硅胶柱层析法分离纯化杜仲粕中桃叶珊瑚苷

硅胶柱层析法分离纯化杜仲粕中桃叶珊瑚苷

李 辉1,2，汪 兰1，彭玉丹1，张永康1,2

(1.吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南 吉首 416000；2.吉首大学 林产化工工程湖南省重点实验室，湖南 张家界 427000)

摘 要：探讨使用硅胶柱层析法从杜仲粕中分离纯化桃叶珊瑚苷(Au)，优化柱层析吸脱附条件，用薄层色谱法(TLC)和高效液相色谱法(HPLC)对产品进行定性定量分析。结果表明：优化的硅胶用量为生药质量的2倍，使用V (甲醇):V (氯仿):V (石油醚):V (乙酸乙酯)为7:1:0.5:1.5的混合溶剂在1.0mL/min 流速下进行洗脱，通过收集含Au 高的组分，经减压浓缩、结晶、过滤、重结晶等过程，可获纯度为96.56%的桃叶珊瑚苷产品。关键词：桃叶珊瑚苷；柱层析；硅胶；纯化

Purification of Aucubin from the Crude Extract of Eucommia ulmoides Seeds by Silica Gel Chromatography

LI Hui 1,2，WANG Lan 1，PENG Yu-dan 1，ZHANG Yong-kang 1,2

(1. College of Biology and Environmental Science, Jishou University, Jishou 416000, China ；2. Hunan Provincial Key Laboratory

of Forest Products and Chemical Industry Engineering, Jishou University, Zhangjiajie 427000, China)

Abstract ：A silica gel chromatographic method was presented for the purification of aucubin (Au) from the crude extract of the residue of Eucommia ulmoides seed meal left after linolenic acid extraction. Subsequently, the extracted product was analyzed qualitatively and quantitatively. An optimal purification of Au was achieved by using a 2-fold mass of silica gel for Au adsorption followed by desorption with a 70% methanol/chloroform/petroleum ether/ethyl acetate mixture (7:1:0.5:1.5, V/V ) at a flow rate of 1.0 mL/min. The eluate fractions were harvested and subjected to vacuum condensation, crystallization, filtration and recrystallization, and a final Au product with 96.56% purity was obtained.Key words ：aucubin ；column chromatography ；silica gel ；purification

中图分类号：TS201.1；R284.2 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)14-0058-04

收稿日期：2009-11-02

基金项目：湖南省教育厅优秀青年项目(B060701)

作者简介：李辉(1968—)，男，副教授，博士，主要从事生命科学中的分离分析新方法研究。E-mail ：lihuijsdx@https://www.360docs.net/doc/734289476.html,

湘西地区杜仲资源十分丰富，且品质独特。杜仲籽经超临界萃取亚麻酸后的杜仲粕中含有约8%的桃叶珊瑚苷[1]。近期的研究表明桃叶珊瑚苷具有清湿热、利小便、镇痛、降压、保肝护肝、抗肿瘤等生物活性[2-4]，并且在预防鸡瘟和禽流感方面也有一定效果。桃叶珊瑚苷属环烯醚萜类化合物，常温下为白色粉末，具有烯醇式的缩醛结构[5](分子结构如图1所示)，易溶于水、甲醇，可溶于乙醇、丙酮等有机溶剂[6]。在酸性和碱性条件下极易水解、聚合而被破坏[7]。因此，提取桃叶珊瑚甙要在低温(一般在50℃以下)下进行，贮存时要避光、干燥、密封。目前，桃叶珊瑚甙的提取分离方法主要有冷浸提取法、回流提取法、超声波提取法、超临界CO 2萃取法，提取溶剂一般为水、甲醇及乙醇[8]。分离纯化桃叶珊瑚苷常采用铅盐沉淀法、活性炭吸附

法[9]、大孔吸附树脂法[10]、薄层色谱分离法[11]、半制备高效液相色谱法等[12-13]。桃叶珊瑚甙的检测主要有紫外分光光度法、薄层扫描法和高效液相色谱法[14-16]，其中，高效液相色谱法操作简便，分辨率高、重复性好。本实验用硅胶柱层析分离和纯化杜仲粕提取物，考察吸脱附条件对分离的影响。１材料与方法

1.1

材料与试剂

杜仲粕 湘西和益生物科技有限公司。

薄层用硅胶(化学级)、柱层析用硅胶(试剂级) 青岛海洋化工厂；桃叶珊瑚甙对照品 中国药品生物制品检定所；甲醇、氯仿、石油醚、乙酸乙酯、冰醋酸(AR 级) 上海化学试剂厂。

称取杜仲粕100g ，用超声波清洗盆提取桃叶珊瑚苷，提取溶剂为80%乙醇溶液、料液比1:8、时间0.5h 、重复提取3次，合并滤液，低温冷藏备用。1.2

仪器与设备

LC-6A 高效液相色谱仪(配有LP-6A 输送泵、SIL-6B 进样器和系统控制器、色谱柱加热箱、LC-10μV 型紫外检测器、数据收集卡及色谱工作站)、AEL-40SM 电子分析天平 日本岛津公司；B8200超声波清洗器 日本利昂公司；玻璃层析柱(3cm ×30cm) 上海楚定分析仪器有限公司。1.3方法

1.3.1

静态吸附与解吸

准确称取经预处理(预处理时，先用浓盐酸浸泡12h ，然后用蒸馏水冲洗至无Cl －，再于110℃干燥2h ，冷却后备用)的柱层析硅胶1.000g 于三角瓶中，加入桃叶珊瑚苷质量浓度为912.3μg/mL 的杜仲粕提取液40mL ，室温条件下振荡12h ，静态吸附。每隔2h 取样一次，用高效液相色谱法分析其中桃叶珊瑚苷含量，按式(1)计算吸附率(A )。

C 0－C

A/% = —————×100 (1)

C 0

式中：C 0为初始质量浓度/(μg/mL)；C 为任一时刻吸附液质量浓度/(μg/mL)。

加入40mL V (甲醇):V (氯仿):V (石油醚):V (乙酸乙酯)=7:1:0.5:1.5的混合洗脱剂于吸附了桃叶珊瑚苷的硅胶中，室温条件下脱附，每隔2h 取样一次，分析其中桃叶珊瑚苷含量，按式(2)计算解吸率(D )。

C D V D

D /% = ———×100 (2)

m

式中：C D 为解吸液中桃叶珊瑚苷质量浓度/(μg/mL)；V D 为脱附液体积/mL ；m 为初始吸附量/(mg/g)。1.3.2

柱层析分离与纯化

按m (生药):m (硅胶)＝1:2称取预处理好的硅胶(120μm)，并与甲醇-氯仿-石油醚-乙酸乙酯溶剂混合，搅拌均匀，湿法装柱。装柱时轻敲层析柱下部，使填装紧密，用洗脱剂洗柱至滴出液无浑浊，放置待用。

称取20g 杜仲粕，超声提取后，提取液减压浓缩至生药质量浓度1g/mL 上柱。用甲醇-氯仿-石油醚-乙酸乙酯混合溶剂洗脱，控制好流速，观察色带，定量收集洗脱液，每份5mL ，高效液相色谱测定流分中桃叶珊瑚苷质量浓度，合并质量浓度高的流分，减压浓缩至近干，用适量有机溶剂溶解，于－25℃环境下冷藏、结晶、微孔滤膜抽滤，再用适量有机溶剂溶解，－25℃环境进行重结晶，得桃叶珊瑚苷产品。1.3.3

桃叶珊瑚甙的检测

高效液相色谱法：色谱条件：Kromasil C 18柱；流

动相配比为V (甲醇):V (水)=20:80；流速1.0mL/min ，检测波长210nm ；柱温：30℃；进样体积5μL 。以桃叶珊瑚苷对照品定性，标准曲线法定量，标准方程为：y =432.98x －11844，R =0.9995。

薄层色谱法：用薄层层析硅胶制备一定量的硅胶板(3～5m m )，阴干，110℃活化2h ，用移液枪吸取桃叶珊瑚苷产品和对照品的甲醇溶液，在硅胶板上进行点样，展开剂展开后以桃叶珊瑚苷对照品显色定位。２结果与分析2.1

静态吸附与解吸

图2显示了桃叶珊瑚苷在硅胶上的静态吸附率和脱附率随接触时间的变化关系。可见吸附率随时间增加而增加，当吸附8h 时，超过90%的桃叶珊瑚苷已被吸附，再延长时间，吸附趋于稳定。产物解吸率同样先随时间增加而迅速增大，经10h 时解吸率达到95.1%，然后变得稳定。2.2

硅胶柱层析

图1　桃叶珊瑚甙的分子结构Fig.1 Molecular structure of aucubin

OH

H

H O O

O CH 2OH

OH

OH

CH HOCH 2

图2　吸附率和解吸率随时间的变化关系

Fig.2 Adsorption and desorption curves of Au on silica gel

10090

807060吸附率/%

时间/h

2

4

6

810

12

14

95

90

85

80解吸率/%

吸附率解吸率

2.2.2

洗脱剂中甲醇体积分数对分离的影响

当使用甲醇-氯仿-石油醚-乙酸乙酯混合洗脱剂时，

考察了混合剂中不同甲醇体积分数时[(50%、70%、90%，同时保持V (氯仿):V (石油醚):V (乙酸乙酯)=1:0.5:1.5不变)]桃叶珊瑚苷的分离效果。基于产物分子中的多羟基结构，甲醇体积分数对其脱附有重要影响。图4表明当使用含有不同甲醇体积分数的混合溶剂洗脱时，大部分产物在流分6～12中洗出。当混合洗脱剂中甲醇体积分数为70%时，6～12流分中含有的总桃叶珊瑚苷最多。

当洗脱剂流速为0.5mL/min 时，从第5个流分开始，桃叶珊瑚苷就被大量洗出，到第13个流分，所含产物基本洗净。而在1.0mL/min 和1.5mL/min 的流速下，大部分产物都集中在第6～13个流分中，流分中最高的桃叶珊瑚苷质量浓度是在1.0mL/min 流速下获得的。

2.2.1

硅胶用量对分离的影响

按m (生药):m (硅胶)分别为1:1、1:2、1:3，考察不同硅胶用量对产物分离的影响。按体积收集流分，每份5mL ，结果见图3。可以发现尽管使用不同的硅胶用量，但桃叶珊瑚苷质量浓度较高的流分集中在6～12号，当m (生药):m (硅胶)为1:2时，所获流分中的产物质量浓度最高，这显示了目标产物的集中脱附区域，有利于流分收集和产品纯化。

2.2.3

洗脱剂流速对分离的影响

洗脱剂流速的影响主要表现在洗脱剂与硅胶表面活

性位点的置换速率及产物流出速率。图5给出了3种流速下各流分中桃叶珊瑚苷的质量浓度变化。可以看出，上述实验表明：硅胶柱分离桃叶珊瑚苷的最优条件是：m (生药):m (硅胶)＝1:2，含70%甲醇的混合洗脱剂，洗脱剂流速为1.0mL/min 。2.3

优化分离纯化桃叶珊瑚苷

在优化柱层析条件下，杜仲粕超声提取液经柱层

析、减压浓缩、结晶、过滤、重结晶等过程后获得的产品收率和纯度示于表1中。产品纯度达到了96.56%，显示了柱层析法在分离和纯化杜仲粕中桃叶珊瑚苷时的优越性能。

原料量/g 产品量/mg 收率/(g/100g)

产品纯度/%

20.00

396.25

1.98

96.56

表1　优化条件下的样品纯化结果

Table 1 Yield and purity of Au from the crude extract of the residue of Eucommia ulmoides seed meal left after linolenic acid extraction 2.4薄层色谱与高效液相色谱分析

图6分别显示了桃叶珊瑚苷对照品和产品的薄层色谱图和高效液相色谱图。从图6a 可以发现通过显色剂显色后，桃叶珊瑚苷产品与对照品均在比移值Rf ＝0.6972处出现一个斑点，产物薄层色谱图上未检测出杂质斑点，表明产品具有很高的桃叶珊瑚苷含量。同样的结果也被高效液相色谱分析所证明，只不过在产物的HPLC 图上，除了桃叶珊瑚苷峰(t R ＝2.933min)外，还检测到一些杂质峰。标准曲线法给出了产品中桃叶珊瑚苷的纯度可达96.56%。2.5

重现性测试

为了研究HPLC 分析的重现性，称取桃叶珊瑚苷产

品0.1g 溶解于10mL 甲醇中，在相同的色谱条件下平行测定5次，测得产品纯度分别为97.01%、96.27%、

图3　不同硅胶用量时流分中的桃叶珊瑚苷质量浓度Fig.3 Au concentrations of fractions obtained at varying silica gel

amounts 100806040200

m (生物):m (硅胶)=1:1

m (生物):m (硅胶)=1:2m (生物):m (硅胶)=1:3

质量浓度/(μg /m L )

流分序号

12345678910111213141516

图4　不同甲醇体积分数下流分中的桃叶珊瑚苷质量浓度Fig.4 Au concentrations of fractions obtained at varying methanol

concentrations

100806040200

甲醇体积分数50%

甲醇体积分数70%甲醇体积分数90%

质量浓度/(μg /m L )

流分序号

123456789101112131415

16

图5　不同流速时流分中的桃叶珊瑚苷质量浓度

Fig.5 Au concentrations of fractions obtained at varying desorption

flow rates

100806040200

洗脱剂流速0.5mL/min

洗脱剂流速1.0mL/min 洗脱剂流速1.5mL/min

流分序号

质量浓度/(μg /m L

)

12345678910111213141516

95.87%、96.38%、97.27%。测定结果的相对标准偏差为0.59%，显示了较好的分析重现性。

图6　桃叶珊瑚苷对照品和产品的薄层色谱(ａ)和

高效液相色谱图(b.对照品；c.产品)

Fig.6 Thin-layer chromatogram (a) and HPLC chromatograms for

standard Au (b) and product (c)

加入量/mg

回收量/mg 回收率/%回收率平均值/%

20388.6596.5340416.2798.5096.6180

438.55

94.80

表2　回收率实验结果

Table 2 Recoveries for Au in the residue of Eucommia ulmoides seed

meal left after linolenic acid extraction spiked at 3 levels

下进行实验。测定结果如表2所示。桃叶珊瑚苷产品的平均回收率为96.61%。3

结 论

使用甲醇-氯仿-石油醚-乙酸乙酯(7:1:0.5:1.5，V/V )

混合洗脱剂，硅胶柱层析法分离和纯化杜仲粕提取液中的桃叶珊瑚苷时显示了优越的分离性能，每20g 杜仲粕可获得约0.4g 纯度为96.56%的桃叶珊瑚苷产品。优化的吸脱附条件为：m (生药):m (硅胶)为1:2，混合洗脱剂中甲醇体积分数为70%，洗脱剂流速为1.0mL/min 。

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a

桃叶珊瑚苷产品

桃叶珊瑚苷对照品

15000120009000600030000信号强度

6

12

18

24

30

c

保留时间/min

2000015000100005000

0信号强度

6

12

18

24

30

b

保留时间/min

考察提取及分离纯化方法的重现性时，平行称取4份杜仲粕(每份20g)，按1.3.2节的实验步骤，在相同的条件下进行提取和纯化后，得到的产品量分别为375.87、406.28、396.15、400.22mg ，相对标准偏差为3.34%。2.6

回收率

于3份杜仲粕样品中(每份20g)，分别加入不同质量的桃叶珊瑚苷对照品，按1.3.2节的实验步骤在相同条件