蛋白质的提取与纯化

一，蛋白质的提取

大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。

（一）水溶液提取法

稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。

下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。

1、pH值

蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。

2、盐浓度

稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等

中性盐，一般以0.15摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。

（二）有机溶剂提取法

一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。

二、蛋白质的分离纯化

蛋白质的分离纯化方法很多，主要有：

（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法

1、蛋白质的盐析

中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。

影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。（2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。（3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。

蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升；0度时饱和溶解度为3.9M，即676克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。

蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。

2、等电点沉淀法

蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。

3、低温有机溶剂沉淀法

用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。（二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法

1、透析与超滤

透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。

超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。

2、凝胶过滤法

也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadex ged）和琼脂糖凝胶（agarose gel）。

（三）根据蛋白质带电性质进行分离

蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。

1、电泳法

各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。

2、离子交换层析法

离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素；DEAE?FONT FACE="宋体" LANG="ZH-CN">纤

维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。（详见层析技术章）

（四）根据配体特异性的分离方法－亲和色谱法

亲和层析法（aflinity chromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand）的分子能特异而非共价地结合。其基本原理：蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离（Separation），提纯（Purification）

和鉴定（Characterization）是生物化学中的重要的一部分，至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此往往采取几种方法联合使用。

细胞的破碎

1、高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。

2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。

3、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia

coli)(Escherichia coli)制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG 至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。

4、反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

5、化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁(cell wall)(cell wall)(cell wall)较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。

无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。

浓缩、干燥及保存

一、样品的浓缩

生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀，为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓缩。常用的浓缩方法的：

1、减压加温蒸发浓缩通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。

2、空气流动蒸发浓缩空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液，表面不断通过空气流；或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室，用电扇对准吹风，

使透过膜外的溶剂不沁蒸发，而达到浓缩目的，此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。

3、冰冻法生物大分子在低温结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中，操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体，然后缓慢地融解，利用溶剂与溶质融点介点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如蛋白质和酶的盐溶液用此法浓缩时，不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面，蛋白质和酶则集中于下层溶液中，移去上层冰块，可得蛋白质和酶的浓缩液。

4、吸收法通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩。所用的吸收剂必需与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等，使用聚乙二醇吸收剂时，先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里，外加聚乙二醇复盖置于4度下，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水饱和后要更换新的直至达到所需要的体积。

5、超滤法超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法，不液体在一定压力下（氮气压或真空泵压）通过膜时，溶剂和小分子透过，大分子受阻保留，这是近年来发展起来的新方法，最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐，并具有成本低，操作方便，条件温和，能较好地保持生物大分子的活性，回收率高等优点。应用超滤法关键在于膜的选择，不同类型和规格的膜，水的流速，分子量截止值（即大体上能被膜保留分子最小分子量值）等参数均不同，必须根据工作需要来选用。另外，超滤装置形式，溶质成份及性质、溶液浓度等都对超滤效果的一定影响。Diaflo 超滤膜的分子量截留值：用上面的超滤膜制成空心的纤维管，将很多根这样的管拢成一束，管的两端与低离子强度的缓冲液相连，使缓冲液不断地在管中流动。然后将纤维管浸入待

透析的蛋白质溶液中。当缓冲液流过纤维管时，则小分子很易透过膜而扩散，大分子则不能。这就是纤维过滤秀析法，由于透析面积增大，因而使透析时间缩短10倍。

二、干燥

生物大分子制备得到产品，为防止变质，易于保存，常需要干燥处理，最常用的方法是冷冻干燥和真空干燥。真空干燥适用于不耐高温，易于氧化物质的干燥和保存，整个装置包括干燥器、冷凝器及真空干燥原理外，同时增加了温度因素。在相同压力下，水蒸汽压随温度下降而下降，故在低温低压下，冰很易升华为气体。操作时一般先将待干燥的液体冷冻到冰点以下使之变成固体，然后在低温低压下将溶剂变成气体而除去。此法干后的产品具有疏松、溶解度好、保持天然结构等优点，适用于各类生物大分子的干燥保存。

三、贮存

生物大分子的稳定性与保存方法的很大关系。干燥的制品一般比较稳定，在低温情况下其活性可在数日甚至数年无明显变化，贮藏要求简单，只要将干燥的样品置于干燥器内（内装有干燥剂）密封，保持0－4度冰箱即可，液态贮藏时应注意以下几点。

1、样品不能太稀，必须浓缩到一定浓度才能封装贮藏，样品太稀易使生物大分子变性。

2、一般需加入防腐剂和稳定剂，常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白质和酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和辅酶以提高其稳定性。此外，钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定保护作用。核酸大分子一般保存在氯化钠或柠檬酸钠的标准缓冲液中。

3、贮藏温度要求低，大多数在0度左右冰箱保存，有的则要求更低，应视不同物质而定。

可依据蛋白质不同性质与之相对应的方法将蛋白质混合物分离：

1．分子大小

不同种类的蛋白质在分子大小方面有一定的差别，可用一些简便的方法，使蛋白质混合物得到初步分离。

1．1透析和超滤

透析在纯化中极为常用，可除去盐类（脱盐及置换缓冲液）、有机溶剂、低分子量的抑制剂等。透析膜的截留分子量为5000左右，如分子量小于10000的酶液就有泄露的危险，在纯化中极为常用，可除去盐类、有机溶剂、低分子量的抑制剂等。超滤一般用于浓缩和脱色

1．2离心分离置换缓冲液

许多酶富集于某一细胞器内，匀浆后离心得得到某一亚细胞成分，使酶富集10~20倍，再对特定的酶进行纯化。差速离心，分辨率较低，仅适用于粗提或浓缩。速率区带法，如离心时间太长所有的物质都会沉淀下来，故需选择最佳分离时间，可得到相当纯的亚细胞成分用于进一步纯化，避免了差速离心中大小组分一起沉淀的问题，但容量较小，只能用于少量制备。等密度梯度离心常用的离主介质有蔗糖、聚蔗糖、氯化铯、溴化钾、碘化钠等等

1．3凝胶过滤

这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一，注意使要离的蛋白质分子量落在凝胶的工作范围内。选择不同的分子量凝胶可用于脱盐、置换缓冲液及利用分子量的差异除去热源。

2．形状

蛋白质在离心通过溶液运动时，或通过膜、凝胶过滤填料颗粒或电泳凝胶中的小孔运动时，都会受到形状的影响：对两种相同质量的蛋白质而言，球状蛋白质具有较小的有效半径（斯托克半径），通过溶液沉降时遇到的摩擦力小，沉降较快而显得比其它形状的蛋白质大；反之，在体积排阻色谱时，斯托克半径较小的球状蛋白质更容易扩散进入凝胶过滤填料颗粒内部，较迟洗脱出来，因而显得比其它形状的蛋白质要小。

3．溶解度

利用蛋白质的溶解度的差别来分别各种蛋白质常用的方法。影响蛋白质溶解度的外界因素很多，其中主要有：溶液的pH、离子强度、介电常数和温度，但在同一的特定外界条件下，不同的蛋白质具有不同的溶解度。适当改变外界条件，控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度

3．1pH控制和等电点沉淀

蛋白质在其等电点一般较不易溶解。

3．2蛋白质的盐溶和盐析

3．3有机溶剂分级法

蛋白质在不同的溶剂中的溶解度有很大不同，从基本不溶（＜10μg/ml）直至极易溶解（＞300mg/ml）不等。影响蛋白质溶解度的可变因素包括温度、pH、溶剂的极性、离子性质和离子强度。引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，故控制有机溶剂的浓度可分离蛋白质。

水溶性非离子聚合物如聚乙二醇也能引起蛋白质的沉淀。

3．4温度

不同的蛋白质在不同的温度具有不同的溶解度和活性。大多数蛋白质在低温下比较稳定，故分离操作一般在0℃或更低温度下进行。

4．电荷

蛋白质净电荷取决于氨基酸残基所带的正负电荷的总和，如中性溶液中带净负电荷则称为酸性蛋白质，

4．1电泳

不仅是分离蛋白质混合物和鉴定蛋白质纯度的重要手段，而且也是研究蛋白质性质很有用的方法。

等电聚焦分辨率很高，pI有0.02pH的差异就能分开。

2D-PAGE分离蛋白质分辨率已经发展到100000个蛋白点。

4．2离子交换层析

改变蛋白质混合物溶液中的盐离子强度、pH和（阴、阳）离子交换填料，不同蛋白质对不同的离子交换填料的吸附容量不同，蛋白质因吸附容量不同或不被吸附而分离。

洗脱可采用保持洗脱剂成分一直不变，也可采用改变洗脱剂的盐度或pH的方法洗脱，后一种可分分段洗脱和梯度洗脱。梯度洗脱一般效果好，分辨率高，特别是使用交换容量小，对盐浓度敏感的离子交换剂，多用梯度洗脱。控制洗脱剂的体积（与柱床体体积相比）、盐浓度和pH，样品组分能从离子交换柱上分别洗脱下来。

蛋白分子暴露在外表面的侧链基团的种类和数量不同，故在一定的PH值和离子强度的缓冲液的所带的电荷不同

5．电荷分布

电荷的氨基酸残基可均匀地分布于蛋白质的表面，既可以适当的强度与阳离子交换柱结合也能以适当强度与阴离子结合，因多数蛋白质都有不能在单一的溶剂条件下同时与两种类型的离子交换柱结合，故可得用此性质纯化；电荷的氨基酸残基亦可成簇分布，使某一区域带强正电荷而另一区域带强负电荷，呈强酸性或强碱性，只能在极端pH与阳离子交换树脂或阴离子交换树脂结合，如钙调蛋白只能在pH2时与阳离子交换树脂结合。

6．疏水性

多数疏水性的氨基酸残基藏在蛋白质的内部，但也有一些在表面。蛋白质表面的疏水性氨基酸残基的数目和空间分布决定了该蛋白质是否具有与疏水柱填料结合从而利用它来进行分离的能力。

因其廉价和纯化后的蛋白质具有生物活性，是一种通用性的分离和纯化蛋白质的工具。高浓度盐水溶液中蛋白质在柱上保留，在低盐或水溶液中蛋白质从柱上被洗脱，故特别适用于浓硫酸铵溶液沉淀分离后的母液以及该沉淀用盐溶解后的含有目标产品的溶液直接进样到柱上，当然也适用7mol/盐酸胍或8mol/L脲的大肠杆菌(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)(Escherichia coli)的治疗蛋白质提取液直接进样到柱上，在分离的同时也进行了复性。

7．密度

多数蛋白质的密度在1.3~1.4g/cm3之间，分级分离蛋白质时一般不常用此性质，不过对含有大量磷酸盐或脂质的蛋白质与一般蛋白质在密度上明显不同，可用密度梯度法离心与大部分蛋白质分离。

8．基因工程(Genetic Engineering)(Genetic Engineering)(Genetic

Engineering)(Genetic Engineering)构建的纯化标记

通过改变cDNA在被表达的蛋白的氨基端或羧基端加入少许几个额外氨基酸，这个加入的标记可用来作为一个有效的纯化依据。

8．1GST融合载体

使要表达的蛋白质和谷胱甘肽S转移酶一起表达，然后利用Glutathione Sepharose 4B作亲和纯化，再利用凝血酶或因子Xa切开。

8．2蛋白A融合载体

使要表达的蛋白和蛋白A的IgG结合部位融合在一起表达，以IgG Sepharose 纯化。

8．3含组氨酸标记（Histidine-tagged）Chelating Sepharose

最通行的标记之一，是在蛋白质的氨基端加上6~10个组氨酸，在一般或变性条件（如8M尿素）下借助它能与Ni2+螯合柱紧紧结合的能力，用咪唑洗脱，或将pH降至5.9使组氨酸充分质子化，不再与结合Ni2+使之得以纯化。

重组蛋白在设计、构建时已融入纯化构想。样品多夹杂了破碎细胞或可溶产物，扩张床吸附技术STREAMLINE适合做粗分离。

9．亲和能力

结合效率高，分离速度快的特点。配基可是酶的底物、抑制剂、辅因子、特异性的抗体、

吸附后可改变缓冲液的离子强度和PH的方法，洗耳恭听脱下来，也可用更高浓度的同一配体溶液或亲和力更强的配体溶液洗脱

亲和层析固定相的配基与生物分子之间的特殊的生物大分子亲和能力不同来进行相互分离的，依亲和选择性的高低分为：基团性亲和层析，固定相上的配基对

一类基团的极强的亲和力。如含有糖基的一类蛋白质或糖蛋白对三嗪染料显示特别强的吸附能力；高选择性（专一性）亲和层析，配基仅对某一种蛋白质有特别强的亲和性。如单克隆抗体对抗原的特异性的吸附。

亲和层析除特异性的吸附外，仍然会因分子的错误认别和分子间非选择性的作用力而吸附一些杂蛋白质，另洗脱过程中的配体不可避免的脱落进入分离体系。与超滤结合起来，将两者优点集中形成超滤亲和纯化，具有高分离效率和大规模工业化的优点，适用于初分离。

按配基的不同可分为：

（1）金属螯合介质

过渡金属离子Cu2＋、Zn2＋和Ni 2＋等以亚胺络合物的形式键合到因定相上，由于这些金属离子与色氨酸、组氨酸和半胱氨酸之间形成了配价键，从而形成了亚胺金属—蛋白螯合物，使含有这些氨基酸的蛋白被这种金属螯合亲和色谱的固定相吸附。螯合物的稳定性受单个组氨酸和半胱氨酸解离常数所控制，从而亦受流动相的pH和温度的影响，控制条件可以使不同蛋白质相互分离。

（2）小配体亲和介质

配体有精氨酸、苯甲酰胺、钙调因子、明胶、肝素和赖氨酸等等。

（3）抗体亲和介质

即免疫亲和层析，配体有重组蛋白A和重组蛋白G，但蛋白A比蛋白G专一，蛋白G能结合更多不同源的IgG。

（4）颜料亲和介质

染料层析的效果除主要取决于染料配基与酶的亲和力大小外，还与洗脱缓冲液的种类、离子强度、PH值及待分离的样品的纯度有关。配体有Cibacron Blue和

Procion Red两种。在一定的条件下，固定化的染料能起阳离子交换剂的作用，为了避免此现象的发生，最好要离子强度小于0。1和PH大于7时操作。（5）外源凝集素亲和介质

配体有刀豆球蛋白、扁豆外源凝集素和麦芽外源凝集素，固相外源凝集素能和数种糖类残基发生可逆反应，适合纯化多糖、糖蛋白。

10．非极性基团之间作用力

溶质分子中的非极性基团与非极性固定相间的相互作用力（非选择性分散力或伦敦力）大小与溶质分子极性基团与流动力相中极性分子在相反方向上相互作用力的差异进行分离。因其流动相中的置换剂是极性小于水的有机溶剂（如甲醇、乙腈、四氢呋喃等），这些有机溶剂可能使许多蛋白质分子产生不可逆的变性；流动相中须有离子对试剂（如三氟乙酸、甲酸、磷酸等）存在才可使分离有效地进行和获得高的质量回收率；分离须在酸性介质中进行（一般pH在2~3之间），又有一些蛋白质会在后两种条件下产生不可逆的分子构象变化，故在生物大分子中人分离纯化中受到限制，但分子构象变化可逆的蛋白质而言是有效的方法。正相色谱在生物大分子中的分离和纯化中应用相对较少，因所用的溶剂很贵。11．可逆性缔合

在某些溶液条件下，有一些酶能聚合成二聚体、四聚体等，而在另一种条件下则形成单体，如相继在这两种不同的条件下按大小就可以进行分级分离。12．稳定性

12．1热稳定性

大多数蛋白质加热到95℃时会解折叠或沉淀，利用这一性质，可容易地将一种经这样加热后仍保持其可溶性活性的蛋白质从大部分其它细胞蛋白质中分离开。

12．2蛋白酶解稳定性

用蛋白酶处理上清液，消化杂蛋白，留下抗蛋白酶解抗性蛋白质。

13．分配系数

即利用双水相萃取分离，常用的生物物质分离体系有：聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（DEXTRAN）、PEG/磷酸盐、PEG/硫酸铵等。由于具有含水比例高、选用的聚合物及盐对酶无毒性、分离设备与化学工业通用等优点，在工业上目益受重视。

分配行为受聚合物分子大小、成相浓度、PH、无机盐种类等因素影响，

发展：具有亲和双水相萃取及膜分离双水相萃取等新型双水相分离技术。

双向水溶液系统的蛋白质纯化

一些与水混合多聚物的不相溶性导致依赖于多聚物浓度的两相系统的液-液分配技术，可以由两不同的高水溶性的多聚物或一种多聚物各一种盐，用于从微生物匀浆中除支细胞碎片、后续分配步骤进一步纯化。分离的选择性一般随着分离分子或颗粒大小面增加。

14．表面活性

14．1泡沫分离

蛋白质溶液具有表面活性，气体在溶液中鼓泡，气泡与液相主体分离，在塔顶富集，达到分离和浓缩的目的。

14．2反胶团相转移法

反胶团相转移法是80年代兴起的一种新型分离技术，它利用表面活性剂分子在有机溶剂中自发形成的反向胶团（反胶团），在一定条件下将水溶性蛋白质分子增溶进反胶团的极性核（水池）中，再创造条件将蛋白质抽提至另一水相，实现

蛋白质的相转移，达到分离和提纯蛋白质的目的。反胶团中的蛋白质分子受到周围水分子和表面活性剂极性头的保护，仍保持一定的活性，甚至表现出超活性。由于蛋白质增溶于反胶团与蛋白质所带电荷及反胶团内表面电荷间的静电作用及反胶团的大小有关，因而表面活性剂的种类、水溶液的pH值及离子强度等因素均影响反胶团对蛋白质的相转移。据报道利用AOT／异辛烷反胶团对酵母脂肪酶进行相转移。

14．3聚合物-盐-水液-固苯取体系是90年代在国内开发的种新的萃取体系，成功地用于萃取金属离子及卞果酸脱氢酶等生物活性物质较强的吸附及乳化作用等缺陷，成相容易成相后直接倾出液相即可使液固的相分离，勿需特殊技术处理，不用有机溶剂，无毒性，成相聚合物及盐对生物活性物质有稳定和保护作用，萃取分离选择性好消耗低、易于规模放大的分离生队物活件物质的新技术在聚乙二醇修饰物的聚乙二醇／葡聚糖双水相萃取体系共价作用：主要用于含巯基酶的纯化，通过共价键结合在层析介质上，偶联是可逆的，能还原二硫键的低分子化合物洗脱，如空间位阻，可在含变性剂的缓冲液时吸附，如已含二硫键，则先用还原剂打开。

（一）双缩脲测定法

1．原理蛋白质中的肽键有双缩脲反应，在碱性溶液中与二价铜离子形成蓝紫色的络合物，在一定的范围内，颜色的深浅与蛋白质的含量成正比。此法特异性强，游离的氨基酸、小肽和核酸均不产生这种反应，但此法不够敏感，仅能测出毫克水平。

2．试剂配制

硫酸铜（CuSO4?5H2O）1.50g

酒石酸钾钠5.00g

H2O 500.0ml

10％氢氧化钠（不含硫酸钠）300ml

H2O 加至1 000ml

此溶液可长期保存，如产生暗红色沉淀，则应废弃重配。

3．标准曲线的制备

⑴准确称取牛血清白蛋白1.0g（必要时须首先采用凯氏定氮法测定牛血清白蛋白制品中实际纯蛋白含量，然后换算），以生理盐水配成1％的浓度。

⑶混匀后于室温放置0.5h～1h，光电比色（540nm），顺序由低浓度至高浓度，每管测3次，求其平均值。

⑷以OD值为纵坐标，蛋白含量为横坐标绘制标准曲线。

4．样品测定

⑴取样品0.1ml，加生理盐水1.4ml。也可将样品做1﹕10稀释加1ml，再加生理盐水0.5ml。

⑵加双缩脲试剂4.0ml，混匀，至室温0.5h～1h。

⑶另以1.5ml生理盐水加4.0ml双缩脲试剂作为空白对照。

⑷测OD540值。

⑸根据OD值从标准曲线上查出蛋白含量。

注意：各种双缩脲试剂的配法、加量及室温静置时间均有差异，一旦标准曲线制定后，样品的测定则必须与标准曲线制定的条件一致，否则结果有差异。（二）紫外光谱吸收法

1．原理本法根据蛋白之中的芳香族氨基酸－色氨酸、酪氨酸在紫外光区的吸收特点而建立的。蛋白质在280nm波长附近有一吸收峰，其吸收程度与这些氨基酸的含量成正比。此法灵敏度高，可测到微克水平，操作简单，不需要加各种试剂，测完后，样品可回收。

2．标准曲线的制备

⑴用精密天平称取牛血清白蛋白50mg，溶于50ml生理盐水中。

⑵以生理盐水再稀释成每ml含0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg……0.9mg，以盐水对照。

⑶测各管OD280值。

⑷以OD280值为纵坐标，蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。

3．样品测定

将待测样品以盐水适当稀释，在0.10mg/ml~1.00mg/ml之间，以生理盐水为对照，测OD280值，从标准曲线上查出蛋白含量。

（三）Folin酚法

1．原理蛋白质中的酪氨酸与色氨酸和Folin酚试剂中的磷钨酸、磷钼酸作用后，在碱性条件下不稳定，被还原成蓝色的化合物（钼蓝）。因此通过比色即可测知标本中的蛋白含量。该法的优点是操作简单、灵敏度高，且不受溶液中脂多糖的干扰。

2．试剂

试剂甲：

A液：Na2CO3 10.00g

NaOH 2.00g

酒石酸钾钠（或钾盐钠盐）0.25g

混合、溶于500ml蒸馏水中。

B液：CuSO4?5H2O 0.5g

H2O 100.00ml

用前将A液50份与B液1份混合即为试剂甲。

试剂乙：

于磨口回流瓶加入下列试剂

Na2WO4?2H2O 100.00g

NaMoO4?2H2O 25.00g

H2O 700.00ml

85％H3PO4 50.00ml

浓HCl 100.00ml

按上回流冷凝管以小火回流10h后再加：

硫酸锂150.00g

H2O 50.00ml

溴水数滴

开口继续沸腾15min，驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色微带绿色（如仍呈绿色，须重复滴加液体溴步骤）。稀释至1L，过滤，滤液置于棕色瓶保存。使用时用标准NaOH液滴定，以酚酞为指示剂，然后适当稀释（加水约1倍）使最终浓度为1mol/L。

3．标准曲线的制备

⑴取标准牛血清白蛋白2.50mg，溶于10ml蒸馏水中，使成250μg/ml。

蛋白质提取及纯化

蛋白质提取及纯化提取蛋白质的当天早晨去后把高速离心机和超高速离心机都打开冷却 1、前一天晚上用Resuspension Buffer重悬4L菌体，然后离心于4C保存，第二天使用。 2、用少量预冷的Resuspension Buffer重悬细菌，1 protease inhibitor tablets(EDTA Free)，1mM PMSF, 然后用玻璃Homogenizer做均一化处理，将总体积调至80ml； 3、High Pressure Homogenizer破壁，特别注意样品一定要在不加压力的情况下运行一个循环（2min）；然后1200bar，6min三个循环，整个过程冰水冷却； 4、DNaseI处理：加入2.5mg DNaseI，10mM MgCl2, 室温处理30min； 5、 11.000rpm，4℃，15min; then 11.000rpm，4℃，15min； 6、 1mM PMSF, 45.000rpm，4℃，90min; 7、用Resuspension Buffer洗两次以除去可溶性的蛋白质，然后预热分光光度计； 8、用3-4ml Binding Buffer重悬Membrane pellets，动作一定要轻缓，重悬后的总体积不超过8ml，取出300ul测定OD800和OD850(以OD850为准),测定时候是逐步稀释，每次吸光值小于1； 9、调整OD850≤30-50，在缓慢搅拌（速度一定要慢）的情况下逐滴加入30%的 LDAO使其终浓度达到0.5%，1mM PMSF，26℃黑暗条件下重悬1h，期间注意观察颜色变化； 10、45.000rpm, 4℃, 30min，注意观察颜色的变化以及沉淀是否发生明显的变化。 Charge and Equilibrate Resin (1)用蒸馏水冲洗柱子以除去20%酒精，注意不要用buffer，1ml/min，至紫外吸收和电导稳定； (2)用0.1M NiSO4 Charge Resin，1ml/min，10倍柱体积，尽量使得紫外吸收和电导稳定； (3)用蒸馏水冲洗，1ml/min，至紫外吸收和电导稳定；

蛋白质分离纯化的步骤

蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1. 机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。（二）蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100 等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。（三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1.等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2.盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。 3.有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。（四）样品的进一步分离纯化

蛋白质的分离纯化--有机溶剂分离纯化法

蛋白质的分离纯化--有机溶剂分离纯化法文章出处：朱敏蛋白质的分离纯化--有机溶剂分离纯化法有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度降低。有机溶剂与水作用能破坏蛋白质的水化膜，使蛋白质在一定浓度的有机溶剂中沉淀析出。常用的有机溶剂是乙醇和丙酮，由于有机溶剂的加入易引起变性失活，尤其乙醇和水混合释放热量，操作一般宜在低温下进行，且在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以免局部浓度过大。用此法所析出的沉淀一般比盐析法易过滤或离心沉降。分离后的蛋白质沉淀应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂的浓度。操作时的pH值大多数控制在待沉淀蛋白质等电点附近。有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度，减少变性和提高分离的效果。一般在有机溶剂沉淀时添加中性盐的浓度在0.05mol左右,过多不仅耗费有机溶剂,而且可能导致沉淀不好.沉淀的条件一经确定,就必须严格控制,才能得到重复性结果.有机溶剂浓度通常以有机溶剂和水容积比或用百分浓度素示.故操作条件比盐析法严格。许多有机溶剂，如碳链较长的醇，它溶于水，但有限度。其量大到一定程度后则分成两相，一相以水为主，一相以有机溶剂为主。某些第3组分的存在可以改变两相的比例和组成。有许多蛋白质在两相中均能溶解，形成分配。在同一个两相的溶剂系统中，不同的蛋白质有不同的分配系数。根据这一原理，操作全部机械化的有逆流分溶。因要求实验室温度恒定且操作也繁杂，虽一直有人在用但很不普遍。分配层析也是应用这一原理，但在分离纯化蛋白质工作中用得不多，主要是因为多数蛋白质在有机溶剂中，特别是在易与水分相的溶剂中溶解度小且易变性。疏水层析是近年发展的新方法。它利用蛋白质表面有一部分疏水性，与带有疏水性的载体在高盐浓度时结合。洗脱时将盐浓度逐渐降低，蛋白质因疏水性不同而逐个地先后被洗脱而纯化。此法能分离其它一些方法不易纯化的蛋白质。利用分子形状和大小不同的分离方法蛋白质形状有细长的如纤维，有密实的如圆球，形状很不相同。蛋白质的分子量从6000左右开始，有各种大小，大的可以大到几百万。利用这些差别，有几种方法可用来分离蛋白质。凝胶层析属最常用的蛋白质分离方法。系混合物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时，混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。所指凝胶从广义上说是一类具有三维空间多孔网状结构的物质，如天然物质中的马铃薯淀粉及琼脂糖凝胶，人工合成品的葡聚糖凝胶及带离子交换基团的葡聚糖凝胶等。把适当的凝胶颗粒装填到玻璃管中制成层析柱，于柱内加入欲分离的混合物，然后用大量蒸镏水或其它稀溶液洗柱，由于混合物中各物质的分子大小和形状不同，在洗柱过程中，分子量最大的物质不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外。分子量最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，流速缓慢，致使最后流出柱外。整个过程和过滤相似，故又名凝胶过滤、凝胶渗透过滤、分子筛过滤等。由于物质在分离过程中的阻滞减速现象，有人也称之为阻滞扩散层析、排阻层析等。

蛋白质提取与制备的原理和方法

蛋白质提取与制备的原理和方法蛋白质提取与制备蛋白质种类很多，性质上的差异很大，既或是同类蛋白质，因选用材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质和酶。蛋白质与酶在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用。将细胞内蛋白质提取出来。并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些可溶性的形式存在于体液（如血浆、消化硫等）中，可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。这些蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。水适用于白蛋白类蛋白质的抽提。如果抽提物的pH用适当缓冲液控制时，共稳定性及溶解度均能增加。如球蛋白类能溶于稀盐溶液中，脂蛋白可用稀的去垢剂溶液如十二烷基硫酸钠、洋地黄皂苷（Digitonin）溶液或有机溶剂来抽提。其它不溶于水的蛋白质通常用稀碱溶液抽提。蛋白质类别和溶解性质白蛋白和球蛋白: 溶于水及稀盐、稀酸、稀碱溶液，可被50%饱和度硫酸铵析出。真球蛋白: 一般在等电点时不溶于水，但加入少量的盐、酸、碱则可溶解。拟球蛋白: 溶于水，可为50%饱和度硫酸铵析出醇溶蛋白: 溶于70～80%乙醇中，不溶于水及无水乙醇壳蛋白: 在等电点不溶于水，也不溶于稀盐酸，易溶于稀酸、稀碱溶液精蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀组蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀硬蛋白质: 不溶于水、盐、稀酸及稀碱缀合蛋白(包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血红蛋白、金属蛋白、黄素蛋白和氮苯蛋白等) : 此类蛋白质溶解性质随蛋白质与非蛋白质结合部分的不同而异，除脂蛋白外，一般可溶于稀酸、稀碱及盐溶液中，脂蛋白如

蛋白质的提取与纯化

蛋白质的提取与纯化一，蛋白质的提取大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。（一）水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。 1、pH值蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。 2、盐浓度稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等

中性盐，一般以0.15摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。（二）有机溶剂提取法一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。二、蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化方法很多，主要有：（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法 1、蛋白质的盐析中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。

蛋白质的分离纯化和表征

蛋白质的分离纯化和表征第一节蛋白质的酸碱性质各个解离基团的pK 值与游离氨基酸的不完全相同。等电点要用等电聚焦等方法测定。第二节蛋白质分子的大小与形状

一、根据化学组成测定最低相对分子质量假定某种微量成分只有一个，测出其百分含量后，可用比例式算出最低相对分子质量。若测出两种微量成分的百分含量，分别用比例式算出的最低相对分子质量不相同时，可计算两个最低相对分子质量近似的最小公倍数。例题：一种纯酶含亮氨酸（Mr 131）1.65%，含异亮氨酸（Mr131）2.48%，求最低相对分子质量。解：按照Leu 的百分含量计算，最低Mr X1： X1=(100′ 131)/1.65=7939.4。按照Ile 的百分含量计算最低Mr X2： X2=(100′ 131)/2.48=5282.3。由于X1 和X2 数字差异较大，提示这种酶含Leu 和Ile 不止1 个，为了估算Leu 和Ile 的个数，首先计算： X1/X2=7939.4/5282.3≈1.5。这种酶含任何氨基酸的个数均应是整数，说明该酶至少含有2 个Leu，3 个Ile，其最低相对分子质量为： 7939.4 ′2 =15878.8或5282.3×3=15846.9。二、渗透压法测定相对分子质量三、沉降分析法测定相对分子质量

基本原理：（一）离心力(centrifugal force，Fc) 当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到离心力作用时，此离心力“Fc”由下式定义： F=m·a=m·ω2 r a—粒子旋转的加速度，m—沉降粒子的有效质量，ω—粒子旋转的角速度，r—粒子的旋转半径(cm)。（二）相对离心力(relative centrifugal force，RCF) 由于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同，离心力而受变化，因此在文献中常用“相对离心力”或“数字×g”表示离心力，只要RCF 值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果。 RCF 就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。

分离纯化蛋白质的方法及原理

（二）利用溶解度差别影响蛋白质溶解度的外部因素有：1、溶液的pH；2、离子强度；3、介电常数；4、温度。但在同一的特定外部条件下，不同蛋白质具有不同的溶解度。 1、等电点沉淀：原理：蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。因此在其他条件相同时，他的溶解度达到最低点。在等电点之上或者之下时，蛋白质分子携带同种符号的净电荷而互相排斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，因此溶解度较大。不同蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时的溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。当pH被调到蛋白质混合物中其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来，那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中。这样沉淀出来的蛋白质保持着天然的构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。 5、盐析与盐溶：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质与水分子之间的相互作用却加强，因而溶解度增高。球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出，这就是因为透析除去了盐类离子，使蛋白质分子之间的相互吸引增加，引起蛋白质分子的凝集并沉淀。当溶液的离子强度增加到一定程度时，蛋白质溶解程度开始下降。当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析。盐析作用主要是由于大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。此时那些被迫与蛋白质表面的疏水集团接触并掩盖他们的水分子成为下一步最自由的可利用的水分子，因此被移去以溶剂化盐离子，留下暴露出来的疏水基团。蛋白质疏水表面进一步暴露，由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀。盐析沉淀的蛋白质保持着他的天然构象，能再溶解。盐析的中性盐以硫酸铵为最佳，在水中的溶解度很高，而溶解度的温度系数较低。 3、有机溶剂分级分离法：与水互溶的有机溶剂（甲醇、乙醇和丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室温下有机溶剂会引起蛋白质变性，如果预先将有机溶剂冷却到-40°C以下，然后在不断搅拌下逐滴加入有机溶剂，以防局部浓度过高，那么变性可以得到很大程度缓解。蛋白质在有机溶剂中的溶解度也随温度、pH和离子强度而变化。在一定温度、pH和离子强度条件下，引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，因此控制有机溶剂浓度也可以分

蛋白质纯化

蛋白质纯化蛋白质的分离纯化在生物化学研究应用中使用广泛，是一项重要的操作技术。一个典型的真核细胞可以包含数以千计的不同蛋白质，一些含量十分丰富，一些仅含有几个拷贝。为了研究某一个蛋白质，必须首先将该蛋白质从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出来。蛋白纯化的一般原则蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。一般蛋白纯化采用的方法为树脂法。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开，由于此时样本体积大、成分杂，要求所用的树脂高容量、高流速、颗粒大、粒径分布宽．并可以迅速将蛋白与污染物分开，必要时可加入相应的保护剂（例如蛋白酶抑制剂），防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率，此阶段是要把目的蛋白与那些分子量大小及理化性质接近的蛋白区分开来，要用更小的树脂颗粒以提高分辨率，常用离子交换柱和疏水柱，应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。选择性指树脂与目的蛋白结合的特异性，柱效则是指各蛋白成分逐个从树脂上集中洗脱的能力，洗脱峰越窄，柱效越好。仅有好的选择性，洗脱峰太宽，蛋白照样不能有效分离。蛋白质纯化的一般注意事项在进行任何一种蛋白质纯化得时候，都要时刻注意维护它的稳定，保护它的活性，有一些通用的注意事项需要牢记，它们包括： 1.操作尽可能置于冰上或者在冷库内进行。 2.不要太稀，蛋白浓度维持在μg/mL～mg/mL。 3.合适的pH，除非是进行聚焦层析，所使用的缓冲溶液pH避免与pI相同，防止蛋白质的沉淀。 4.使用蛋白酶抑制剂，防止蛋白酶对目标蛋白的降解；在纯化细胞中的蛋白质时，加入DNA 酶，降解DNA，防止DNA对蛋白的污染。 5.避免样品反复冻融和剧烈搅动，以防蛋白质的变性。 6.缓冲溶液成分尽量模拟细胞内环境。 7.在缓冲溶液中加入0.1~1mmol/L DTT(或β-巯基乙醇），防止蛋白质的氧化。 8.加1~10mmol/L EDTA金属螯合剂，防止重金属对目标蛋白的破坏。 9.使用灭菌溶液，防止微生物生长。蛋白质纯化的一般程序分离纯化某一特定蛋白质的一般程序可以分为前处理、粗分级、细分级三步。 1.前处理：分离纯化某种蛋白质，首先要把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。为此，动物材料应先提出结缔组织和脂肪组织，种子材料应先去壳甚至去种皮以免手单宁等物质的污染，油料种子最好先用低沸点的有机溶剂如乙醚等脱脂。然后根据不同的情况，选择适当的方法，将组织和细胞破碎。动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆机破碎或用超声波处理破碎。植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般需要用石英砂或玻璃粉和适当的提取液一起研磨的方法或用纤维素酶处理也能达到目的。细菌细胞的破碎比较麻烦，因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一个借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。破碎细菌细胞壁的常用方法有超声波破碎，与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理等。组织和细胞破碎后，选择适当的

蛋白质提取与纯化技术总结

蛋白质提取与纯化技术选择材料及预处理以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、硷、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：（1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；（2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。蛋白质的分离纯化一，蛋白质（包括酶）的提取大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。（一）水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋

分离纯化蛋白质的方法及原理

分离纯化蛋白质的方法及原理（一）利用分子大小 1、透析：原理：利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。方法：将待提纯蛋白质放在透析袋中放在蒸馏水中进行涉及的问题：如何加快透析过程（1）加大浓度差，及时更换透析液（2）利用磁力搅拌器常用的半透膜：玻璃纸、火棉和其他材料合成 2、超过滤：原理：利用压力和离心力，强行使其他小分子和水通过半透膜，而蛋白质留在膜上 3、凝胶过滤层析：原理：当不同分子大小的蛋白质混合物流进凝胶层析柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构，排阻在凝胶珠以外，在凝胶珠缝隙间隙中向下移动。而比孔小的分子不同程度地进入凝胶珠内，这样由于不同大小分子所经历的路径不同而到分离。结果：大分子先被洗脱下来，小分子后被洗脱下来（二）利用溶解度差别 4、等电点沉淀：原理：不同蛋白质具有不同的等电点，当蛋白质混合物调到其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来.。 5、盐析与盐溶：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.当离子强度增加，足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析

（三）根据电荷不同 6、SDS-PAGE 全称十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也解离为单亚基，处理后的样品中肽链是处于无二硫键连接的，分离的状态。电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而主要取决于蛋白质分子量。所以SDS-PAGE常用来分析蛋白质的纯度和大致测定蛋白质的分子量。 7、离子交换层析：原理：氨基酸分离常用阳离子交换树脂，树脂被处理成钠型，将混合氨基酸上柱，氨基酸主要以阳离子形式存在，在树脂上与钠离子发生交换，而被挂在树脂上。氨基酸在树脂上结合的牢固程度取决于氨基酸与树脂之间的亲和力，决定亲和力的因素有：（1）主要是静电吸引力（2）氨基酸侧链同树脂之间的疏水作用氨基酸与阳离子交换树脂间的静电引力大小次序依次是：碱性氨基酸R2+>中性氨基酸R+>酸性氨基酸R0。因此洗脱顺序应该是：酸性氨基酸中性氨基酸碱性氨基酸为使氨基酸从树脂上洗脱下来采用逐步提高pH和盐浓度的方法

蛋白质提取、纯化、鉴定的方法(一)

蛋白質提取、純化、鑒定の方法（一）一、硫酸銨沉澱硫酸銨是用於沉澱蛋白質の最常用の鹽。低濃度硫酸銨使蛋白質の溶解度增大，即所謂の鹽溶(salting in)，但當硫酸銨濃度增加到一定濃度後，蛋白質の溶解度開始減小，即所謂の鹽析(salting out)。當硫酸銨達到一定濃度時，蛋白質析出。不同蛋白質の鹽析濃度有差異，瞭解目の蛋白質析出所需の硫酸銨濃度，就可部分純化這種蛋白質。注意，目の蛋白質の濃度與鹽析濃度有一定の關係，如1mg／ml與0.01mg／mlの蛋白質濃度所需の鹽析濃度是不一樣の，低濃度の蛋白質鹽析需要較高濃度の硫酸銨。硫酸銨沉澱不僅可去除一些雜蛋白，還可去除其他の雜質如脂質等各種小分子。二、三相分配技術舉一個例子來說明該技術の原理：提取E.coli中の綠色螢光蛋白，E.coli 與適當濃度の硫酸銨混勻，加入等體積の叔丁醇，振盪混勻，低速離心，分成三相。上層為有機相，含有細菌の膜脂和脂溶性物質如色素；中層，含有綠色螢光蛋白；下層為相，含有完整細胞壁のE.coli、核酸和大量の蛋白質等。這個技術の原理是，適當濃度の硫酸銨可沉澱大量の蛋白質但不沉澱綠色螢光蛋白；叔丁醇可溶解細菌の細胞膜，因此可釋放綠色螢光蛋白；同時叔丁醇是種有機溶劑，可使蛋白質和核酸等大分子變性，使其在原位沉澱，仍留在細菌の細胞壁內。該方法の優點是操作簡便，省去了消化細胞壁和去除核酸及大多數雜蛋白等煩瑣步驟。但該方法只適用於那些能夠耐受有機溶劑の蛋白質。這樣の技術得到の是部分純化の蛋白質。三、層析技術 1.離子交換層析這一技術是根據不同の蛋白質有不同の等電點，其吸附在離子交換劑上の強弱有分別，來對蛋白質進行分離。離子交換劑可分為兩種，陽離子交換劑(如羧甲纖維素)和陰離子交換劑(如DEAE-纖維素)。在某一pH值條件下，當陽(陰)離子交換劑帶有負(正)電荷而蛋白質帶有正(負)電荷時，蛋白質就可吸附在陽(陰)離子交換劑上。各種蛋白質の等電點可能不同，因此其吸附在離子交換劑上の強度不同，用不同離子強度の洗脫液可將pI不同の蛋白質洗脫。要注意の是pI相近の蛋白質很多，因此用此方法提取の目の蛋白質不一定是純の。在使用離子交換劑時，必須知道離子交換劑のpKa值，如羧甲基のpKa值是

蛋白质的分离纯化方法

蛋白质的分离纯化方法 2.1根据分子大小不同进行分离纯化蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同

分离纯化蛋白质的方法及原理

分离纯化蛋白质的方法及原理 This manuscript was revised on November 28, 2020

蛋白质分离纯化步骤

一、蛋白质分离纯化的一般原则大多数蛋白质在组织细胞中都是和核酸等生物分子结合在一起，而且每种类型的细胞都含有成千上万种不同的蛋白质。许多蛋白质在结构、性质上有许多相似之处，所以蛋白质的分离提纯是一项复杂的工作。到目前为止，还没有一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来。但是对于任何一种蛋白质都有可能选择一种较合适的分离纯化程序以获得高纯度的制品。且分离的关键步骤、基本手段还是共同的。蛋白质提纯的目的是增加产品的纯度和产量，同时又要保持和提高产品的生物活性。因此，要分离纯化某一种蛋白质，首先应选择一种含目的蛋白质较丰富的材料。其次，应设法避免蛋白质变性，以制备有活性的蛋白质。对于大多数蛋白质来说，纯化操作都是在0～4℃的低温下进行的。同时也应避免过酸、过碱的条件以及剧烈的搅拌和振荡。另外，还要设法除去变性的蛋白质和其它杂蛋白，从而达到增加纯度和提高产量的目的。二、分离纯化蛋白质的一般程序分离纯化蛋白质的一般程序可分为以下几个步骤：（一）材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1. 机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 (二) 蛋白质的抽提

1-大肠杆菌重组蛋白表达提取及纯化实验

第一天 1、配置LB培养基：酵母粉15g、胰蛋白胨30g、氯化钠30g，定容至3000ml。调节PH至7.4（2M NaOH），高压蒸汽灭菌20分钟，37℃保存。分装成15瓶（每瓶200ml）。 2、接种（超净台要提前杀菌通风）取4瓶上述培养基，每瓶加200μlAMP（1:1000）、60μl菌液。37℃过夜。第二天 1、扩大培养（超净台） 4瓶扩至16瓶，每瓶培养基加200μlAMP，摇床培养1小时左右。 2、诱导（超净台）加40μlIPTG，加完去封口的除牛皮纸，扎口较松。25℃摇床培养4小时。 3、离心获取菌体 4℃，8000rpm离心25分钟。注意配平。 4、超声波破碎菌体离心后去上清，向沉淀加入（600mlPB裂解液、300μl溶菌酶、3mlPMSF）。将菌液转入2个烧杯中，冰浴超声波破菌，400W，75次，每次6秒，间隔2秒。离心收集上清液。 600mlPB裂解液：20mM/L PB，10mM/L EDTA，5%甘油，1mM/L DTT，调节PH至7.4。

超声波破碎：首先用去离子水清洗探头，再将盛有菌液的小烧杯置于有冰水混合物的大烧杯中，冰水界面略高于菌液面即可。探头浸没于菌液中，不可伸入过长。注意破菌过程中由于冰的融化导致的液面变化。 5、抽滤（双层滤纸) 洗胶（GST）。将上述上清液抽滤，滤液与GST胶混合，磁力搅拌过夜。第三天 1、抽滤蛋白-胶混合液，滤液取样20μl，留电泳。 2、洗杂蛋白，用1×PBS+PMSF(1000:1)约400ml，洗脱若干次，用移液枪吸去上层泡沫（杂蛋白），至胶上无泡沫为止。 3、洗脱目的蛋白，洗脱液加50ml，分3次进行（15+15+15），每次加入后间歇搅拌，自然静置洗脱15分钟，抽滤，勿使胶干，合并洗脱液，取样20μl，留电泳。用洗脱液调零，测OD280。（OD值达到1.5为佳） 4、将洗脱液置于透析袋中（透析袋应提前煮好），将透析袋置于2000ml透析液，加入磁珠置于4℃冰箱内磁力搅拌器上，4小时后换液。胶的回收：用氯化钠溶液、1×PBS（无沉淀）洗涤，20%乙醇洗脱，装瓶。洗脱液：50mM/LTRIS-HCL 、10mM/LGSH 透析液：20mM/L TRIS-HCL、1mM/L EDTA 、0.15mM/L DTT

蛋白纯化的基本思路

蛋白质的提取和纯化--选择分离材料及预处理蛋白质的提取和纯化--选择分离材料及预处理以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、硷、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：（1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代产物和胞外酶等；（2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞酶等。植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。细胞的破碎 1、高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物脏组织、植物肉质种子等。 2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。 3、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。 4、反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 5、化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。

生物化学研究进展论文蛋白质提纯

生物化学研究进展论文蛋白质提纯文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-

生物化学研究进展作业题目蛋白质的提取、纯化姓名学号班级专业

题目：蛋白质的提取、纯化姓名：专业：摘要：本文综述了蛋白质的提取原理及方法，蛋白质纯化的意义、基本原则及方法，蛋白质纯化的前景展望。关键词：提取原理提取方法水溶液有机溶剂双水相萃纯化意义基本原则方法溶解度带电性质电荷数配体特异性前景正文： 1 蛋白质样品的提取 1．1蛋白质样品的提取原理提取蛋白质的基本原理主要有两方面：一是利用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离目的，如电泳、超速离心、超滤等。 1．2 蛋白质样品的提取方法 1．2．1 水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液是提取蛋白质最常用的溶剂。通常用量是原材料体积的1—5倍，提取时需要均匀地搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成分性质而定，一般在低温(5℃以下)下操作。另外，蛋白质和酶是两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH值范围内。一般来说，在避免极端pH值的前提下，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液提取。此

外，稀浓度可促进蛋白质盐溶，并且盐离子与蛋白质部分结合，能够保护蛋白质不易变性。因此可在提取液中加少量NaC1等中性盐，一般以0．15 mol／L浓度为宜。 1．2．2 有机溶剂提取法一些和脂质结合牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶都不溶于水、稀盐溶液、稀酸或碱，可溶于乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，具有一定的亲水性和较强的亲脂性，并且不会残留在产品中，容易蒸发除去，密度低，与沉淀物质的密度差大，便于离心分离。但不足的是用有机溶剂来提取蛋白质比用盐析法更容易引起蛋白质变性。 1．2．3 双水相萃取法双水相萃取法是依据物质在两相间的选择性分配，当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用、各种力(疏水键、氢键和离子键等)的存在和环境因素的影响，使其在上、下相中的浓度不同，进而分离目的蛋白。此方法可在室温下进行，双水相中的聚合物还可以提高蛋白质的稳定性，收率较高。对于细胞内的蛋白质，需要先对细胞进行有效破碎。目的蛋白常分布在上相并得到浓缩，细胞碎片等固体物分布在下相中。采用双水相系统浓缩目的蛋白，会受聚合物分子质量及浓度、溶液pH值、离子强度、盐类型及浓度的影响。 2 蛋白质的纯化 2.1 蛋白质纯化的意义随着分子生物学、结构生物学、基因组学等研究的不断深入，人们意识到仅仅依靠基因组的序列分析来试图阐明生命活动的现象和本质是远远不够的。只有从蛋白质组学的角度对所有蛋白质的总和进行研究，才能更科学的掌握生命现象和活动规律，更完善的揭示生命本质。研究蛋白质首要的步骤是将目的蛋白从复杂的大分子混合物中分离纯化出来，

蛋白质分离纯化步骤

力不均而使细胞破碎。 5. 酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。(二) 蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。 (三）蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法： 1. 等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 2. 盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度

蛋白质的提取、分离纯化及定量

实验一氨基酸的分离鉴定——纸层析法实验目的 1.学习氨基酸纸层析的基本原理。 2.掌握氨基酸纸层析的操作技术。实验原理纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。层析溶剂由有机溶剂和水组成，滤纸和水的亲和力强，与有机溶剂的亲和和弱，因此在展层时，水是固定相，有机溶剂是流动相。将样品点在滤纸上（原点），进行展层，样品中的各种AA在两相溶剂中不断进行分配，由于它们的分配系数不同，不同AA随流动相移动速率就不同，于是将这些AA分离开来，形成距原点距离不等的层析点。溶质在滤纸上的移动速率用比移（rate of flow ,R f）来表示 R f= 原点到层析点中心的距离（X）/原点到溶剂前沿的距离(Y) 只要条件（如温度、展层剂的组成）不变，某种物质的R f值是常数。可根据R f作为定性依据。R f值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。样品中如有多种AA，其中有些AA的R f值相同或相近，此时只用一种溶剂展层，就不能将它们分开，为此，当用一种溶剂展层后，将滤纸转90度再用另一种溶剂展层，从而达到分离的目的，这种方法叫双向层析。仪器、试剂 1、扩展剂：是水饱和的正丁醇和醋酸以体积比4：1进行混合得混合液。将20 ml正丁醇和5 ml冰醋酸放入分液漏斗中，与15 ml水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层，漏斗内即为扩展剂。取漏斗内的扩展剂约5 ml置于小烧杯中做平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。 2、氨基酸溶液 ⑴.已知单一氨基酸：5%赖氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、 ⑵.混合氨基酸：各5 ml混合。 3、显色剂：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液。 4、层析缸、滤纸（14*17）、喷雾器、电吹风实验步骤 1.放置平衡溶剂：用量筒量取约5 ml平衡溶剂，放入培养皿中，然后置于密闭的层析缸中。 2.准备滤纸：取层析滤纸（长17㎝、宽14㎝）一张。在纸的一端距边缘2㎝处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔1.5㎝作一记号——点样线。 3.点样：用毛细管将各氨基酸样品分别点在这8个位置上，干后再点一次。每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm。 4.扩展：用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将盛有约20ml扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中（点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线1㎝）。待溶剂上升12㎝时即取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。 5.显色：用喷雾器均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5分钟（100℃）或用热风吹干即可显出各层析斑点。 6.计算：计算各种氨基酸的比移（Rf）值。精讲点播