CISH原位杂交步骤
实验流程：
一．细胞爬片或者冰冻切片
1.冰冻切片厚度5-8um，用防脱载玻片；细胞爬片的盖玻片要用多聚赖氨酸
处理。防止脱片。
2.固定：用RNA Free4%多聚甲醛室温固定20-30min，用DEPC水充分水
洗，自然晾干后，-20℃冷冻可保存2周以上。
3.制作湿盒：取出保湿盒，用酒精正反面喷洒消毒，晾干，垫上双层纸
巾，用5×SSC（35ml）+甲酰胺（35ml）湿润。
4.30%H
2O
2
1份+9份纯甲醇混合液室温处理10min。DEPC水洗3次，每次
1min;
5.切片置于湿盒内，用0.2mol/L盐酸滴于组织上，常温放置15min，用
DEPC水洗2次，每次1min（盐酸可中和带电荷的碱性蛋白，降低背景）
6.蛋白酶K覆盖组织，分子杂交仪中37℃20min。蛋白酶K可以消化和暴
露被遮蔽的靶核酸，增加探针的结合效率。
7.用0.2%或0.1mol/L甘氨酸洗液洗1min（现用现配），终止蛋白酶K。
8.PBS洗两次，每次一分钟。
9.用4%PFA多聚甲醛固定组织10min。
10.PBS洗三次，每次1min。
11.用acetic anhydride乙酸酐ph=8.0（乙酰化作用，降低背景）室温洗
5min，2次。
12.用PBS洗5次，每次1min。
13.用5×SSCph=7.5洗两次，每次1min。
14.切片放置湿盒内，用预杂交液覆盖组织，65℃预杂交1h。
15.500ng/ml digoxigenin-labeled pube探针覆盖切片，在杂交仪内62-70
℃避光反应24~72h，反应温度与反应时间视不同的组织与探针而定，建议一般65℃48h。
16.用2×SSC ph=7.5，室温洗1次，1min。
17.用甲酰胺加4×SSC ph=4.5 1:1混合液在60℃或65℃洗三次，每次
20min。
18.用PBS洗5次，每次1min，室温。
19.将切片置于湿盒内，用封闭液覆盖切片，室温反应至少30min。
20.滴加生物素化鼠抗地高辛抗体，37℃60min反应，PBS洗3遍，每遍5min.
21.滴加SABC，37℃20min反应，PBS洗3遍，每遍5min
22.滴加生物素化过氧化物酶，37℃20min反应，PBS洗3遍，每遍5min
23.DAB显色，充分水洗，必要时苏木素染核，酒精脱水，二甲苯透
明。封片。
注意事项：
1.取新鲜标本做冰冻切片前一定要用DEPC水配制的10%蔗糖溶液在4℃冰箱中
浸泡过夜，再换用DEPC水配制的30%蔗糖溶液在4℃冰箱中浸泡过夜.然后-80℃冰箱保存或者直接冰冻切片。
2.由于特定的mRNA序列仅占总序列的极少数，因此原位杂交容易出现非特异
性染色，一般通过用不加探针或阴性标本作阴性对照，基本可以确定是否是非特异性染色。如果有明显的非特异性染色现象，可以用预杂交液稀释探针（一般稀释10倍就行），并应加强探针杂交后的洗涤。如果染色部位有出入，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。
DNA实验技术：原位杂交实验要求及步骤
原位杂交组织（或细胞）化学（In situ Hybridization Histochemistry，ISHH）简称原位杂交（In Situ Hybridization），属于固相分子杂交的范畴，它是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA 杂交三类。 根据探针的标记物是否直接被检测，原位杂交又可分为直接法和间接法两类。直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交，杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。间接法一般用半抗原标记探针，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。 原位杂交最初是以同位素标记探针进行的。尽管同位素标记（如35S，3H，32P等）仍然广泛使用，但非同位素标记探针的迅速发展（尤其是生物素标记探针和地高辛标记探针），更引起科技工作者的极大兴趣。 一、基本要求 1. 组织取材：组织取材应尽可能新鲜。由于组织RNA降解较快，所以新鲜组织和培养细胞最好在30 min 内固定。 2. 固定目的是： （1）保持细胞结构； （2）最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平； （3）使探针易于进入细胞或组织。 最常用的固定剂是多聚甲醛，与其它醛类固定剂（如戊二醛）不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。 3. 增强组织的通透性和核酸探针的穿透性： （1）稀酸处理和酸酐处理：为防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合，以降低背景，杂交前标本可用0.25%乙酸酐处理10 min，经乙酸酐处理后，组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。组织和细胞标本亦可用0.2 M HCl处理10 min，稀酸能使碱性蛋白变性，结合蛋白酶消化，容易将碱性蛋白移除。 （2）去污剂处理：去污剂处理的目的是增加组织的通透性，利于杂交探针进入组织细胞，最常应用的去污剂是Triton X-100。注意：过度的去污剂处理不仅影响组织的形态结构，而且还会引起靶核酸的丢失。
免疫荧光操作步骤及注意事项
免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。 由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤：
原位杂交原理及具体操作
原位杂交原理及具体操作
原位杂交实验原理与方法 一、目的 本实验的目的是学会原位杂交的使用方法。了解各种原位杂交的基本原理和优缺点。 二、原理 原位杂交组化（简称原位杂交，in situ hybridization histochemistry；ISHH）属于分子杂交的一种，是一种应用标记探针与组织细胞中的待测核酸杂交，再应用标记物相关的检测系统，在核酸原有的位置将其显示出来的一种检测技术。原位杂交的本质就是在一定的温度和离子浓度下，使具有特异序列的单链探针通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性结合而使得组织细胞中的特异性核酸得到定位，并通过探针上所标记的检测系统将其在核酸的原有位置上显示出来。 当然杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链。 探针的种类按所带标记物可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。目前，大多数放
射性标记法是通过酶促反应将标记的基因掺入DNA中，常用的同位素标记物有3H、35S、125I 和32P。同位素标记物虽然有灵敏性高，背底较为清晰等优点，但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来有被非同位素取代的趋势。非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。 探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。cDNA 探针又可分为双链cDNA探针和单链cDNA探针。原位杂交又可分为菌落原位杂交和组织原位杂交。 菌落原位杂交（Colony in situ hybridization）菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸 纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。将NDA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。 组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）组织原位杂交简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交，它与菌落的原位杂交不同。菌落原位杂交需裂解细菌释出DNA，然后进行杂交。而原位
原位杂交组织化学技术的基本方法
原位杂交组织化学技术的基本方法 一、核酸分子杂交技术 1961年Hall开拓了液相核酸杂交技术的研究，其基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基顺序，通过碱基对之间非共价键的形成，出现稳定的双链区，形成杂交的双链。自此以后，由于分子生物学技术的迅猛发展，特别是70年代末到80年代初，分子克隆">克隆、质粒和噬菌体DNA的构建成功，核酸自动合成仪的诞生，大大丰富了核酸探针的来源，新的核酸分子杂交类型和方法不断涌现。按其作用方式可大致分为固相杂交和液相杂交两种：液相杂交是指参加反应的两条核酸链都游离在溶液中，而固相杂交是将参加反应的一条核酸链固定在固体的支持物上常用的有硝酸纤维素滤膜，其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微孔板等），另一条参加反应的核酸链游离在溶液中。固相杂交有菌落原位杂交（colony in situ hybri dization）、斑点杂交法（Dot blot）、Southern印迹杂交（Southern blot）、Northern印迹杂交（ N orthern blot）和组织原位杂交（Tissue in situ hybridization），即原位杂交组织化学技术和原位杂交免疫细胞化学技术。液相分子杂交技术包括吸附杂交、发光液相杂交、液相夹心杂交和复性速率液相分子杂交等。 二、原位杂交组织化学技术的由来及发展 原位杂交组织（或细胞）化学技术简称原位杂交（In situ hybridization），如上所述，属于固相核酸分子杂交的范畴。但它区别于固相核酸分子杂交中的任何一种核酸分子杂交技术。菌落杂交系细菌裂解释放出DNA，然后进行杂交。Southern印迹杂交法是以鉴定DNA中某一特定的基因片段，而Norhtern印迹杂交法是用以检测某一特定的RNA片段的。它们都只能证明该病原体、细胞或组织中是否存在待测的核酸而不能证明该核酸分子在细胞或组织中存在的部位。1969年美国耶鲁大学Gall和Pardue首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。与此同时，Buongiorno– Nardell i和Amaldi, John及其同事等相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位，从而创造了原位杂交细胞或组织化学技术。Orth（1970）应用3H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交，首次用原位杂交检测了病毒DNA在细胞中的定位，但当时的工作多采用冰冻组织切片或培养细胞，探针均采用同位素标记。 由于同位素标记探针具有放射性既污染环境，又对人体有害，且受半衰期限制等缺点，科学工作者们开始探索用非放射性的标记物标记核酸探针进行原位杂交。Bauman（1981）等首先应用荧光素标记cRNA探针做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成功。Shroyer（1982）报道用2，4二硝基苯甲醛（DNP）标记DNA探针，使该DNA探针具有抗原性，然后用兔抗DNP的抗体来识别杂交后的探针，最后经免疫过氧化物酶的方法来定位杂交探针。这两种方法至今仍有采用，但因敏感度不够高，应用不够普遍。 Pezzella（1 987）创建了用磺基化DNA探针来做细胞或组织原位杂交的方法，其基本原理是使DNA探针的胞嘧啶碱基磺基化，利用单克隆">克隆抗体识别磺基化探针，再通过免疫组化方法显示结合的单克隆抗体，从而对杂交结合的探针进行定位。本法的优点是磺基化DAN探针标记简便，不需作缺口平移标记，敏感度也较高。但自生物素和高辛标记探针技术建立后，已有取而代之的趋势。生物素标记探针技术是Brigat（1983）首先建立的，它利用生物素标记的探针在组织切片上检测了病毒DNA，通过生物素与抗生物素结合，过氧化物酶-抗过氧化物酶显示系统显示病毒DNA在细胞中的定位。生物素标记探针技术目前已被广泛应用，特别是在病毒学和病理学的临床诊断中。这种生物素标记技术又叫酶促生物素标记技术。另一种叫光促生物素标记核酸技术，该技术是用光敏生物素（Photobiotin）标记核酸。目前应用的光敏生物素有乙酸盐和补骨脂素生物素，它们都是由三个部分组成：光敏基团、连结臂和生物素（图20-1）。在强光下，不需酶反应，光敏生物素的光敏基团即可与核酸中的碱基相结合。光敏生物素标记核酸，方法简单，灵敏度也不低，但标记效率不高，每100～150个碱基才能标记一个生物素，对于短的基因探针特别是寡核苷酸探针不宜使用，以免因标记数过少而影响灵敏度（Forster et al 1985）。 近年来，地高辛（Digoxigonin）标记技术引起科技工作者的极大兴趣。Boeringer Mannhem Bio－ch emisca于1987年将地高辛标记的有关试剂及药盒投放市场。和其它非放射性标记物一样，地高辛较放射性标记系统安全，方便、省时间。同时在敏感性和质量控制方面比生物素标记技术要优越，可以检测出人基因组DNA中的单拷贝基因。地高辛标记法显示的颜色为紫蓝色（标记碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色系统），有较好的反差背景。 核酸探针根据标记方法的不同可粗略分为放射性探针和非放射性探针两类。根据探针的核酸性质不同可分为DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针和寡核苷酸探针等。DNA探针还有单链DNA（Single st randed, ssDNA）和双链DNA（Double stranded, dsDNA）之分（详见十九章）。早期应用的主要是DNA探
免疫荧光操作步骤及注意事项
免疫荧光操作步骤及注意事项 免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术(比如流式细胞仪)测定含量。 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透(或称为透化)、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备(通俗的说法是细胞爬片)是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片(Slides or Coverslips)的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法(如ELISA或Western Blot)中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4?或-20?避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。
由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤: (1) 细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次;对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤(1000rpm,5min)2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 (2) 固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4?保存3个月。PBS洗涤3×5 min. (3) 通透。使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min. (4) 封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min. (5) 一抗结合。室温孵育1h或者4?过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min. (6) 二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。 (7) 封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。 (一)细胞准备 用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。贴壁良好
原位杂交介绍与步骤
原位杂交 组织（或细胞）化学（In situ Hybridization Histochemistry，ISHH）简称原位杂交（In Situ Hybridization），属于固相分子杂交的范畴，它是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA 杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类。 根据探针的标记物是否直接被检测，原位杂交又可分为直接法和间接法两类。直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交，杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。间接法一般用半抗原标记探针，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。 原位杂交最初是以同位素标记探针进行的。尽管同位素标记（如35S，3H，32P等）仍然广泛使用，但非同位素标记探针的迅速发展（尤其是生物素标记探针和地高辛标记探针），更引起科技工作者的极大兴趣。 一、基本要求 1. 组织取材：组织取材应尽可能新鲜。由于组织RNA降解较快，所以新鲜组织和培养细胞最好在30 min 内固定。 2. 固定目的是： （1）保持细胞结构； （2）最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平； （3）使探针易于进入细胞或组织。 最常用的固定剂是多聚甲醛，与其它醛类固定剂（如戊二醛）不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。 3. 增强组织的通透性和核酸探针的穿透性： （1）稀酸处理和酸酐处理：为防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合，以降低背景，杂交前标本可用0.25%乙酸酐处理10 min，经乙酸酐处理后，组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。组织和细胞标本亦可用0.2 M HCl处理10 min，稀酸能使碱性蛋白变性，结合蛋白酶消化，容易将碱性蛋白移除。 （2）去污剂处理：去污剂处理的目的是增加组织的通透性，利于杂交探针进入组织细胞，最常应用的去污剂是Triton X-100。注意：过度的去污剂处理不仅影响组织的形态结构，而且还会引起靶核酸的丢失。 （3）蛋白酶处理：蛋白酶消化能使经固定后被遮蔽的靶核酸暴露，以增加探针对靶核酸的可及性。常用的蛋白酶有蛋白酶K（proteinase K），还有链霉蛋白酶（pronase）和胃蛋白酶（pepsin）等。 4. 杂交缓冲液孵育： 杂交前用不含探针的杂交缓冲液在杂交温度下孵育2 hr，以阻断玻片和标本中可能与探针产生非特异性结合的位点，达到减低背景的目的。 5. 防止污染： 由于在手指皮肤及实验室用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，为防止其污染影响实验结果，在整个杂交前处理过程中都需要戴消毒手套，实验所用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温烘烤（180℃）以达到消除RNA酶的目的。杂交前及杂交时所用的溶液均需经高压消毒处理。 6. 双链DNA探针和靶DNA的变性：
原位杂交实验操作步骤
原位杂交实验操作步骤 一质粒制备 1质粒的转化和扩增 1.1制备XL1-Blue感受态细菌 1.取400uLXL1-Blue菌种加入到含200mlLB培养基的锥形瓶中，37℃、100rpm 培养4h，离心，倒置，以冰冷的0.1mol/LCaCl_2重悬细菌，冰浴30min，离心，弃上清，倒置，再加4ml(含15%甘油)冰冷的CaCl2重悬细菌，分装(200μ/tube)，-80℃保存。 2.转化：在冰浴中将1管XL1-Blue感受态菌解冻，将浓度为2ng/μ1的质粒DNA4μ1加入到8Oμ1感受态菌中。 3.轻轻摇匀，冰浴30min。 4.42℃热激9O秒，然后迅速冰浴2min。 5.加入LB培养液(无氨苄青霉素)0.8ml，在37℃，100转/min水浴孵育60min。 6.取200μl菌液铺于琼脂板上(涂有X-Gal(20mg/ml)-IPTG(200mg/ml)的LB-氨苄青霉素50mg/ml,1μl/ml培养基)，待菌液全部被吸收后，倒置平板于37℃培养12-16h。 1.2鉴定和挑选含重组质粒的菌落 1.用无菌牙签挑取单菌落，接种到10ml含氨苄青霉素的LB培养液的离心管中，于37℃，200转/分培养2h，取1ml之一Eppendorf离心管，加 50μl10mmol/L EDTA(pH8.0)。 2.加入50μl新配置的0.2mol/LNaOH、0.5%SDS、20%蔗糖溶液后，振荡30秒。 3.在70℃温育5min，然后冷却到室温。 4.加1.5μ14mol/LKCl和0.5μ1含0.4%溴酚兰染液，振荡3O秒后，冰浴5min。 5.12000g，4℃离以3min，以除去细菌碎片。 6.制备1%的琼脂糖凝胶(含EB0.5μg/ml)，取50μl上清液加入到样品孔中，其中一孔加入中等分子量DNAMarker。恒压50V，进行电泳。 7.当溴酚兰迁移到凝胶全长的2/3-3/4时，停止电泳，在紫外灯下检查质粒DNA 分于量的大小是否与转入质粒相符。
原位杂交技术步骤
1.For each probe (control and experimental), set up a separate 100-ml PCR in a 0.5-ml sterile tube, as tabulated below. Either.cDNA inserted in plasmids or genomic DNA can be used as templates for the PCR (see REAGENT SETUP for details on primer design). 每个探针(实验组和对照组),在0.5 -ml无菌管设立一个独立的100毫升PCR,正如下面的表。另外。互补脱氧核糖核酸插入到基因组DNA质体或可用作模板PCR(见试剂设置有关底漆设计)。 **注意关键： 1.很多版本的实验反义核酸探针可以作为一种控制背景染色(见试剂设置)。然而,我们相信最好的方法来演示特异性是获取相同的空间限制表达模式使用不同的非重叠探测器相同的基因。 2.小心不要污染pcr.使用无菌试管和过滤器的技巧和戴手套 3.另外,PCR扩增,cDNAs质粒中可以使用约束线性化酶,独特的站点位于5￠(反义核酸探针)或3￠(对感官探测)来插入。净化的线性DNA可以通过苯酚/氯仿萃取乙醇沉淀紧随其后。 2| Run the PCR using the conditions tabulated below. 使用下面列出的条件运行PCR **暂停点：把扩增好的pcr产品放4℃降温和在-20℃贮藏几个星期。 3| Add the 100-ml PCR to a Microcon YM-50 column and add 400 ml of sterile water. Centrifuge for 15–20 min at 1,000 g at room temperature. 加入100毫升PCR到Microcon YM-50列并加入400毫升的无菌水。在室温下1000g离心15 - 20分钟。 **注意关键：膜应该是干的。如果没有再离心 4|Place the Microcon column into a new microfuge tube (provided in the kit), add 20ml of sterile water, vortex briefly and then turn the Microcon column upside down. Spin for 1 min at 1,000 g at room temperature to recover the DNA. 把小层析柱放在一个新的离心管(在这个工具包中提供),增加20毫升的无菌水、短暂离心,然后颠倒层析柱。自旋1分钟1000 g在室温下恢复了DNA **注意关键：离心的步骤应该快速。离心机1分钟只是为了避免样本太干。 5|Check the quality, quantity and size of the PCR amplification product by loading 1/20 of the preparation on a 1% (wt/vol) agarose gel in 1 TBE buffer. DNA should appear as a band and not as a smear. The 1/20 of the preparation should contain at least 40 ng of DNA. 通过装载1/20的稀释液在1*的TBE buffer缓冲液中的1% (wt/vol)的琼脂糖凝胶检查PCR的扩增产物的质量
细胞免疫荧光实验步骤
细胞免疫荧光实验步骤 细胞免疫荧光实验步骤 简单实验步骤如下: 1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时. 2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟 3.PBS洗净:3min＊3 4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS 5.PBS洗净:2＊5min 6.羊血清封闭：３７度，２０分钟 ７.一抗，４度过夜，一般要大于１８小时或者３７度１－２小时 ８.４度PBS洗净，３min＊５次 ９.二抗３７度小于一小时 １０.３７度PBS洗净，３＊５min 凉干封片（封闭液ＰＨ８.５） 活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备 （一）制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、 胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法) ↓ 用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为 5×10６～１×10７／ml ↓ 取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl) 的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS 稀释)灭活正常兔血清 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右 1000rpm×5min
↓ 弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠 (或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右 1000rpm×5min ↓ 加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入 1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察， 视细胞浓度加入100～500μl固定液) ↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察 (标本在试管中可保存5～7天) （二）试剂和器材 1. 各种特异性单克隆抗体。 2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。 3. 10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。 4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。 （三）注意事项 1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN ３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。 2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。 3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。 4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。 附: 1. DPBS (×10, 贮存液)
原位杂交操作流程
原位杂交操作流程 1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天 1）二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟； 2）无水乙醇浸泡2次，每次3分钟； 3） 95%乙醇浸泡2次，每次3分钟； 4） PBS清洗3分钟； 5） 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟； 6） PBS清洗10分钟； 7）加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育15分钟； 8） PBS清洗2次，每次3分钟； 9） 0.2N的HCl孵育30分钟； 10）PBS清洗2次，每次3分钟； 11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟； 12）PBS清洗2次，每次5分钟； 13）预杂交缓冲液孵育30分钟； 14）准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85℃加热5分钟，置于冰块中10分钟； 15）杂交；第二天 16）将玻片置于SSC中2次，每次5分钟以去除封片； 17）PBS清洗3分钟； 18）RNA酶A溶液中（或0.1-1ng/mlPBS中），37℃孵育30分钟； 19）PBS清洗5分钟； 20）室温，2×SSC清洗10分钟； 21）37℃，1×SSC清洗10分钟； 22）37℃，0.5×SSC清洗10分钟； 23）缓冲液A孵育10分钟； 24）缓冲液A（1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100）孵育30分钟； 25）加入抗地高辛抗体（1/200的上述缓冲液，来自Boehringer Mannheim），37℃孵育3 小时； 26）缓冲液A清洗2次，每次10分钟； 27）缓冲液B清洗2次，每次5分钟； 28）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到16小时；29）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗； 30）固红，脱水以及封片进行核的复染。 2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天 1）二甲苯于37℃脱蜡2次，每次15分钟； 2）无水乙醇浸泡2次，每次5分钟； 3） 95%乙醇浸泡2次，每次5分钟； 4） PBS清洗5分钟； 5） 2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟； 6） PBS清洗5分钟； 7）加入胃蛋白酶25ul/ml，37℃孵育10分钟； 8） PBS清洗2次，每次5分钟； 9） 0.2N的HCl孵育30分钟； 10）PBS清洗2次，每次5分钟； 11）0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；
细胞免疫荧光步骤(仅供参照)
方法一： 1.首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片） 2.然后在4％PFA里面室温下固定30分钟，PBS洗两次，0.1% TX-100室温下作用1－2分 钟使细胞膜通透。 3.接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如大的培养皿）里面， 放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。 4.剪一片合适大小的parafilm，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS中的一抗（稀释倍数依具体 抗体而定），每个玻璃片30ul足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育30分钟，然后在PBS里洗三次。 5.接下来二抗孵育步骤同上。 6.最后，在载玻片加上mounting medium（大约每个玻璃片加10ul），把玻璃片放上去（细 胞面朝下），37度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。 7.抗体很重要，不能有非特异性结合。你可以先做WB检测一下你的抗体，看看有没有杂带。 8.双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法合适）。 如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。 方法二： 1.选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，二抗则是不 同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。 2.我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索， 我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。 3.我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对 照是PBS+荧光标记物。 4.封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常donkey血清。 5.其余步骤同一般免疫荧光单标操作。 方法三： 1.片子的制作：可以做细胞爬片，细胞甩片，还有直接在24well/12well/96well中直接染色 2.细胞爬片的制作：直接购买公司的已经处理过的细胞爬片，要是自己制作的话，就用无菌 的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片 3.细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。
原位杂交的方法
原位杂交 1 探针的设计与合成 1)根据实验室已有的p8基因cDNA全长序列，用premier primer5.0设计引物p81和p82， 以卤虫cDNA为模板，PCR扩增得到346bp的产物，用Takara胶回收试剂盒回收纯化。引物编号引物序列长度 p81 TGCGGACGAAACAGGAAG 18 bp p82 GCTCAAACAGTGA TGCCAGT 20 bp 2)目的片段克隆 a. 在无菌离心管中加入连接载体的各种成分，载体与片段的摩尔比控制在1:3-1:8，根据凝胶电泳检测后的浓度及载体与片段分子大小来计算摩尔比。加入成分及比例如下： 目的PCR片段 5 μl pGM-T载体（约50ng/uL） 1 μl 10×T4 DNA Ligation Buffer 1 μl T4 DNA Ligase（3U/uL） 1 μl 无菌去离子水 3 μl 总体积10 μl b. 轻轻弹动离心管以混合内容物，短暂离心。置于PCR仪中16℃过夜连接，反应结束后将离心管置于冰上。 c. 向铺好的含有氨苄青霉素的固体平板表面加入16 μl的IPTG（50mg/ml）、40 μl的X-gal （20mg/ml），使用无菌的弯头玻璃棒将其均匀的涂开，避光置于37℃培养箱1-3小时，使溶解X-gal的二甲基甲酰挥发干净。 d. 将10 μl的连接产物加到100 μl DH5 感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴半小时，将离心管置于42℃水浴90秒，取出管后立即置于冰浴上放置2-3分钟，其间不要摇动离心管。向离心管加入500 μl 37℃预热的LB（不含抗生素）培养基，150rpm摇床37℃振荡培养45分钟。目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。将菌液于4000g下离心10分钟，去掉上清，加入100 μl培养液重溶并加入到配制好的LB固体培养基上，用无菌的弯头玻璃棒轻轻将细胞均匀涂开。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养12-16小时。 e. 挑取白色菌落直接进行PCR检测，筛选转化子。 f. 将转化子接种于LB液体培养基中培养24小时，吸取1mL菌液送至大连宝生物公司进行序列测序。 3)重组质粒的线性化 取6 μl以测序的重组质粒，选取NcoI内切酶37℃酶切4h。酶切反应体系为20 μl： 质粒 6 μl 10xK Buffer 2 μl NcoI酶 1 μl 0.1% BSA 2 μl 灭菌水9 μl 终体积20 μl 取酶切前后的质粒各4 μl，经1%琼脂糖电泳检测，确认酶切完全，将酶切产物用Takara胶回收试剂盒回收纯化，作为探针合成的模板。 4)探针合成 按罗氏DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)试剂盒使用指南，标记反义RNA探针。 使用的所有试剂和器皿均经去RNase处理，合成方法如下:先准备反应体系。冰上向RNase-Free的微离心管中顺序加入下列试剂:
免疫荧光双标操作方法及注意事项
在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。 (1)直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A 和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。直接法简便可靠，但灵敏度较低。 (2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。 免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项 一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下： 1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。 2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。 3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。 4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1)。条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。
5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。 6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。 二、注意事项 1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。 2、每次试验均需设置以下三种对照： (1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物; (2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物; (3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。 三、免疫荧光双标的经验之谈 1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。 2、我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要自我摸索，我感觉一抗4℃孵育过夜比较好，背景比较清晰。 3、我的阳性对照采用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。 4、封闭血清是二抗来源动物的正常血清，我用的是10%正常donkey 血清。 5、其余事项同免疫荧光单标操作。 免疫组化双重染色方法和步骤 在生物医学和临床研究实践中，经常需要检测两种不同物质是否在同一
原位杂交技术的操作详解及小贴士
原位杂交技术的操作详解及小贴士 原位杂交技术应用于染色体、细胞和组织切片等样品中进行核酸特异性检测，与免疫组化技术的结合应用，能将DNA、mRNA和蛋白水平上的基因活性与样品的显微拓扑信息结合起来。1969年Pardue和Gall将放射性标记的探针直接应用于纯化核酸的杂交，此后得益于分子克隆技术的发展，及不同探针标记系统和检测系统的应用，大大增加了原位杂交检测的应用灵活性和检测灵敏度。 多种探针标记检测系统 基于地高辛、生物素和荧光标记分子的标记和检测系统是常见的原位杂交检测方法。 荧光标记检测常为直接探针标记方法，如在dUTP/UTP/ddUTP上连接Fluorescein后进行核酸标记。由于标记在核酸上的荧光分子必须经受杂交和洗脱过程中的考验，以及荧光分子易于衰减，其检测灵敏度受到一定的影响。但对荧光分子的直接检测呈现的背景较低。 间接标记的方法中应用了报告分子标记的探针，报告分子通过亲和酶促的方法进行显色。常用的报告分子如地高辛，生物素。结合地高辛抗体或链霉亲和素上耦联的酶系统进行间接的底物反应检测。地高辛标记核酸的历史可追溯到1987年，由于地高辛是洋地黄的花和叶中特有的成分，检测时使用的地高辛抗体不会结合于其他的生物分子。这是相较于生物素标记系统的优势。地高辛抗体上可耦联碱性磷酸酶、过氧化酶，及荧光分子和胶体金等，根据不同的应用需求，呈现高信噪比的核酸检测结果。但需注意，由于引入了免疫检测反应，在放大检测灵敏度的同时，应注意样品内源性酶的灭活，以降低检测背景。 通过不同标记方法的联合应用，还可在同一样本中实现染色体不同区域或细
胞样本中不同RNA序列的多重检测。 原位杂交中探针的选择 DNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针均能通过不同的酶促分子反应进行标记。寡核苷酸探针的长度较短，因此避免了探针内部退火的问题，在杂交时的渗透能力也更好，探针与靶标的接触这是影响原位杂交是否成功的重要因素之一。DNA 探针、RNA探针在合成时需要控制探针片段长度，通常300-1000bp左右，能覆盖到较长片段的靶核酸序列，增加检测的灵敏度。 就DNA探针和RNA探针的比较，DNA探针在杂交过程中会出现探针双链之间退火的可能，也更倾向于在溶液中形成大分子的探针聚合体，从而影响其渗透能力。而RNA 探针的应用，将提高DNA-RNA杂交子的热稳定性。 Tips：RNA探针因其单链、高分子结合力、可适应高温杂交的特性，其检测特异性和灵敏度均优于DNA探针。常用的RNA探针标记方法为构建质粒后进行转率合成。通过PCR扩增的方法，可以更方便地进行RNA探针的制备；RNA探针合成后，还需验证其对目标片段检测的灵敏度和特异性。具体实验流程和注意事项可参考技术文章：A Method for High Quality Digoxigenin-Labeled RNA Probes for In Situ Hybridization 原位杂交检测步骤 原位杂交涉及的步骤：玻片的准备和样品固定，细胞或组织的预渗透处理，靶DNA变性（DNA原位杂交），探针制备，原位杂交过程，杂交后洗涤，探针（显色）检测。 1. 玻片的准备和样品固定 对于染色体涂片，1：1的乙醇/醚处理的载玻片已能符合要求。对于组织切片的原位杂交，为了在实验过程中不丢失组织样品，可使用多聚赖氨酸或铬矾
免疫荧光实验步骤大全(精华版)
免疫荧光染色大全（精华版） 组织免疫荧光法 （1）将待染组织切片置于65摄氏度恒温箱烤片1h，脱蜡 （2）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （3）0.5%Triton X-100（PBS 配制）室温通透 10min （4）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 注意：步骤（3）和（4）用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原直接跳过此步骤（5）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火3min，后转成低火 15min。 （6）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （7）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。 （8）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （9）使用1% BSA进行室温封闭 30min，用于封闭非特异性抗原表位。 （10）按抗体推荐使用说明书孵育特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜。（11）次日取出切片，室温下复温 30min。 （12）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （13）选取相应的免疫荧光二抗滴加于血管组织上，37°C避光孵育30min。（14）1×PBS洗涤 3 次，每次 5min。 （15）避光条件下，DAPI 染液染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用（16）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （17）在血管组织上滴加抗荧光淬灭剂进行封片。 （18）使用荧光显微镜进行观察拍照。 贴壁细胞免疫荧光法 （1）在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3min （2）4%多聚甲醛固定细胞爬片15min （3）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （4）0.5%Triton X-100（PBS配制）室温通透10min （5）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （6）1%BSA室温封闭30min （7）弃掉封闭液，细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗，4℃孵育过夜（8）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （9）细胞爬片滴加稀释至适当比例的荧光二抗 （10）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （11）DAPI染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用 （12）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （13）用抗荧光淬灭剂封片 （14）荧光显微镜下观察采集图像 细胞免疫荧光（悬浮细胞方法一） （1）收集悬浮细胞，细胞在冰浴中冷却，然后用台式离心机于4℃以800 g 离心5 min，吸去培养液并以4℃ 1×PBS重悬细胞。
原位杂交实验操作步骤
原位杂交实验操作步骤 撰写人：范为民 一、实验原理 原位杂交是指借助于核酸分子杂交的方法，在显微镜水平检测和定位特异的核苷酸片段。现在原位杂交已经成为在分子水平研究肿瘤和遗传性疾病的发生，发展和调控等根本性问题的有力工具。 二、试剂盒 本实验室常用的原位杂交试剂盒是博士德公司生产的敏感加强型原位杂交检测试剂盒，此试剂盒分为两种，一种为过氧化物酶（POD）检测（MK1030型），一种为碱性磷酸酶(AP)检测系统（MK1032型），用于mRNA的杂交。过氧化物酶（POD）检测的最终信号为棕黄色，而碱性磷酸酶(AP)检测的信号为紫色，因后者信号比较突出，所以一般采用后一种检测方法。两种检测方法的实验步骤相差不多，所用洗脱缓冲液也大同小异。用于杂交的探针也可以分为两种，一种是DNA探针，即是用DNA与组织中的mRNA杂交，另一种是RNA 探针，即用RNA与组织中的mRNA杂交。DNA探针处理操作简单，但杂交信号一般不如RNA探针强烈，所以条件允许的话一般采用RNA探针。下面先介绍碱性磷酸酶(AP)检测试剂盒，采用RNA作为探针的操作步骤。 三、实验步骤 原位杂交实验主要包括三大部分，即组织冰冻切片、RNA探针标记、原位杂交三部分。 （一）组织冰冻切片 1. 实验准备 （1）原位杂交专用载玻片：用多聚赖氨酸处理后的载玻片，使切片紧密粘附在玻片上，可以用于后面的洗脱。一般一张载玻片上可以贴至多十张切片（可以是不同组织的切片），所以需要玻片的数目需要根据实验的要求而定。这种专用载玻片可以从中杉金桥公司购买，目前价格是每片2.2元，玻片有一面的一端是毛玻璃，用于标记组织名称等，切片应该贴在此面，切勿贴到反面。 （2）缓冲液配备 1.1器具准备 剪刀、镊子各三把，开壳钳一把，100ml量筒一个，磁力搅拌子一个；100ml试剂瓶一个，250ml试剂瓶三个。以上器具均洗净后置于180摄氏度以上烘烤6小时以上。铅笔、显微镜、冰、吸水纸、一次性塑料手套等。 1.2 溶液配制 0.1M PB缓冲液：Na2HPO4?12H2O 5.8021g,NaH2PO4?2 H2O 0.5928 g,加入200ml ddH2O溶解于之前准备的250ml试剂瓶中，再加入200ūl DEPC，充分摇匀后过夜，高压灭菌。以上溶液配制两份，其中一份瓶中放入磁力搅拌子。