菌种鉴定标准操作规程
菌种鉴定标准操作规程
目得:建立菌种鉴定标准操作规程
范围:适用于****＊＊鉴定标准操作
职责:
内容:
1整体操作步骤
1、1纯化、分离待鉴定菌
用接种环挑取待鉴定菌落或少许含菌溶液到相应得培养基上(如TＳA),划线分离,以出现微生物单菌落为止。
1。2挑取纯化后得单菌落,进行革兰染色、镜检,以确定待鉴定菌得革兰属性。
1、3如镜检结果为革兰阴性杆菌,则先进行发酵实验。如发酵实验结果为阴性,则选用APＩ2０NE试剂条进行鉴定;如发酵实验结果为阳性,则在经过细胞色素氧化酶实验后选用AＰI20E试剂条进行鉴定。
1。４如镜检结果为革兰阳性球菌,则先进行过氧化氢酶实验。如实验结果为阴性则选用API Ｓtｒｅp试剂条进行鉴定,如实验结果为阳性则选用APＩSｔaph试剂条进行鉴定。
1.5假如镜检结果为革兰阳性杆菌并且有内生芽胞,则选用ＡPI 5０ＣＨB试剂条进行鉴定;否则,根据运动性实验与过氧化氢酶实验结果选用API Ｃｏｒynｅ或其她试剂条进行鉴定、
1、６选定正确得试剂条以后,根据不同得API试剂条得标准操作规程准备接种物,进行接种、培养等操作并将结果形成数码,用APＩ鉴定软件鉴定或查询待检菌得名称均可。鉴定结果应记录,必要时,给出相应解释、
２革兰氏染色
2。１染色剂得配制
2、１.1结晶紫染色液:
甲液:结晶紫1、０g
9５%得酒精2０ｍl
乙液:草酸铵0。8g
水80mｌ
将甲液与乙液混合均匀,静置48h使用,置密闭棕色瓶中储存、
2、1、2碘液:
碘１、0g
碘化钾 2.0g
水300ml
配制时先用3~5ml水将碘化钾溶解,再加入碘,用力摇匀,使之全部溶解后,再加水稀释至300ml,摇匀,分装在棕色瓶中储存。
２、1。3稀石碳酸红溶液:
碱性品红1、0g
石碳酸5、0mｌ
95%乙醇10、０ｍl
配制时用乙醇溶解碱性品红,然后加入石碳酸溶液,使用时加水稀释至100mｌ,摇匀。
2.２操作:
2.2。1涂片:用接种环挑取液体培养物中菌体在载玻片上涂成薄层,固体培养物则先在载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水,用接种环挑取少量菌体在载玻片上涂成薄层。
２。２、2干燥固定:涂片自然干燥或在酒精灯火焰上方微热烘干,并在火焰上通过2～３次,以固定涂片、
２.２、3染色:在已固定得标本上滴加结晶紫溶液数滴,使染色液覆盖整个涂片标本, 染色1分钟。
2。2、４水洗:斜置玻片使很细水流得纯化水从染色标本得上端流下,勿使水流直接冲刷涂片处,直至洗下得水呈无色为止。
2。2。5滴加碘液冲去残水并媒染约1分钟,用纯化水冲去碘液吸干。
2.2、６滴加９5％得乙醇脱色约2０~30秒,脱色时应将玻片微振动,使酒精分布均匀,立即用水冲净、
2、2。7稀石碳酸红溶液染色1分钟后,用水洗净晾干或吸干。
2、2。8镜检:先用低倍镜观察,找到适合得位置,再加一滴香柏油于涂片上,使用1０0倍物镜观察细菌革兰氏属性。革兰氏阳性菌染色成蓝紫色,革兰氏阴性菌染成红色,同时做阳性对照。
3简单染色
3、1用于真菌与细菌得鉴别。
3.2操作:
3、２.1 涂片:用接种环挑取液体培养物中菌体在载玻片上涂成薄层,固体培养物则先在载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水,用接种环挑取少量菌体在载玻片上涂成薄层。
３.２.2干燥固定:涂片自然干燥或在酒精灯火焰上方微热烘干,并在火焰上通过2～3次,以固定涂片。
3、2、３染色:在已固定得标本上滴加结晶紫溶液数滴,使染色液覆盖整个涂片标本,染色１分钟。
3、2、4水洗:斜置玻片使很细水流得自来水从染色标本得上端流下,勿使水流直接冲刷涂片处,直至洗下得水呈无色为止,自然晾干或吸干。
3、2、5镜检:先用低倍镜观察,找到适合得位置,再加一滴香柏油于涂片上,使用100倍物镜观察菌体形态。
4 3%氢氧化钾试验
4、1材料
3％ＫOH溶液(W/V)、无菌木质牙签、待检菌得新鲜纯培养物(18～24小时)。
４、２操作
4。2。1在一洁净得载玻片上等距离滴上3滴3％KＯH水溶液、
4、2。２用铜绿假单胞菌或具有等同反应得菌种作为阳性对照。
４、2、3用枯草芽胞杆菌或具有等同反应得菌株作为阴性对照、
4.２.4用木质牙签从培养基上分别挑取阳性,阴性与待检菌得新鲜纯培养物(18~2４小时)于载玻片上得3滴ＫOH水溶液中。
4、２。5然后用牙签快速环形搅动30～60秒后,轻轻地向外拉该菌悬液,如果就是革兰阴性细菌,在菌悬液与牙签之间有黏丝出现,如果就是革兰阳性细菌则无黏丝出现。
4、２。6结果判断
4、2、６。1如果在15秒钟之内溶液得黏性增强并有黏丝形成,则认为该试验菌株得氢氧化钾呈阳性,试验菌株为G—、
4。2、6.２如果溶液不产生粘丝,则试验菌株被判断为氢氧化钾试验阴性,试验菌株为G＋。
4、2。6、3当阳性与阴性试验结果均为典型反应时,该实验才有效。
5触酶试验(过氧化氢酶试验)
5.1细菌代谢产生得过氧化氢对细菌细胞具有毒副作用,而细胞内得接触酶能催化
过氧化氢,将其分解为分子态氧,使其解毒。向含有接触酶得细菌培养物滴加过氧化氢溶液后即产生大量气泡(阳性)、
5、１材料
３%过氧化氢溶液、无菌木质牙签、洁净载玻片、滴管、
5.２操作
5.2。1用无菌木质牙签挑取新鲜待检菌得纯菌苔置于洁净得载玻片上。
５、2.2向玻片上得菌落滴加3%过氧化氢溶液一滴;或于琼脂培养物上直接滴加3%过氧化氢溶液试液、
5、2。3结果判断:立即观察结果,产生气泡为阳性反应,不产生气泡者为阴性反应、用金黄色葡萄球菌或具等同性质得菌种重复以上步骤作为阳性对照,并用铜绿假单胞菌或具等同性质得菌种作为阴性对照。
5、2。4注意事项
5、２。４。1阴性控制与阳性控制必须为典型反应时,该实验才有效。
5、２。４。2当将过氧化氢溶液加到生长于血琼脂平板上得菌落时会产生假阳性结果(因为红细胞中含有过氧化氢酶)。
５.2.4。3必须将过氧化氢酶溶液滴到菌落上,操作顺序不能颠倒,否则会产生假阳性结果。
５。2、4、４不要用铂金类接种针或接种环去混合培养物与过氧化氢酶水溶液,因为接种针得铂金可以会引起假阳性结果。因此在这个试验中,应用木质无菌牙签或就是塑料类无菌接种环。
6葡萄糖氧化/发酵试验
６。1氧化发酵培养基中含有较低浓度蛋白胨与较高浓度碳水化合物,待检细菌通过氧化或发酵利用葡萄糖产酸,使其pH值下降,培养基中得指示剂由绿色变成黄色、6。１材料
6、１.1无菌矿物油:液体石蜡１21℃半小时高压蒸汽灭菌。
６.1、２氧化发酵培养基:葡萄糖10g,胰蛋白胨２g,氯化钠5g,磷酸氢二钾0、3g,琼脂4g,溴麝香酚蓝０、08g,去离子水1０00ｍl,ｐH6、6—７.0。分装于13×100mｍ小试管中,121℃灭菌15分钟。竖直放置待其凝固后使用。
6.２操作
６、2.1打开小试管。
６、2。2用接种针挑取分离得单个纯菌落,刺入氧化发酵培养基约1cm深,分别接种两个试管。
６.2、３向其中一只试管内加入无菌矿物油,覆盖在培养基表面约１cm高,作为发酵管(ＯＦ/Ｆ);另一支不加矿物油作为氧化管(ＯF/O)。
6、2。4以同样得方法在试管中接种大肠埃希菌或者就是等同菌株作为阳性对照,接种铜绿假单胞菌或者就是类同菌株作阳性对照。
６、3培养:将接种后得发酵培养基放入3５～37℃得培养箱中培养24小时后观察结果,若结果呈阴性,则继续培养24小时。
６。4结果判断
6。４。1培养基变为黄色,反应结果记为阳性。
6、４、2培养基仍保持均匀得绿色,反应结果记为阴性。
6。４.3如果培养基得颜色由绿色变为蓝色,就是由微生物产碱反应所致,记为阴性。
7 细胞色素氧化酶试验
细胞色素氧化酶就是一种铁卟啉类得酶,它将还原得细胞色素C氧化后以非活性得还原态存在。而还原得细胞色素氧化酶因将电子传递给分子氧而又变成活性态。在分子氧得存在下,细胞色素氧化酶与细胞色素C系统能还原一系列有机物。其中,它将指示条反应区得α–萘酚与二甲基对苯二胺还原,会形成吲哚酚蓝分子,通过这一反应将细菌进行分类与鉴别、
7、1材料
细胞色素氧化酶检测指示条,指示条反应区得主要成分:二甲基对苯二胺0。1μｍol、α-奈酚1。０μmｏl、
７、2操作
７.2。1用牙签从培养基上挑取生长良好得单一菌落(菌落得ｐＨ值不得低于6、0,否则会出现假阴性结果)。
７、2、2将菌落均匀涂在反应带上,过20~60秒后,比较反应带得颜色、
7。２。3若反应带变为紫到深紫色则为阳性反应,不变色或黄色为阴性反应。
8 基于系统发育分析得１6SｒDNＡ序列测定与比对
8.1当药品无菌检查阳性或培养基灌装试验阳性时,需对基污染菌及与该污染菌相似得菌种进行分子水平上得菌种鉴定。该类样品则其中送往测序公司进行序列测定。
9 洁净区环境控制－微生物鉴定表
附件:
附录1菌种鉴定标准操作规程流程图相关文件与记录:
无
培训范围:
质量控制部全体人员
参考文献:
无
编制历史与变更原因:
附录1 菌种鉴定标准操作规程流程图
菌种管理规程
1. 目的 规范微生物学检定用菌种的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。 2. 适用范围 适用于微生物实验用菌种管理，包括菌种的申购、传代、使用及销毁等。 3. 引用/参考文件 ChP2015 实用药品微生物检验检测技术指南 4. 职责 质量控制实验室负责菌种的申购、传代、使用、销毁等工作，QA负责监控和参与OOS调查。 5. 程序 5.1术语和定义 5.1.1 标准菌株 由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心或者其他经认可的机构提供的冷冻干燥菌。 5.1.2 传代菌株 用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种，3代后的传代菌株在需要时可以作为工作菌株使用。 5.1.3 工作菌株 用标准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。 5.1.4 菌种的代 将菌种接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0 代。 5.2 菌种来源 5.2.1 标准菌株由中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心（CMCC）或者其他经认可的机构提供的冷冻干燥菌种。 5.2.2质量控制实验室涉及到的菌种种类、代码、保存方法及保存条件如下。
5.3.1菌种的申购 5.3.1.1 微生物室QC依据菌种的库存及菌种的使用情况，提出采购申请，申请需明确菌种的名称，标准编号以及申购数量等信息。 5.3.1.2 质量部经理对申购计划进行审批，审批后由公司的商务部按要求进行采购，采购过程执行《采购控制程序》。 5.3.1.3 菌种的采购需向法定的业务部门或者认可的机构采购。 5.3.1.4 购买菌种的同时应保留相关证明资料，说明菌种的名称、代数、数量等。 5.3.2 菌种的验收 5.3.2.1 微生物室QC负责对采购回的菌种以及相关的证明资料进行验收； 5.3.2.2 验收应包括菌种外包装的完好性、具体验收的依据为批准后的申购计划。 5.3.2.3 验收符合后签字确认并领回菌种，及时填写《菌种验收、入库记录》，并将菌种的相关证明资料贴在菌种接收登记表当页背面留存。如验收不符合则拒绝签字领用，商务部负责退货处理。 5.3.3 菌种的保存 5.3.3.1验收合格的冷冻干燥菌种，应保存在温度设定为-20℃冰箱中保存，有效期可至1年。 5.3.3.2 验收后的菌种需在验收合格接收后14天内完成转种。
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程 1.适用范围 本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。 本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。 2.方法和原理 16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。是一种快速获得细菌种属信息的方法。 细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。 在16S rRNA分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。 16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。 由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，通常将16SrDNA全长序列分成3部分进行测序。 3.设备和材料 3.1器材 移液器（1000μL、200μL 、100μL、10μL）；涡旋振荡器；Eppendorf MixMate；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR仪：Veriti 96 Well Thermal
02微生物实验室菌种管理规程
1、目的：规范微生物试验用菌种的管理，确保菌种的有效使用。 2、适用范围：微生物试验用菌种的管理。 3、责任者：质检科负责人、微生物试验人员、菌种管理人员 4、正文： 概念 a、标准菌株：由国内或国际菌种保藏机构保藏的，遗传学特性得到确认和保证并可追溯的菌株。 b、标准储备菌株：由标准菌株经一次传代得到的培养物。 c、商业派生菌株：由供应商提供的所有特性与标准菌株等效的菌株。 d、工作菌株：由标准储备菌株经传代得到的培养物。
e、代：将活的微生物接种到新鲜培养基中进行培养，并希望获取新的微生物培养物。这种操作方式，新培养物对接种培养物而言就称为一代。 菌种的采购和接收 菌种的采购 从药检所或菌种保藏中心等外单位购入菌种斜面或冻干菌种。 根据工作需要对购买国内保藏中心提供的菌种斜面提前1个月填写采购申请单，冻干菌种提前2个月申请购买，国外保藏中心提供的菌种应提前3个月申请购买。 菌种的接收 检定菌应设专人保管，管理人员应接受过专业培训，有足够的菌种保存经验。 接收菌种时，应核实菌种的名称、编号、传代代数、数量、有效期等，并调查清楚菌种的保存条件和注意事项。 接收时应填写菌种接收登记表。内容包括：菌种名称、菌种保藏中心编号、传代次数、接收日期、菌种来源等。 对新购入的冻干菌种在使用前应按要求对其进行生物形态确证试验和纯度鉴定，由于新购买的菌种斜面已由菌种提供单位做过生物形态确证试验和纯度鉴定，所以传代5代以内的菌种斜面不需要进行纯度鉴定。 对新购入的斜面菌种应在2～8℃保存，并应在1周内转接。 菌种的复苏 使用人员根据需要应向菌种管理人员领取菌种，仔细核对标签上菌名、编号，并在《菌种接收及领用登记表》上记录菌名、数量、领用人、领用日期等信息。 菌株解冻后不得重新冷冻和再次使用。 菌种复苏应在生物安全柜内操作。 常用菌种接种用培养基和培养条件表 菌种的传代 每株菌种应建立菌种使用及传代记录，斜面菌种应根据其特性决定传代时间间隔。
标准菌种管理规程
标准菌种管理规程 目的：规范药品微生物学检定用菌的管理，最大限度降低变异率，确 保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。 职责： QC 主管负责菌种的申购、接受、保存、分发，微生物检验员 负责菌种的确认、传代、使用及销毁。 范围：本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的申购、保存、传 代、使用及销毁等。 内容： 1术语 标准菌种是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理 中心提供的冷冻干燥菌。 传代用菌种是指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存 的菌种，用于传代及制备工作用菌种。 工作用菌种是指用标准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养 后，作为日常工作使用的菌种。 菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即 称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0 代。 2.标准： 2.1 检定菌的申购 QC主管每年根据检定菌种的使用情况（包括临时检验需要），提出购 买计划，交由质量管理部部长审批后，向中检所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌种）；也可以直接向省（市）药检所购
买传代用菌种，购买时，需询问与确定菌种的代数，以便传代时控制 代数。 2.2 检定菌的接收 菌种到达实验室后，由QC主管接收菌种，检查其名称和数量，以及 每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《检定菌接收记录》（附表 1）上，内容包括：名称、数量、编号（无编号者按检定菌种 的编号原则编号）、代数、来源、接收日期、接收人等，贴好标签并 储存于 2-8?C直到需要使用时。储存期最长不超过 5 年。 2.3 检定菌的保存 2.3.1 工作用菌种的保存 工作用菌种采用斜面低温保存法。将菌种接种在适宜的固体斜面培养 基上，待菌生长充分以后，转移至2～8℃冰箱中保存。此法仅用于 工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。保存时间根据菌种种类而不同， 细菌： 1 个月；酵母菌： 2 个月；霉菌及芽胞： 3 个月。 2.3.2 传代用菌种的保存 采用甘油冷冻管保藏法或液体石蜡保存法。 2.3.2.1．甘油冷冻管保存法 用无菌接种环轻轻刮取经冷冻复溶增菌后并接种至平板或琼脂斜面 的菌苔，并通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦而使细菌充分扩散到 预先装入试管中的无菌纯化水中，调整菌液浓度，使其等同于10 号比浊管，向已制备好的菌悬液中加入等体积的无菌甘油（浓度 20%），
标准菌种确认标准操作规程完整
一目的 建立标准菌种确认标准操作规程，以减少菌种污染和生长特性的改变，保证实验结果的可靠性和准确性。 二围 本规程适用于质量控制实验室所用标准储备菌株。 三容 1.1 试验菌株 大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44102] 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26003] 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63501] 白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)64941] 黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003] 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B)10104] 生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC(F)98001] 1.1.1 标准菌株 1.1.1.1 标准菌株应来自认可的国或国外菌种收藏机构。 1.1.1.2 标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储备菌株。 1.1.1.3 标准储备菌株应进行纯度和特性确认。 1.1.2 工作菌株 1.1. 2.1 标准储备菌株可用于制备每两个月或定期转种的工作菌株。 1.1. 2.2 工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过 5 代（从菌种收藏机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度的传代增加表型变化的风险。因此必要时，应对工作菌株的纯度和特性进行确认。 1.2 菌种确认试验的主要容
1.2.1 菌种的纯度确认 1.2.1.1 纯度检测：是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。 1.2.1.2 试验容 ①菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。 ②镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。 1.2.2 菌种的特性确认 1.2.2.1 生化试验：各种微生物具有各自的独特的酶系统，因而在代过程中所参与的物质分解和合成代的产物也不同，这些代产物又具有不同的生化特征。根据此特征，利用生物化学方法来鉴定不同的微生物的试验即为微生物的生化试验。 1.3 菌种的确定方法 用无菌接种环粘取培养物，在相应的培养基平板上划线分离单个菌落，并在适宜条件下培养。培养后观察是否具有典型的菌落形态，然后挑取单一纯菌落，进行革兰氏染色、镜检，观察其染色特性及菌形。再做生化试验或使用菌种鉴定系统进一步鉴定菌种。 1.3.1 大肠埃希菌的确认 1.3.1.1 菌落形态 1.3.1.1.1 取大肠埃希菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中，经35℃培养18～24h后，形成菌膜，管底有粘液状沉淀，培养物有粪臭味。 1.3.1.1.2 取上述培养物接种于曙红亚甲蓝琼脂(EMB)琼脂平板和麦康凯琼脂平板上，35℃培养18～24h后，观察结果。 ①曙红亚甲蓝琼脂(EMB)平板上菌落形态呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色,菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑、湿润，常有金属光泽。 ②麦康凯琼脂平板上菌落形态呈鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。 1.3.1.2 革兰染色、镜检 1.3.1. 2.1 革兰染色
医疗器械微生物实验室装修建设方案
随着医疗器械生产质量管理规范的实施，对无菌和植入类医疗器械的微生物实验室已做出相应要求，其中《医疗器械生产质量管理规范无菌医疗器械实施细则》和《医疗器械生产质量管理规范植入性医疗器械实施细则》中第八章监视和测量规定：生产企业应当建立符合要求并与生产产品相适应的无菌检验室。但实际还包括阳性对照室、微生物限度检查室等，总体称之为微生物实验室更加符合实际。目前医疗器械微生物实验室法规要求起步晚，依据不够细化，加之产品的复杂性，因此微生物实验室的规范化设计并不成熟，SICOLAB对微生物实验室的设计和布局进行初步探讨。 1.微生物实验室功能医疗器械的检验通常分为物理性能、化学性能、生物性能检验。理化检验需要设置理化检验室或在相应工位设检验装置；生物性能检验，对其中的生物学评价检验，企业一般不设检验室，而是委托检测机构进行检测，而微生物检测按法规要求需自行建立微生物检验室。微生物实验室应实现以下功能： (1)按照该产品的标准要求(引用GB/方法或药典方法)，对产品进行无菌检验； (2)对洁净环境(空气、水、工艺用气、台面、手)进行微生物检验； (3)对原材料、半成品、成品的初始污染菌检测； (4)部分含药的医疗器械还需满足药品检验需要(无菌、微生物限度、抗生素效价的微生物检定)，如含药敷料、含有庆大霉素的骨水泥、药物涂层产品等；此外，部分产品标准规定需要进行细菌内毒素检查(如注射器、输液器等一次性使用无菌医疗器械产品，氧合器、血液透析器、冠脉支架系统等部分人工器官和植入物产品)该类检查虽不是微生物检查，但对检查环境有较高的要求的，操作间应设有紫外线灯，并有控制温度、湿度的设备。应有书面操作规程，并有防止污染的措施。 2.微生物实验室设计要求SICOLAB 微生物实验室设计包括以下几个方面：人员，培养基，菌种，设备，实验室的布局和运行，器具及工作服洗涤、存放要求，更衣流程。 人员从事微生物实验工作的人员应具备微生物学或相近专业知识的教育背景。检验人员数量和素质应能满足检验工作的需要。检验人员必须熟悉相关检测方法、程序、检测目的和结果评价。保证人员在上岗前接受胜任工作所必须的设备操作、微生物检验技术和实验室生物安全等方面的培训，经考核合格后方可上岗。 培养基培养基质量稳定可靠，有良好的促菌生长能力，具备适宜的灭菌方式，在规定的条件和环境下贮藏，通过不同菌种的接种试验并观察生长状态，进行灵敏度试验。
标准菌种管理规程
标准菌种管理规程目的：规范药品微生物学检定用菌的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。职责：QC主管负责菌种的申购、接受、保存、分发，微生物检验员负责菌种的确认、传代、使用及销毁。 范围：本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的申购、保存、传代、使用及销毁等。 内容： 1 术语 标准菌种是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。 传代用菌种是指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。 工作用菌种是指用标准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。 菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0 代。 2.标准： 2.1 检定菌的申购 QC主管每年根据检定菌种的使用情况（包括临时检验需要），提出购买计划，交由质量管理部部长审批后，向中检所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌种）；也可以直接向省（市）药检所购
买传代用菌种，购买时，需询问与确定菌种的代数，以便传代时控制代数。 2.2 检定菌的接收 菌种到达实验室后，由QC主管接收菌种，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《检定菌接收记录》（附表1）上，内容包括：名称、数量、编号（无编号者按检定菌种的编号原则编号）、代数、来源、接收日期、接收人等，贴好标签并储存于2-8?C直到需要使用时。储存期最长不超过5年。 2.3 检定菌的保存 2.3.1 工作用菌种的保存 工作用菌种采用斜面低温保存法。将菌种接种在适宜的固体斜面培养 基上，待菌生长充分以后，转移至2~ 8C冰箱中保存。此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。保存时间根据菌种种类而不同，细菌：1个月；酵母菌：2个月；霉菌及芽胞：3个月。 2.3.2 传代用菌种的保存 采用甘油冷冻管保藏法或液体石蜡保存法。 2.3.2.1．甘油冷冻管保存法用无菌接种环轻轻刮取经冷冻复溶增菌后并接种至平板或琼脂斜面的菌苔，并通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦而使细菌充分扩散到预先装入试管中的无菌纯化水中，调整菌液浓度，使其等同于10 号比浊管，向已制备好的菌悬液中加入等体积的无菌甘油（浓度
菌种抗生素的抗性检查标准操作规程
菌种抗生素的抗性检查标准操作规程 依据：《中华人民共和国药典》2005年版第三部。 范围：适用于大肠杆菌表达的重组人基因工程产品。 目的：验证该菌种的抗生素抗性是否与原始菌株相符。 原理：该菌种所携带的重组质粒含有氨苄青霉素抗性基因，在含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基上能够生长。 责任：检定人员。 内容： 1 材料 1．1 材料 1．1．1 菌种：PBV 888/DH 5α ，来源于主种子批或工作种子批。 1．1．2 注射用水：符合《中华人民共和国药典》2005年版的要求。1．1．3 药品 氯化钠 NaCl 分析纯 琼脂粉分析纯 酵母粉 OXOID 蛋白胨 OXOID 氨苄青霉素 C 16H 19 N 3 O 4 S 分析纯 无水乙醇 CH 3CH 2 OH 分析纯 1．1．4 器皿 三角烧瓶（1L）、量筒（500ml、1000ml）、烧杯（500ml）、平皿、盐水瓶（250ml、500ml、1000ml）。 1．1．5 其它材料 线绳、牛皮纸、硫酸纸、剪刀、接种环、煤气灯、脱脂棉。 1．2 设备 恒温培养箱 HG303-5B型湖北省黄石市医疗器械厂 生物安全台Ⅱ级A型安徽蚌埠净化设备厂 扭力天平TN-100B 上海第二天平厂
2 方法 2．1 准备工作 2．1．1 生产环境：在十万级洁净间中进行。场地摘下“清场合格”标志牌，挂上“使用中”标志牌。 2．1．2 器皿的洁净要求 玻璃器皿经本室洗刷组处理后，用二层硫酸纸、一层牛皮纸包好，用线绳系紧，送高压灭菌（121.3℃，60分钟）。脱脂棉用硫酸纸、牛皮纸包好，121.3℃60分钟高压灭菌。 2．1．3．1 确认扭力天平运行状态良好，已挂有“备用”标志牌。 2．1．3．2 确认恒温培养箱运行状态良好，已挂有“运行”标志牌。 2．1．3．3确认生物安全台运行状态良好，已挂有“备用”标志牌。 2．1．4 配液 2．1．4．1 LB琼脂培养基的配制（500ml） 摘下扭力天平“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌。用扭力天平准确称取酵母粉2.5克，蛋白胨5克，NaCl 5克，琼脂粉10克，倒入500ml烧杯中，加入400ml 注射用水，用玻棒搅匀溶解，定容至500ml，混匀，倒入1L三角瓶中，分别用二层硫酸纸和一层牛皮纸包瓶口，用线绳系紧，115.6℃，30分钟高压灭菌。贴上标签，标明液体名称、批号、配制日期，备用。 2．1．4．2 75%酒精1000ml 用量筒量取750ml无水乙醇，加入250ml无菌注射用水，置1000ml盐水瓶中，摇匀，标明液体名称、批号、浓度、日期，室温备用。 2．1．5 LB琼脂平板培养基的制作 摘下生物安全台“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌，用75%酒精棉擦拭台内，接通电源。打开电机，无菌风吹30分钟，待已灭菌LB琼脂培养基500ml冷却到50℃左右，加入25mg氨苄青霉素，轻轻摇匀，倒平板，每皿20-30ml，待培养基冷却后，贴上标签，并注明名称、批号、配制日期，置37℃孵箱中孵育，判定合格后置于4℃冰箱中保存，待用。 2．3 操作步骤 2．3．1 在生物安全台中，将接种环用火焰灭菌并冷却后，用接种环取一环菌
BJ-SOP-WJ013-A1菌种保存、传代、使 用、销毁标准操作规程
菌种管理制度 1、目的建立菌种保存、传代、使用、销毁标准操作规程，规范微生物学检定用菌种的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。 2、适用范围本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的购买、保存、传代、使用及销毁等。 3、定义 标准菌株是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏 管理中心提供的冷冻干燥菌。 传代用菌种是指用标准菌株制备的采用特定保存方法长期固定 保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。 工作用菌种是指用标准菌株或传代用菌种接种至普通琼脂斜面 培养后，作为日常工作使用的菌种。 菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发 一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0 代。 4、职责 4.1部门主管负责菌种的申购、接收、保存分发。 4.2微生物检验员负责菌种的确认、传代、使用及销毁。 5、规程 5.1菌种的申购 部门主管根据菌种的使用情况，提出年度购买计划（包括临时检验需要），填写申购流程，经审批后，向中检所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌株）或传代用菌种，购买时，需确定菌种的代数，以便控制传代代数。 5.2菌种的接收 菌种到达实验室后，由部门主管接收菌种，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《标准菌株库存记录》上，内容包括：名称、数量、编号（无编号者按检定菌种的编号原则编号）、代数、来源、接收日期、接收人等，并将其暂贮存于4～8℃冰箱中，在一周内必须完成转种。
5.3菌种的保存 5.3.1工作用菌种的保存 工作用菌种采用斜面低温保存法。将菌种接种在适宜的琼脂斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移至4～8℃冰箱中保存。此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。保存时间根据菌种种类而不同，细菌：每个月转种一次；酵母菌及芽胞：3~6个月转种一次；丝状真菌每年转种一次。 5.3.2传代用菌种的保存 采用甘油冷冻管保藏法或液体石蜡保存法。 5.3.2.1甘油冷冻管保存法 用无菌接种环轻轻刮取经冷冻复溶增菌后并接种至平板或琼脂斜面的菌苔，并通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦而使细菌充分扩散到预先装入试管中的无菌纯化水中，调整菌液浓度，使其等同于10号比浊管，向已制备好的菌悬液中加入等体积的无菌甘油（浓度20%），即为10%甘油菌悬液，轻轻振摇，使内容物充分混合，分装于无菌小试管，在-30℃冷冻条件下保存。此甘油冷冻管为第2代（G2）。可以每隔2年转种一代。使用时，取出一支放至室温，转种增菌培养或接种至琼脂斜面复苏，挑取纯菌落传代或工作用。此种方法主要适用于需氧细菌和酵母菌的保藏（如大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌）。 5.3.2.2液体石蜡保存法 5.3.2.2.1无菌液体石蜡的制备：选用优质化学纯液体石蜡，将液体石蜡分装加塞，用牛皮纸包好，在121℃灭菌30分钟,置40℃恒温箱中蒸发水分，经无菌检查后备用。 5.3.2.2.2液体石蜡管的制备：将菌种穿刺接种于半固体高层培养基中，在适宜条件下培养结束后，在层流台下用无菌吸管吸取上述无菌液体石蜡至培养好的菌种管内，并使石蜡高出菌种表面约1cm使菌体与空气隔绝，并将试管直立，置于-20℃冷冻或2～8℃冰箱中保存。此法主要适用于霉菌、厌氧菌、放线菌、芽孢杆菌的保存（如枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌等）。 5.3.3各菌种的保存方法、条件及期限，见下表1 表1 传代用菌种保存方法、保存温度、保存期限
标准菌种管理规程
标准菌种管理规程 目的：规药品微生物学检定用菌的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。职责：QC主管负责菌种的申购、接受、保存、分发，微生物检验员负责菌种的确认、传代、使用及销毁。 围：本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的申购、保存、传代、使用及销毁等。 容： 1 术语 标准菌种是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。 传代用菌种是指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。 工作用菌种是指用标准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。 菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。 2.标准： 2.1检定菌的申购 QC主管每年根据检定菌种的使用情况（包括临时检验需要），提出购买计划，交由质量管理部部长审批后，向中检所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌种）；也可以直接向省（市）药
检所购买传代用菌种，购买时，需询问与确定菌种的代数，以便传代时控制代数。 2.2检定菌的接收 菌种到达实验室后，由QC主管接收菌种，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《检定菌接收记录》（附表1）上，容包括：名称、数量、编号（无编号者按检定菌种的编号原则编号）、代数、来源、接收日期、接收人等，贴好标签并储存于2-8?C直到需要使用时。储存期最长不超过5年。 2.3 检定菌的保存 2.3.1 工作用菌种的保存 工作用菌种采用斜面低温保存法。将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移至2～8℃冰箱中保存。此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。保存时间根据菌种种类而不同，细菌：1个月；酵母菌：2个月；霉菌及芽胞：3个月。 2.3.2传代用菌种的保存 采用甘油冷冻管保藏法或液体石蜡保存法。 2.3.2.1．甘油冷冻管保存法 用无菌接种环轻轻刮取经冷冻复溶增菌后并接种至平板或琼脂斜面的菌苔，并通过接种环与试管壁之间的轻轻摩擦而使细菌充分扩散到预先装入试管中的无菌纯化水中，调整菌液浓度，使其等同于10号比浊管，向已制备好的菌悬液中加入等体积的无菌甘油（浓度20%），
菌种生化反应检查标准操作规程
菌种生化反应检查标准操作规程 依据：《中华人民共和国药典》2005年版第三部。 范围：适用于大肠杆菌表达的重组人基因工程产品。 目的：通过生化试验鉴定所用的菌种是否为标准的大肠杆菌。 原理：枸椽酸盐利用试验原理：枸椽酸盐培养基中仅含一种氮源（铵盐）和唯一碳源（枸椽酸钠）一般细菌能利用磷酸二氢铵作为氮源，但不一定能分解枸椽酸盐而取得碳源，因此可否利用该盐，能将不同细菌鉴别。 吲哚试验原理：有些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚，吲哚本身没有颜色，不能直接观察，所以加入二甲基氨基苯甲醛试剂，使之与吲哚作用形成红色的玫瑰吲哚。 甲基红试验原理：大肠杆菌和产气杆菌在糖代谢中都能分解葡萄糖产生丙酮酸。产气杆菌能将两个分子丙酮酸脱羧生成一个分子中性乙酰甲基甲醇，故培养物中形成酸类较少，使酸碱度PH可在5.4以上，因此加入甲基红指示剂后呈桔黄色，是为甲基红试验阴性，而大肠杆菌能进一步分解丙酮酸，产生酸类较多，使培养物的酸碱度在PH4.5或更低，故甲基红指示剂呈红色，是为甲基红试验阳性。 V-P试验原理：测定细菌分解葡萄糖后能否产生乙酰甲基甲醇，产气杆菌可使丙酮酸脱羧变为中性的乙酰甲基甲醇，在碱性条件下被空气中的氧气氧化成二乙酰，后者又与培养基蛋白胨中精氨酸所含胍基起作用，生成红色化合物，称为U-P试验阳性。 内容： 1 材料、设备 1．1 材料： 1．1．1 菌种：PBV 888/DH 5α ，来源于主种子批或工作种子批。 1．1．2注射用水：符合《中华人民共和国药典》2005年版要求。
1．1．3 试剂 蛋白胨 氯化钠 NaCl 分析纯 葡萄糖 C 6H 12 O 6 分析纯 溴麝香草酚兰 C 27H 28 Br 2 O 5 S 分析纯 对二甲基氨基苯甲醛 C 9H 11 NO 分析纯 戊醇 C 5H 15 O 分析纯 浓盐酸 HCl 分析纯 甲基红 C 15H 15 N 3 O 2 分析纯 无水乙醇 CH 3CH 2 OH 分析纯 氢氧化钠 NaOH 分析纯氢氧化钾 KOH 分析纯α-萘酚 C10H7OH 分析纯 硫酸镁 MgSO 4?7H 2 O分析纯 磷酸氢二钾 K 2HPO 4 分析纯 磷酸二氢铵 NH 4H 2 PO 4 分析纯 枸椽酸钠 C 6H 5 Na 3 O 7 ·2H 2 O 分析纯 琼脂粉分析纯 1．2 器皿 盐水瓶、中试管、胶头滴管、烧杯、量筒（100ml、500ml、1000ml）、吸管（10ml）、试剂瓶（250ml、500ml）。 1．3 仪器、设备 PH计 PHC-3C型上海大中分析仪器厂 电子秤 ES-200A型沈阳腾龙电子仪器公司 电子天平 ACS 太原 恒温培养箱 HG303-5B型湖北省黄石市医疗器械厂 水浴箱 6 Liter LKB 生物安全台Ⅱ级A型安徽蚌埠净化设备厂 1．4 其它材料 硫酸纸、牛皮纸、片带、橡皮膏、吸球（1ml及10ml）玻棒、接种环、透气栓。
实验室管理规程
1.目的 规范实验室工作管理，确保检测的科学合理进行，保证检测结果的准确可靠。 2.范围 适用于实验室的管理。 3.职责 3.1.质保部负责本规程的执行。 3.2.其他部门协作质保部执行本规程。 4.规程 4.1.人员 4.1.1.微生物实验室应设置质量负责人、技术管理者、检验人员、生物安全负责人、生物安全责任人、生物安全监督员、菌种管理员及相关设备和材料管理员岗，可以设置一人多岗设置。 4.1.2.从事药品微生物试验工作的人员应具备微生物学或相近专业知识的教育背景。 4.1.3.检验人员必须熟悉相关检测方法、程序、检测目的和结果评价。微生物实验室的管理者其专业技能和经验水平应与他们的职责范围相符，如：管理技能、实验室安全、试验安排、预算、实验研究、实验结果的评估和数据偏差的调查、技术报告书写等。 4.1.4.实验人员应依据所在岗位和职责接受相应的培训，在确认他们可以承担某一试验前，他们不能独立从事该项微生物试验。应保证所有人员在上岗前接受胜任工作所必需的设备操作、微生物检验技术等方面的培训，如无菌操作、培养基制备、消毒、灭菌、注平板、菌落计数、菌种的转种、传代和保藏、微生物检查方法和鉴定基本技术等，经考核合格后方可上岗。 4.1. 5.实验人员应经过实验室生物安全方面的培训，熟悉生物安全操作知识和消毒灭菌知识，保证自身安全，防止微生物在实验室内部污染。 4.1.6.实验室应制定所有级别实验人员的继续教育计划，保证知识与技能不断地更新。 4.1.7.实验室应确定人员具备承担实验室活动的能力，以及评估偏离影响程度的能力。可通过参加内部质量控制、能力验证或实验室间比对等方式客观评估检验人员的能力，并授权从事相应的实验室活动，必要时对其进行再培训并重新评估。当使用一种非经常使用的方法或
标准菌种管理规程(新修订)
标准菌种管理规程 生效日期：年月日第1页共17页 目的：规范药品微生物学检定用菌的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。 职责：QC主管负责菌种的申购、接受、保存、分发，微生物检验员负责菌种的确认、传代、使用及销毁。 范围：本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的申购、保存、传代、使用及销毁等。 内容： 1 术语 标准菌种是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。 传代用菌种是指用标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。 工作用菌种是指用标准菌种或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。
菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。 2.标准： 2.1检定菌的申购 QC主管每年根据检定菌种的使用情况（包括临时检验需要），提出购买计划，交由质量管理部部长审批后，向中检所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌种）；也可以直接向省（市）药检所购买传代用菌种，购买时，需询问与确定菌种的代数，以便传代时控制代数。 2.2检定菌的接收 菌种到达实验室后，由QC主管接收菌种，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《检定菌接收记录》（附表1）上，内容包括：名称、数量、编号（无编号者按检定菌种的编号原则编号）、代数、来源、接收日期、接收人等，贴好标签并储存于2-8?C直到需要使用时。储存期最长不超过5年。 2.3 检定菌的保存 2.3.1 工作用菌种的保存 工作用菌种采用斜面低温保存法。将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移至2～8℃冰箱中保存。此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。保存时间根据菌种种类而不同，细菌：1个月；酵母菌：2个月；霉菌及芽胞：3个月。 2.3.2传代用菌种的保存
菌种的确认标准操作规程
1．目的 建立菌种确认标准操作规程，以减少菌种污染和生长特性的改变，保证实验结果的可靠性和准确性。 2．依据 《中国药典》2010版二部 3．范围 本规程适用于质量控制实验室所用标准储备菌株。 4．责任 质量管理部，质量控制实验室 5．内容 5.1试验菌株 大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44 102] 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26 003] 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63 501] 白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)98 001] 黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003] 5.1.1标准菌株 5.1.1.1标准菌株应来自认可的国内或国外菌种收藏机构。 5.1.1.2标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储备菌株。 5.1.1.3标准储备菌株应进行纯度和特性确认。 5.1.2工作菌株 5.1.2.1标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作菌株 5.1.2.2工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过5 代（从菌种收藏机构获得的标准菌
株为第0代），以防止过度的传代增加表型变化的风险。因此必要时，应对工作菌株的纯度和特性进行确认。 5.2菌种确认试验的主要内容 5.2.1菌种的纯度确认 5.2.1.1纯度检测：是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。 5.2.1.2试验内容 ①菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。 ②镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。 5.2.2菌种的特性确认 5.2.2.1生化试验：各种微生物具有各自的独特的酶系统，因而在代谢过程中所参与的物质分解和合成代谢的产物也不同，这些代谢产物又具有不同的生化特征。根据此特征，利用生物化学方法来鉴定不同的微生物的试验即为微生物的生化试验。 5.3 菌种的确定方法 用无菌接种环粘取培养物，在相应的培养基平板上划线分离单个菌落，并在适宜条件下培养。培养后观察是否具有典型的菌落形态，然后挑取单一纯菌落，进行革兰氏染色、镜检，观察其染色特性及菌形。再做生化试验或使用菌种鉴定系统进一步鉴定菌种。 5.3.1大肠埃希菌的确认 5.3.1.1菌落形态 5.3.1.1.1取大肠埃希菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中，经35℃培养18～24h后，形成菌膜，管底有粘液状沉淀，培养物有粪臭味。 5.3.1.1.2取上述培养物接种于曙红亚甲蓝琼脂(EMB)琼脂平板和麦康凯琼脂平板上，35℃培养18～24h后，观察结果。 ①曙红亚甲蓝琼脂(EMB)琼脂平板上菌落形态呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色,菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑、湿润，常有金属光泽。 ②麦康凯琼脂平板上菌落形态呈鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。
微生物菌种、毒株管理规定与流程 Word 文档
微生物菌种、毒株管理规定与流程 1．目的：对本实验室菌种、毒种的申购、保存、保管、领用、处理等各个环节实行有效的监督控制，防止意外事故发生，确保疾病预防与控制检验业务及科研教学工作。2．适用范围及菌种、毒种专职管理人员 适用于本科微生物实验室菌种、毒株的管理； 菌种、毒种专职管理人员： 3．职责 ①微生物实验室负责菌、毒种的出入库保管、保存及处理等日常管理。 ②科室指定2名菌种、毒种库管理人员承担菌、毒种日常管理。 ③科室负责人负责一、二类菌、毒种的出入库和向上级索取及对下级发送的审核。 ④技术管理层批准本实验室一、二类菌、毒种的出入库和向上级索取及对下级发送的审批。 4．工作程序 ⑴报送及入库 ①当微生物实验室检出菌、毒株应及时报送市疾病预防控制中心。 ②新发现的菌、毒种，要做好原始记录，逐级报送进行复核确认，报送时须王红卫、2人参加。 ③一、二类菌、毒种入库前，科室审核，技术管理层批准后入库 ④个人不得擅自保留菌、毒种，必须由科室进行统一编号、登记入库管理 ⑤菌、毒种入库时， 2名菌、毒种保管人员须认真做好菌毒种的编号、登记工作。 ⑵日常管理 ①保管人员由王红卫、赵灵葵2名检验人员组成。 ②菌、毒种入库时，保管人员应及时验收，统一编号，填写《菌、毒种登记表》
③严禁随意将菌、毒种置于非菌、毒种专用保存场所，应做到三专（专室、专柜、专锁）。 ④菌、毒种库由2名保管人员双锁管理，铁门与锁必须牢固有效，发现损坏须及时报修。未经各科室负责人同意，不得擅自将钥匙委托他人代管。 ⑤菌、毒种保管人员应定期对库内温度、湿度、通风及冰箱、冰柜等菌、毒种保藏设备运转情况进行检查，并做好记录。 ⑥菌、毒种保管人员根据菌、毒种的保存期限，及时通知分管病种的检验人员进行传代，定期鉴定，并详细记录在《菌、毒种登记表》 ⑦菌、毒种保管人员发现菌、毒种发生变异和死亡，应及时向科室负责人报告，并填写《菌、毒种登记表》。科室须将变异及死亡的一、二类菌、毒种通报技术管理层。 ⑶索取、领用和发放 ①因工作需要索取、领用和发放一、二类菌、毒种时，须严格按国家有关的规定，填写《菌、毒种领取申请表》（HJK／JL-21），科室负责人审核，技术管理层批准后方可索取、领用和发放。 ②三类菌、毒种的领用和发放时，应由2人参加。 ③一类菌、毒种，须报卫生部批准，二类菌、毒种须经省级卫生行政部门审批。未经上级批准，不得进行国际间各类菌、毒种交流。 ④进行菌、毒种索取、领用和分发时，须做好记录，填写《菌、毒种使用及销毁记录》（HJK／JL-22）。 ⑤一、二类菌、毒种不得邮寄，三类菌、毒种在邮寄时，应执行有关规定。 ⑷销毁 ①菌、毒种使用过程中须接受保管人员的监督，工作结束后，立即做好善 后处理，销毁时应有2人或以上人员参加，并做好销毁记录。因工作需要暂时保留的菌、毒株也应该按规定的时间销毁。
菌种划种LB琼脂平板检查标准操作规程
菌种划种LB琼脂平板检查标准操作规程
菌种划种LB琼脂平板检查标准操作规程 依据：《中华人民共和国药典》2005年版第三部。 范围：适用于大肠杆菌表达的重组人基因工程产品。 目的：检查该菌种的菌落形态是否与标准大肠杆菌菌落形态一致，并检查是否染有杂菌。原理：将该菌种在LB琼脂平板上划线分离培养，以检查菌落形态以及是否染有杂菌。 内容： 1 材料 1．1 材料 1．1．1 菌种：PBV 888/DH 5α ，来源于主种子批或工作种子批。 1．1．2 注射用水：符合《中华人民共和国药典》2005年版的要求。1．1．3 药品 氯化钠 NaCl 分析纯 琼脂粉分析纯 酵母粉 蛋白胨 无水乙醇 CH 3CH 2 OH 分析纯 1．1．4 器皿 平皿、三角烧瓶（3L）、量筒（1L）、玻棒、试剂瓶。1．1．5 其它材料 线绳、牛皮纸、硫酸纸、剪刀、接种环、煤气灯。 1．2 仪器设备 生物安全台Ⅱ级A型安徽蚌埠净化设备厂 恒温培养箱 HG303-5B型湖北省黄石市医疗器械厂扭力天平 TN-100B型上海第二天平厂 2 方法
2．1 准备工作 2．1．1 生产环境：在十万级洁净间进行。场地摘下“清场合格”标志牌，挂“使用中”标志牌。 2．1．2 器皿的洁净要求 玻璃器皿经洗刷组处理完毕后，用硫酸纸及牛皮纸包好，用线绳系紧，送高压灭菌（121.3℃60分钟）。脱脂棉用硫酸纸、牛皮纸包好，高压灭菌121.3℃60分钟。 2．1．3 调试仪器设备 2．1．3．1确认扭力天平运行状态良好，已挂有“备用”标志牌。 2．1．3．2确认恒温培养箱运行状态良好已挂有“运行”标志牌。 2．1．3．3确认生物安全台运行状态良好已挂有“备用”标志牌。 2．2 溶液的配制 2．2．1 LB琼脂培养基的配制1000ml 摘下扭力天平“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌。用扭力天平称取酵母粉5克，蛋白胨10克，NaCl 10克，琼脂粉20克，倒入三角烧瓶中，加注射用水1000ml，用玻棒搅匀，分别用硫酸纸、牛皮纸包口，用线绳扎紧，标明名称、配制时间， 115.6℃30分高压灭菌。 2．2．2 75%酒精溶液1000ml 取750ml无水乙醇，加注射用水定容1000ml，混匀，装入试剂瓶中，贴标签，标明液体名称、浓度、配制日期，室温备用。 2．3操作步骤 2．3．1 摘下生物安全台“备用”标志牌，挂上“运行”标志牌。用75%酒精棉擦拭台内，接通电源，打开风机，无菌风吹30分钟，待已灭菌LB琼脂培养基冷却至50℃左右，倒平板，每皿20-30ml，待凝固后，放入恒温培养箱中，37℃倒置培养24小时，如无杂菌生长，即可继续实验用。 2．3．2 划线分离：用接种环（经火焰灭菌，冷却后）取1环菌种于LB平板上划线分离。 2．3．3 将划线分离的平板置于37℃恒温培养箱中培养24小时。 2．3．4操作结束后，场地摘下“使用中”标志牌，挂上“待处理”标志牌。 3 结果判定 3.1判定标准：菌落形态如为圆形，湿润、光滑，中等大小（直径约2-3mm），即为典型大肠杆菌菌落。
标准菌种确认标准操作规程范文
标准菌种确认标准操作规程 一目的 建立标准菌种确认标准操作规程，以减少菌种污染和生长特性的改变，保证实验结果的可靠性和准确性。 二范围 本规程适用于质量控制实验室所用标准储备菌株。 三内容 1.1 试验菌株 大肠埃希菌(Escherichia coli )[CMCC(B)44102] 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )[CMCC(B)26003] 枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis )[CMCC(B)63501] 白色念珠菌(Candida albicans ) [CMCC(F)64941] 黑曲霉(Aspergillus niger ) [CMCC(F)98003] 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa ) [CMCC(B)10104] 生抱梭菌 (Clostridium sporogenes ) [CMCC(F)98001] 1.1.1 标准菌株 1.1.1.1 标准菌株应来自认可的国内或国外菌种收藏机构。
1.1.1.2 标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储备菌 1.1.1.3 标准储备菌株应进行纯度和特性确认。 1.1.2 工作菌株 1.121 标准储备菌株可用于制备每两个月或定期转种的工作菌株。 1.122 工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过5代（从菌种收藏 机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度的传代增加表型变化的风险。因此必要时，应对工作菌株的纯度和特性进行确认。 1.2 菌种确认试验的主要内容 1.2.1 菌种的纯度确认 1.2.1.1 纯度检测：是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。 1.2.1.2 试验内容 ①菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适 宜培养后，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布 培养，检测是否重复出现相同特征。 ②镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽抱等特征应相似。 1.2.2 菌种的特性确认 1.2.2.1 生化试验：各种微生物具有各自的独特的酶系统，因而在代谢过 程中所参与的物质分解和合成代谢的产物也不同，这些代谢产物又具有不同的生化特征。根据此特征，利用生物化学方法来鉴定不同的微生物的试验即为微生物的