植物基因工程真题资料

植物基因工程真题(2011-2013)

一、名词解释

1. Southern blotting：是指通过吸附或电泳方法将经凝胶电泳分离的大分子物质从胶上转移到固相载体上，再与特定的探针反应从而达到检测或鉴定这些大分子物质的过程。

2. cis-acting elemen t顺式作用元件，存在于基因旁侧序列中能影响基因表达的序列，包括启动子、增强子、调控序列和可诱导元件等。它们的作用是参与基因表达的调控，本身不编码任何蛋白质，仅仅提供一个作用位点，要与反式作用因子相互作用而起作用。

3. subcloing:

4. Gene libray

5. Yeast Two-Hybrid Assays:

6. qRT-PCR

7. Shuttle plasmid vector

8. insert in activati on

9. cDNA library

10. RNAi

11. Gene kn ockout

12. Tran sducti on and tran sfect ion

13. DNA probe

14. En zyme-li nked immuno sorbe nt assay

15. Tran spositi onal recomb in ati on

16. EST

17. Fluoresce nee in situ hybridizati on 18. q-per 19. SNP

1. Per 反应原理和步骤；基本反应过程有哪些；反应体系与反应条件？简要介绍

温度和时间设臵间的关系?

PCR 反应原理：DNA 的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链 DNA 在多种

酶的作用下可以变性解旋成单链，在 DNA 聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成 同样的两分子挎贝。在实验中发现，

DNA 在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又

可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制 DNA 的变性和复性，加入设计引物，

DNA

聚合酶、dNTP 就可以完成特定基因的体外复制。

步骤：由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA 的变性：模板DNA 经 加热至（90-96C ）左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR 扩增形成的双链 DNA 解离， 使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA 与引物的退火（复性）： 模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至（ 25-65C ）左右，引物与模板 DNA 单链的互补

序列配对结合；③引物的延伸：DNA 模板--引物结合物在（70-75C ）、DNA 聚合酶（如TaqDNA 聚合酶）的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原

理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就 可获得更多的 ？半保留复制链？，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环 需2?4分钟，2?3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 标准的反应体系：

10 X 扩增缓冲液 4种dNTP 混合物 引物 模板DNA Taq DNA 聚合酶 Mg2+

加双或三烝水至

5ul

各 200mol/L 各 10?100pmol 0.1 ?2 ig 1?2 U 1.5?2.0mmol/L 50 il

反应条件：为温度、 时间和循环次数。 温度和时间设臵间的关系： 基于PCR 原理三步骤而设臵变性-退火-延伸三个温度点。 在

标准反应中采用三温度点法，双链

DNA 在90?95 C 变性，再迅速冷却至 40?60 C,引物

退火并结合到靶序列上，然后快速升温至

70?75 C,在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物

链沿模板延伸。对于较短靶基因（长度为100?300bp 时）可采用二温度点法，

除变性温度外、

退火与延伸温度可合二为一， 一般采用94 C 变性，65 C 左右退火与延伸（此温度Taq DNA 酶 仍有较高的催化活性）。 ①

变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致

PCR 失败的最主要原因。一般情

况下，93 C ?94 C lmi 足以使模板DNA 变性，若低于93 C 则需延长时间，但温度不能过高， 因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或 致PCR 失败。

② 退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR 特异性的较重要因素。

变性后温度快速

简单题

PCR 产物完全变性，就会导

冷却至40 C?60 C,可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和

模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的

长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引

物，55 C为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合

适的温度：

Tm 值(解链温度)=4(G+C) + 2(A+T)

复性温度=Tm值-(5?10 C)

在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30?60sec足以使引物与模板之间完全结合。

③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：

70?80 C 15(核苷酸/S/酶分子70 C 60核苷酸/S/酶分子

55 C 24核苷酸/S/酶分子

高于90 C时，DNA合成几乎不能进行。

PCR反应的延伸温度一般选择在70?75 C之间，常用温度为72 C,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb 以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3?4kb的靶序列需3?4min；扩增10Kb需延伸至

15mi n。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。

循环次数循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30?40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。

2. 基因工程载体的构建需要考虑哪些方面的因素？

主要考虑以下几方面的因素。

(1)基因的特点：如果一个来自动物的目的基因含有内含子，就不能用于转基因植物，

因为动物中内含子的剪接系统与植物的不同，植物不能将动物基因的内含子剪切掉，只能用该基因的cDNA。基因的产物如果是一个糖蛋白，那么该基因在原核生物细菌中表达出来的

蛋白就可能不具备天然状态下的活性，因为糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加上的，而细菌无这些细胞器。

(2)要选择强启动子或组织特异性启动子。启动子有强有弱，选择强启动子可以增加

转录活性，使基因产物量增多。如果希望基因在生物的某个组织表达，如只在植物种子中表达，就要选择种子中特异表达的启动子。

(3)要有选择标记基因，如抗生素基因，以便选择出真正的转基因生物。

3. 转录因子包括什么主要的功能结构域？其主要的结构特点与功能是什么？

作为蛋白质的转录因子从功能上分析其结构可包含有不同区域：①DNA结合域(DNA binding domain),多由60-100个氨基酸残基组成的几个亚区组成；②转录激活域( activating domain),常由30-100氨基酸残基组成，这结构域有富含酸性氨基酸、富含谷氨酰胺、富含脯氨酸等不同种类，一酸性结构域最多见；③连接区，即连接上两个结构域的部分。不与DNA直接结合的转录因子没有DNA结合域，但能通过转录激活域直接或间接作用与转录复合体而影响转录效率。

与DNA结合的转录因子大多以二聚体形式起作用，与DNA结合的功能域常见有以几

种：①螺旋-转角-螺旋（helix-turn-helix，HTH）及螺旋-环-螺旋（helix-loop-helix，HLH）这类结构至少有两个a螺旋其间由短肽段形成的转角或环连接，两个这样的motif结构以二聚

体形式相连，距离正好相当于DNA 一个螺距（3.4nm）两个a螺旋刚好分别嵌入DNA的深沟。②锌指（zincfinger）其结构如图所示，每个重复的？指?状结构约含23个氨基酸残基，锌以4个配价键与4个半胱氨酸、或2个半胱氨酸和2个组氨酸相结合。整个蛋白质分子可有2-9个这样的锌指重复单位。每一个单位可以其指部伸入DNA双螺旋的深沟，接触5个

核苷酸。例如与GC盒结合的转录因子SP1中就有连续的3个锌指重复结构。③碱性-亮氨酸拉链（basic leucine zipper, bZIP ）这结构的特点是蛋白质分子的肽链上每隔6个氨基酸就有一个亮氨酸残基，结果就导致这些亮氨酸残基都在a螺旋的同一个方向出现。两个相同的结构的两排亮氨酸残基就能以疏水键结合成二聚体，这二聚体的另一端的肽段富含碱性氨

基酸残基，借其正电荷与DNA双螺旋链上带负电荷的磷酸基团结合。若不形成二聚体则对DNA的亲和结合力明显降低。在肝脏、小肠上皮、脂肪细胞和某些脑细胞中有称为C/EBP 家族的一大类蛋白质能够与CAAT盒和病毒增强子结合，其特征就是能形成bZIP二聚体结

构。

4. 当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时，若要进行双酶切，应采取什么措施？为什么？

注意星活性（所谓星活性又称Star活性。是指由于反应条件不同而产生的切断与原来认识序列不同的位点的现象，也就是说产生Star活性后，不但可以切断特异性的识别位点，还可以切断非特异性的位点。产生Star活性的结果是酶切条带增多。），先低盐，后高盐；先低温酶，后高温酶；并且可以直接在换酶前将第一种酶失活，再加第二种酶，否则，易产生星活性。或使用通用缓冲液。

5. 对天然质粒的人工构建主要表现在哪些方面？

天然质粒往往存在着缺陷，因而不适合用作基因工程的载体，必须对之进行改造构建：

A,加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择，通常是抗生素基因。

B，增加或减少合适的酶切位点，便于重组。

C，缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量。

D，改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝。

E,根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件。

6双向电泳的主要步骤和原理.

双向电泳是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照蛋白的pl分离），然后再进行SDS-PAGE （按照蛋白的分子量大小分离），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。

实验步骤：

第一向等电聚焦

1）从冰箱中取-20 C冷冻保存的水化上样缓冲液（I）（不含DTT，不含Bio-Lyte）一小管

（1ml/管），臵室温溶解。

2）在小管中加入0.01g DTT，Bio-Lyte 4-6、5-7各2.5ml，充分混匀。

3）从小管中取出400ml水化上样缓冲液，加入100ml样品，充分混匀。

4）从冰箱中取-20 C冷冻保存的IPG预制胶条（17cm pH 4-7）,室温中放臵10分钟。

5）沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。

6）当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后，用镊子轻轻的去除预制IPG 胶条上的保护层。

7）分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝下臵于聚焦盘或水化盘中样品溶液上，

使得胶条的正极（标有）对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶

液弄到胶条背面的塑料支撑膜上，因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下

面的溶液产生气泡。如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。

8）在每根胶条上覆盖2-3ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。

9）对好正、负极，盖上盖子。设臵等电聚焦程序。

10）聚焦结束的胶条。立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳，否则将胶条臵于样品水

化盘中，-20 C冰箱保存。

第二向SDS-PAGE电泳

1）配制10%的丙烯酰胺凝胶两块。配80ml凝胶溶液，每块凝胶40ml,将溶液分别注入玻璃板夹层中，上部留1cm的空间，用MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇封面，保持胶面平整。

聚合30分钟。一般凝胶与上方液体分层后，表明凝胶已基本聚合。

2）待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇，用MilliQ水冲洗。

3）从-20 C冰箱中取出的胶条，先于室温放臵10分钟，使其溶解。

4）配制胶条平衡缓冲液I。

5）在桌上先放臵干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤

纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接臵于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余

样品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。

6）将胶条转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，在有胶条的槽中加入5ml胶条平衡缓冲液

I。将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。

7）配制胶条平衡缓冲液II。

8）第一次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。并用滤纸吸

取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。再加入胶条平衡缓

冲液II，继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。

9）用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的第二向

凝胶放在桌面上，长玻璃板在下，短玻璃板朝上。

10）将琼脂糖封胶液进行加热溶解。

11）将10 x电泳缓冲液，用量筒稀释10倍，成1 x电泳缓冲液。赶去缓冲液表面的气泡。

12）第二次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液II。并用滤纸

吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。

13）将IPG 胶条从样品水化盘中移出，用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在 1 x电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。其余胶条同样操作。

14）将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上，短玻璃板一面对着自己。在凝胶的上方加

入低熔点琼脂糖封胶液。

15）用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时，要注意是推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到胶面。

16）放臵5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。

17）在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。

18）在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，起始时用的低电流（5mA/gel/17cm ）或低电压，待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流（或电压）

（20-30mA/gel/17cm ），待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。

19）电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止污染胶面）。

20）进行染色。

T载体克隆：实验原理重组质粒的构建T质粒载体

重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。

8. 什么是反义RNA ?真核生物中反义RNA调节基因表达的机理是什么？

反义RNA是指与mRNA互补的RNA分子，也包括与其它RNA互补的RNA分子。由于核糖体不能翻译双链的RNA，所以反义RNA与mRNA特异性的互补结合,即抑制了该mRNA的翻译。

在真核生物中除了发现有因互补配对而发生的翻译抑制的情况，还发现了由于互补的双链RNA可被Dicer降解为siRNA，从而进入RNAi途径引起的基因沉默现象。

9. 基因与载体平末端连接的方法有哪些？

第一种就是采用粘性末端连接的策略。通过在你的平末端目的片段两端分别加上含EcoRI和Xhol的酶切位点的接头序列，然后用这两种内切酶分别对目的片段和载体做双酶切，然后回收酶切后的载体和目的片段并连接。第二种就是采用平末端连接的策略。直接将载体双酶切后然后用DNA聚合酶补平所产生的粘性末端，然后和目的片段直接进行平末端

的连接。

10聚丙烯酰胺、琼脂糖在DNA电泳中的区别是什么？

分辨率：聚丙烯酰胺电泳相对琼脂糖凝胶电泳适合分离小片段DNA，分辨率非常强，长度

上相差1bp或质量上相差0.1%的DNA都可以彼此分离。

烦琐性：?聚丙烯酰胺电泳可以很快地进行，并能容纳较大的DNA上样量，但与琼脂糖凝胶

电泳相比在制备和操作上还是更烦琐些。

进行方向: 聚丙烯酰胺电泳是在恒定电场垂直方位上进行的；琼脂糖凝胶电泳是水平方向进

行的。

分离范琼脂糖凝胶电泳较聚丙烯酰胺电泳的分辨率略低，但琼脂糖凝胶电泳的分离范围更广。

装载量：聚丙烯酰胺电泳的装载量远大于琼脂糖凝胶电泳，而其分辨率不受到显著影响.

11典型的DNA重组实验通常包含几步？

①提取供体生物的目的基因（或称外源基因），酶接连接到另一DNA分子上（克隆载体）

形成一个新的重组DNA分子。

②将这个重组DNA分子转入受体细胞并在受体细胞中复制保存，这个过程称为转化。

③对那些吸收了重组DNA的受体细胞进行筛选和鉴定。

④对含有重组DNA的细胞进行大量培养，检测外援基因是否表达。

三、问答和论述题

1. 核算的分子杂交技术（至少三个）的原理、关键技术和存在的问题等，并给

以较具体的说明。

分子杂交是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性标记的探针与

被固定的分子杂交，经显影后显示出目的DNA或RNA分子所处的位臵。根据被测定的对象，分子杂交基本可分为以下几大类：

（1）Southern杂交：DNA片段经电泳分离后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然

后与探针杂交。被检对象为DNA,探针为DNA或RNA。其基本原理是：具有一定同源性的

两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则特异性地杂交形成双链。包括两个主要

过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blott ing ）;二是固定于膜上的核酸与同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。应用：利用Southern印迹法可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中某一基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片断长度多态

性分析（RFLP）等。

⑵Northern杂交：RNA片段经电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后用探针杂交。被检对象为RNA,探针为DNA或RNA。原理：整合到植物染色体上的外源基因如果能正常表达，则转化植株细胞内有其转录产物一一特异mRNA的生成。将提取的植物总RNA或mRNA用变性凝胶电泳分离，则不同的RNA分子将按分子质量大小依次排布在凝胶上；将

他们原位转移到固定膜上；在适宜的离子强度及温度条件下，用探针与膜杂交；然后通过探

针的标记性质检测出杂交体。若经杂交，样品无杂交带出现，表明外源基因已经整合到植物

细胞染色体上，但在该取材部位及生理状态下该基因并未有效表达。

（3）斑点杂交：是指将DNA或RNA样品直接点在硝酸纤维素滤膜上，然后与核酸探针分子杂交，以显示样品中是否存在特异的DNA或RNA。同一种样品经不同倍数的稀释，还可以得到半定量的结果。所以它是一种简便、快速、经济的分析DNA或RNA的方法，在基因分析

和基因诊断中经常用到，是研究基因表达的有力工具。但由于目的序列未与非目的序列分离

，

不能了解目的序列的长度。尤其当本底干扰较高时滩以区分目的序列信号和干扰信号。

（4）菌落原位杂交：对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落（100-200）进行克隆筛选时，可

采用本方法。将这些菌落归并到一个琼脂主平板以及已臵于第二个琼脂平板表面的一张硝酸纤维素滤膜上。经培养一段时间后，对菌落进行原位裂解。