酶促转化产物L-丝氨酸的分析鉴定

酶促转化产物L-丝氨酸的分析鉴定

一、知识准备

按氨基酸具有的酸性和碱性基团的多少分类：中性氨基酸、碱性氨基酸、酸性氨基酸，丝氨酸属于中性氨基酸

氨基酸分子中都具有氨基和羧基，因此它们都能产生氨基与羧基的一般反应。如脂化、甲基化、乙酰化以及酸碱的中和作用等。

丝氨酸（serine）学名：2-氨基-3羟基丙酸。一种脂肪族极性α-氨基酸，非必需氨基酸，有助于免疫血球素和抗体的产生，维持健康的免疫系统。丝氨酸在细胞膜的制造加工、肌肉组织和包围神经细胞的鞘的合成中都发挥着作用。

L-丝氨酸L-Serine缩写：L-Ser，分子式：C3H7NO3 等电点5.68

结构式：CH2OHCH(NH2)COOH 分子量：105.09 。是组成蛋白质

的常见20种氨基酸中的一种，是哺乳动物的非必需氨基酸，也是生酮氨基酸。

性状:六面形片状结晶或棱柱形晶体，味微甜，易溶于水和甲酸，不溶于乙醇和乙醚。可从大豆、酿酒发酵剂、乳制品、鸡蛋、鱼、乳白蛋白、豆荚、肉、坚果、海鲜、种子、乳清和全麦获取。有必要的话，人体会从甘氨酸中合成丝氨酸。L-丝氨酸虽属于非必需氨基酸但具有许多重要的生理功能和作用,因此 ,在医药、食品、化妆品中均有较为广泛的应用。

主要功能：

1.合成嘌呤、胸腺嘧啶、胆碱的前体；

2. L-丝氨酸羟基经磷酸化作用后能衍生出具重要生理功能的磷丝氨酸，是磷脂的主要成分之一；

3. 具有稳定滴眼液pH值的作用，且滴眼后无刺激性；重要的自然保湿因子(NMF)之一，皮肤角质层保持水分的主要角色，高级化妆品中的关键添加剂。

应用： 1. 医药原料：L-丝氨酸广泛用于配置第三代复方氨基酸输液和营养增补剂，并用于合成多种丝氨基酸衍生物，如心血管、抗癌、爱滋病新药及基因工程用保护氨基酸等；

2.食品：L-丝氨酸用于运动饮料、氨基酸减肥饮料等；

3.饲料：L-丝氨酸用于动物饲料，可促进动物生长发育；

氨基酸分析法是指用于测定蛋白质、肽及其他药物制剂的氨基酸组成或含量的方法。

氨基酸分析,按分离方法分可分为纸色谱法、离子交换色谱法、反相高效液相色谱法、毛细管电泳法、薄层色谱法、气相色谱法等;按检测方法分可分为化

学分析法、电化学方法(包括电导检测、安培检测)、分光光度法(包括可见光分光光度法,紫外光分光光度法和荧光分光光度法)等;按衍生反应的先后,可分为柱前衍生和柱后衍生法。

由于氨基酸是一类化学性质相似的生物活性物质,在分析过程中,检测方法的灵敏度对分析的准确性起非常重要的作用。

二、操作方法

氨基酸的分离鉴定——纸层析法

纸层析法是利用各物质不同的分配系数，使混合物随流动相时而得到分离的方法。纸层析法是以滤纸作为惰性支持物的。滤纸纤维与水亲和力较强，而与有机溶剂亲和力弱，所以纸层析以滤纸纤维和结合水为固定相，以有机溶剂为流动相。当有机相沿滤纸流动经过样品点时，样品点上的溶液在水相和有机相之间进行分配，样品移动速率与样品的极性及水亲和力有关，因此，极性氨基酸移动较慢，而非极性氨基酸移动较快。

溶质在滤纸上的移动速度用Rf值表示：

Rf =原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离= X/Y

在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。 Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。

1、实验器材

1）层析缸（2）毛细管：5只/组。（3）培养皿：1只/组。

4）层析滤纸（长16cm、宽16cm的）：1张/组。（5）直尺、铅笔：自备。

（6）电吹风：1只/组。（7）针、白线：1套/组。（8）小试管：4只/组

（9）移液管等常规仪器（10）喷雾器

2、实验试剂

1. 展层剂和平衡液

正丁醇:冰醋酸:水=4:1:5，充分摇匀，用分液漏斗取上层液作展层剂；下层液作平衡液(弃去)。

2. 样品液

用水配成每ml含有丝氨酸、亮氨酸、脯氨酸各4mg/ml的氨基酸溶液，以及上述四种氨基酸的混合液(各4mg/ml)。

3. 茚三酮

按展层剂0.25%的比例将茚三酮加入展层剂中，使其溶解。

实验操作

（1）检查培养皿是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内120℃烘干。

（2）规划：取宽约16cm、高约16cm的层析滤纸一张。在纸的下端距边缘2cm 处轻轻用铅笔划一条平行于底边的直线A，在直线上做4个记号，记号之间间隔2cm，这就是原点的位置。另在距左边缘1cm处画一条平行于左边缘的直线B，在B线上以A、B两线的交点为原点标明刻度（以厘米为单位）

3）点样：在每个圈下用铅笔记上每种氨基酸的代号(混合样可写M)，然后用毛细管吸取样品，轻轻地点到相应的氨基酸圈内，待晾干或用冷风吹干后再点第二次。前三种氨基酸各点3次，混合液点6次。将点过样的滤纸用针线卷成筒状（点样面向内），注意纸的两边不能接触，留一定缝隙。

注意：点样用的毛细管和试剂瓶上的氨基酸是一一对应的，千万不能混淆，以免污染

（4）层析：将培养皿中放入2/3量的展层剂，迅速放置于层析缸中。把滤纸筒转移到此培养皿内，样品端向下垂直放置，切勿使展层剂浸到样品点。当溶剂前沿到达滤纸2/3处，取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿。

注意：点样端朝下，点样处不能没入层析液中，滤纸不能贴壁

（5）显色：热风吹干滤纸至显出氨基酸斑点，用铅笔描出轮廓。