相对较高流速的液流以提高分离速度、并采用颗粒极细的高效固定相制成的色谱柱进行分离和分析的一种色谱方法。 在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，即构成反相色谱分离系统。反之，则称为正相色谱分离系统。反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。 定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。分离度（R）的计算公式为： R＝ 2[t(R2)-t(R1)] /1.7*(W1＋W2) 式中 t(R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间； t(R1)为相邻两峰中前一峰的保留时间； W1及W2为此相邻两峰的半峰宽。除另外有规定外，分离度应大于1.5。 本实验对象为邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAE，常被用作塑料增塑剂。它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品，如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液等数百种产品中。但研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，是一类内分泌干扰物。待测物性质见表1。 表1色谱柱测试条件
如果要检测不同条件对谱图分离的影响，可按表1配制几种物质的混合溶液，在不同条件下进行HPLC分离检测。 三.仪器与试剂 1、仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪，50ul微量注射器。 2、试剂 甲醇（色谱专用），高纯水 四. 实验步骤 1、色谱条件 色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶（C8） 柱温：室温 流动相：初始为高纯水：20％，甲醇：80％ 检测器：DAD检测器; 检测波长：220nm； 进样体积：20μl定量环，实际注射每次可控制在40μl。 2、待测溶液的配制 首先用甲醇做溶剂配制储备液：邻苯二甲酸二甲酯（0.3880g/L），邻苯二甲酸二乙酯（0.2770g/L），邻苯二甲酸二丁酯（0.3776g/L）。然后各取1mL储备液用水和甲醇（20：80）稀释至10mL，作为待测溶液。 3、色谱测定 (1) 按操作规程开启电脑，开启脱气机、泵、检测器等的电源，启动Agilent 1100在线工作软件，设定操作条件。流量为1.000ml/min。 (2) 待仪器稳定后，开始进样。将进样阀柄置于“LOAD”位置，用微量注射器吸取混合物溶液40ul，注入仪器进样口，顺时针方向扳动进样阀至“INJECT”位置，此时显示屏显示进样标志。 (3) 记下各组分色谱峰的保留时间及峰面积及分离比。 (4) 实验完毕，清洗系统及色谱柱。依次用甲醇-水（60：40）、甲醇-水（70：30）……直到纯甲醇作流动相清洗，每次清洗至基线走稳，至少清洗15min。 五.实验结果