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生物科学论文

三种甘蓝雄性不育类型花粉发育的细胞学观察

院系生命科学学院专业生物科学

中文摘要

本实验利用光学显微和电子显微镜在细胞水平和亚细胞水平对三种我国研究和利用较多的甘蓝雄性不育类型进行了较为系统全面的雄性败育特征和时期分析。实验结果表明，隐性核不育类型主要败育时期为减数分裂期，主要败育特征为花粉母细胞期绒毡层细胞和中层细胞异常且异常特征在不同植株上表现不一致，四分孢子正常释放后不能形成正常花粉壁，并迅速败育; 萝卜胞质不育类型萝卜胞质不育主要败育时期在四分体前期，败育特征主要表现为从减数分裂后期开始绒毡层细胞活动异常,绒毡层细胞进行性加厚，其大部分四分孢子能自由释放但受绒毡层细胞挤压败育，其小孢子外壁孢粉素沉积延迟，但最终能发育出较为完全的花粉外壁；显性核不育主要败育时期在四分体后期，主要败育特征是小孢子不能自由释放，但花粉壁能正常沉积孢粉素，包裹在四分体外的胼胝质降解延迟，而花粉母细胞壁直到花粉成熟仍不能降解。

关键字：甘蓝(Brassica oleracea)，雄性不育，细胞学观察，小孢子发育

Abstract

The microsporogenesis of three kinds of male sterility in Brassica oleracea Var. capitata were investigated by using light microscope(LM) and transmission electron microscope(TEM). Study here suggested that the first sign of significant phenotype of Ms-cr1was abnormally developed tapetum and middle layer cells at the stage of meiosis. Free microspores did not form exine and degenerate soon after releasing from tetrads. In the Ogu CMS, the microspore disruption was closely correlated with occurrence of tapetal abnormal. After the completion of meiosis, the tapetum cells showed an abnormal increase in size and the released microspore with normal exine were squashed and degenerated soon.The development of microspores in Ms-cd1 was comparable to fertile plants up to the time of tetrad formation. After the completion of tetrads stage, the separation of microspores from each tetrad in the mutant was arrested .The microspores with developing bacula and tectum in Ms-cd1still adhered together. The callosic wall of the mutant around the microspores degenerated much slower than that of wild type. The pollen mother cell wall surrounding the developing microspores in Ms-cd1remained un-degenerated till very late pollen stage.

Key words:cabbage(Brassica oleracea)，male sterility，cytological observation，microsporogenesis

目录

0引言 (1)

1 材料与方法 (1)

1.1 实验材料 (1)

1.2 实验方法 (2)

1.2.1光学半薄切片制备和观察 (2)

1.2.2透射电镜样品制备和观察 (3)

2 结果与分析 (3)

2.1 可育花药及小孢子发育 (3)

2.2 隐性核不育花药及小孢子发育过程 (4)

2.3 萝卜胞质不育花药及小孢子发育过程 (4)

2.4 显性核不育花药及小孢子发育过程 (5)

3 讨论 (6)

3.1 三种雄性不育类型花药发育的主要败育特征比较 (6)

3.2 药壁组织与小孢子的协调作用 (6)

4 小结 (7)

附录（一） (7)

图1 正常可育花药发育过程光学显微观察 (8)

图2 正常可育花药发育电镜观察 (9)

图3 隐性不育花药发育过程光学显微观察.................... 错误！未定义书签。

图4 隐性不育花药发育电镜观察.................................... 错误！未定义书签。

图5 Ogu萝卜胞质不育花药发育过程光学显微观察..... 错误！未定义书签。

图6 Ogu萝卜胞质不育花药发育电镜观察..................... 错误！未定义书签。

图7 显性不育花药发育过程光学显微观察.................... 错误！未定义书签。

图8 显性不育花药发育电镜观察.................................... 错误！未定义书签。

图9 甘蓝可育花药的发育过程........................................ 错误！未定义书签。附录（二） ................................................................................ 错误！未定义书签。参考文献 .. (10)

致谢 (12)

0引言

甘蓝是世界上普遍种植的一种芸苔属蔬菜作物，具有很强的杂种优势。植物雄性不育是杂种优势利用的基础，现在利用雄性不育进行杂交制种已成为许多作物育种的主要方向和目标，并在生产上取得了很大地成功，世界各国已广泛应用雄性不育系进行F1杂交新品种的选育，如我国杂交水稻种植面积占水稻总面积的46%-55%，其产量较常规品种增产20%-30%。阐明植物雄性不育形成的分子机理，不仅是花粉发育分子生物学的一个重要课题，也是人工控制植物育性的基础。确定育性基因在花药发育过程中的表达时期将为阐明植物育性机制和创造新型雄性不育材料提供重要依据，大量的研究工作者在力图搞清植物花粉发育的分子模式,以便更好地研究和控制植物的生殖规律。目前国内研究较多的甘蓝雄性不育类型有四种，分别是黑芥胞质NiCMS, 隐性不育MS-cr1,萝卜胞质不育Ogu CMS, 显性不育MS-cd1。研究不同甘蓝雄性不育的花药发育特征不仅可为促进四种不育类型材料在遗传育种上的应用提供参考，同时也可为准确地确定甘蓝小孢子正常发育过程中不同时期育性相关基因的表达，阐明甘蓝雄性不育形成机制提供理论依据。中国农科院蔬菜花卉研究所最早对甘蓝的四种不同雄性不育性状的花药发育进行了细胞学初步研究。卞春松通过石腊切片光学显微观察【4】，初步证实不同甘蓝雄性不育具有不同细胞学发育过程的终止点。刘玉梅对显性不育材料通过电子显微镜观察证实其败育高峰在花粉母细胞至小孢子单核期【6】，主要特征是四分小孢子不能分开。但在超微结构上对其它雄性不育类型进一步探讨败育机理的分析尚未见报道。本研究通过树脂超薄切片光学观察和电子显微镜观察结合，对其中的三种（隐性不育MS-cr1,萝卜胞质不育Ogu CMS,显性不育MS-cd1）雄性不育类型花药败育特征在细胞水平和亚细胞水平进行深入细致的研究，阐明甘蓝雄性不育的花药败育分子机理提供形态学证据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

以中国农业科学院蔬菜花卉研究所甘蓝课题组经多代回交获得的三种甘蓝雄性不育类型及作为对照的对应的可育回交亲本共4种材料为试材（见表2.1），2005年春天植株开花后取每一个株系的完整花序，根据可育花蕾大小与花药发育时期的相关性，按照花蕾的着生顺序，从下往上(花蕾由大到小)进行分级，将

4种材料的不同发育时期的花药剥离出来并迅速沉入2.5%戊二醛（配方见附录二）中，室温下固定8小时。

表2.1 三种甘蓝雄性不育材料的来源

试材代号雄性不育类型雄性不育来源对应可育材料代号376 隐性不育Ms-cr183121ms 530

592 萝卜胞质不育Ogu CMS CMSR3 530

680 显性不育Ms-cd179－399 530

1.2 实验方法

1.2.1光学半薄切片制备和观察

1.2.1.1清洗

固定后的材料在室温下用PH=7.0、浓度为0.2M磷酸缓冲液(PBS)（配方见附录二）清洗3—4次，每次约2小时。

1.2.1.2脱水

清洗后进行脱水，本试验先采用酒精，一般浓度依次为30%-50%-70%-80%-90%-95%-100%在4℃冰箱中进行，每次15分钟，再一次100%的酒精脱水室温20分钟。接下来纯丙酮脱水三次，每次15分钟，室温进行。

1.2.1.3渗透

实验中用国产环氧树脂618（配方见附录二）作为包埋剂,配方见附录。脱水完毕后，用包埋剂：丙酮以2：1的比例配制混合浸透液，在35℃的温箱中浸透2小时。之后用纯包埋剂在35℃的温箱中浸透过夜。

1.2.1.4包埋与聚合

将渗透过夜的材料转入包埋模具，加上新的包埋剂，起始温度为40℃，终了温度大约为60℃，大约每12小时调高3－4℃，使其逐渐聚合。

1.2.1.5修块

包埋块的修整首先用单面刀粗修，然后再用双面刀细修。包埋块的顶面修成梯形或长方形，顶面的上下两边要平行，块的顶端修成金字塔形，金字塔的斜面应以45度坡面为宜。最后将样品露出，以便切片。

1.2.1.6切片及染色

包埋块在LEICA ULTRACUT R切片机上用玻璃刀切成半薄切片，切片的面积3 mm2左右，厚度大约3000nm左右，挑切片于滴有蒸馏水的载玻片上，在酒精灯上展片，直至水干，切片粘在载玻片上。在片子上滴上1℅的龙胆紫染料(或结晶紫)（配方见附录二），染四到五分钟，用蒸馏水将多余染液冲掉。将经过染

色的片子用清水清洗后，盖上盖玻片，用LEICA全自动显微镜镜检并选取清晰的雄蕊精细结构用Nikon Coolpix4200 (Japan)数码照相机照相。

1.2.2透射电镜样品制备和观察

1.2.2.1清洗

用2.5%戊二醛固定后的试验材料，用浓度为0.2M，PH=7.2的磷酸缓冲液(PBS)清洗，冲洗2小时，中间换4次缓冲液。

1.2.2.2脱水和置换

清洗后进行脱水，本试验是先采用酒精脱水,一般的浓度依次为30%-50%-70%-80%-90%-95%-100%在4℃冰箱中进行，每次15分钟，再一次纯酒精室温脱水20分钟。接下来纯丙酮脱水三次，每次15分钟，室温进行。

1.2.2.3渗透和聚合

实验中用国产环氧树脂618作为包埋剂，置换后的试材用包埋剂和丙酮混合浸透液(2：1)，在35℃温箱中浸透2小时后用纯包埋剂在35℃温箱中浸透过夜。渗透过夜的材料转入包埋模具，加上新的包埋剂，40℃加热聚合12小时后逐渐调高温度至硬化后调至60℃直至聚合（大约每12小时调高3－4℃）。

1.2.2.4切片及染色

包埋块在LKB8800III型超薄切片机上，用玻璃刀进行超薄切片，用铜网捞片后用醋酸铀和硝酸铅（配方见附录二）染色后，在日立H-7500透射电镜下进行观察照相。

2结果与分析

2.1 可育花药及小孢子发育

甘蓝可育花药的发育过程相对简单（图9），正常可育雄蕊原基上分化出花药原基，花药原基细胞不均衡分裂形成四裂瓣状，进一步发育形成花药的4个小孢子囊，药壁组织平周分裂形成外表皮、内表皮、中层和绒毡层四层细胞(图1A，2A)，造孢细胞进一步分化形成排列紧密的小孢子母细胞(图1B，2B), 每个小孢子母细胞减数分裂形成二分体，并进一步形成四分体(图1B，1C)。此时，中层已部分降解，到四分体期只剩下退化后的残迹(图2D)，但其它孢子体组织仍很正常，内部的绒毡层仍紧紧与花药壁相连，并作为分泌层(图1C，2D)。甘蓝的绒毡层细胞是双核或多核的，绒毡层细胞不仅为提供小孢子发育的营养【1】，而且分泌孢粉素前体，并聚合在小孢子的初生外壁上进而形成花粉外壁【2】，绒毡层细胞的另一个功能是分泌β-1,3-葡聚糖酶或胼胝质酶，从而将游离小孢子从包裹

在胼胝质中释放出来(图1D)【3】。单核小孢子时期，药壁外层和内层液泡膨大，绒毡层细胞降解，花粉外壁部分形成(图2H)。随后紧邻外表皮的内表皮细胞，细胞壁加厚，导致花药的机械开裂并释放花粉(图1F)。在花药开裂前，游离小孢子进行一次非对称分裂形成二核花粉，含有一个大的营养细胞和小的生殖细胞，生殖细胞再进行一次有丝分裂形成最终成熟的三核花粉(图1E)。

在电镜下观察其花药及小孢子发育过程的超微结构。在花粉母细胞时期，花药各组织已经分化完全，孢子囊和四层细胞清晰可辨(图2A)，花粉母细胞结构整齐、排列紧密、细胞核大、居中、核膜清楚、核仁大(图2B，2C)。四分体时期，中层细胞退化(图2D)，绒毡层细胞结构清晰，开始液泡化(图2E)，四分孢子核大、居中、核质、胞质稠密、线粒体丰富，外被一层厚厚的胼胝质(图2E，2F)。单核小孢子时期，药壁外层和内层细胞液泡化膨大，绒毡层细胞降解，花粉外壁部分形成(图2H，2I)。单核晚期形成中心大液泡将核挤向一边，小孢子壁继续增厚(图2K)，成熟花粉粒形成覆盖层，基粒棒，基底层(图2L)。

2.2 隐性核不育花药及小孢子发育过程

隐性核不育Ms-cr1表现为：四分体形成后迅速败育，绒毡层直至小孢子成熟时尚未解体(图3E)，部分花药绒毡层细胞在花粉母细胞期就脱离药壁(图3B2，3D2)，部分绒毡层细胞则未脱离药壁但其绒毡层细胞明显较厚(图3B1，3D1)。中层细胞退化也不一致，在绒毡层未脱离药壁的花药中，在小孢子释放期仍表现完好(图3D1)；而在绒毡层脱落的花药中，在花粉母细胞减数分裂时已经降解完全(图3B2)。表明在花粉母细胞时期，可能其Ms-cr1基因已经开始表达，但受其它基因或环境因素的作用造成其绒毡层不同的异常表型。其能形成正常的四分体(图3C)，四分孢子可正常分开(图3D1，3D2)，而内壁细胞在花药开裂前后部分结构破坏，分解成一层黑色残迹(图3E，3F)。

透射电镜结果表明花粉母细胞数量较少且排列不紧密，四层药壁细胞液泡化较为明显(图4A，4B，4C))，其中层细胞受挤压狭长(图4B)，四分体可以正常形成(图4E，4G)，但绒毡层细胞壁厚且径向伸长，较为肥大，可以形成双核或多核细胞(图4E，4F，4G)，其小孢子可以正常释放，但中层细胞此时仍未降解(图4H)，其小孢子能形成外壁内层，但没有沉积孢粉素，且形状不规则(图4I)。双核期至三核期，绒毡层迅速降解，花药外壁膨胀而内壁降解，败育花粉沉积在药壁上，败育花粉残迹无基粒棒(图4J,4K，4L)。

2.3 萝卜胞质不育花药及小孢子发育过程

萝卜胞质不育Ogu CMS类型败育特征主要表现为：从减数分裂后期开始绒毡层细胞活动异常,绒毡层细胞进行加厚(图5B，5C，5D)，膨大的绒毡层细胞阻碍了小孢子发育，从空间上压迫了小孢子破坏了其结构，有些绒毡层细胞形成两层细胞并有一层伸入药腔内(图5B)，而中层细胞直至花药开裂并未退化(图5B，5E，5F)，四分孢子能正常形成(图5C)，少部分四分孢子不能正常释放，但大部分小孢子能从胼胝质的包裹中释放出来并体积略有增大(图5D)，随后小孢子迅速退化(图5E)，而绒毡层细胞也迅速退化完全并有残余物沉积在药腔内(图5E，5F)，其内壁细胞也不能发生次生加厚，从而造成花药壁内陷。

电镜照片可以清楚地看到，花粉母细胞发育基本正常，只是其数量较少，母细胞壁较厚(图6A，6B，6C)，但此时绒毡层细胞已表现出旺盛的生活力，其细胞核较大。四分体时期能形成正常四分体，胼胝质清晰(图6D，6G，6H)，但可见绒毡层细胞肥大，生活力旺盛，径向伸长并异常增生膨大(图6D，6E，6F)，小孢子可以自由释放，但被进行性增厚的绒毡层挤压在一起(图6I) 。

综上所述，其小孢子在四分体结束后可以自由释放，但受异常增生的绒毡层挤压而败育，绒毡层的异常增生应该是导致其败育的直接原因，但部分中层细胞直至花药开裂仍不能降解，以及其花粉壁延迟形成，也可能是萝卜胞质不育相关基因导致的重要败育特征。

2.4 显性核不育花药及小孢子发育过程

显性不育MS-cd1在四分体前发育基本正常(图7A, 7B, 7C)，可以形成基本正常的四分孢子(图7C)。其最明显败育特征表现为：四分孢子在四分体形成后不能从胼胝质壁里释放出来(图7D)。在随后的发育过程中有少部分游离出的小孢子的体积略有增加，但大部分不能分开的小孢子仍粘合在一起，而不膨大(图7E)，直至花药开裂，几乎所有未退化的四分小孢子仍紧紧地粘在一起(图7F)。显性不育的绒毡层细胞发育过程基本正常，随着小孢子的发育可正常退化(图7E，7F)。中层细胞的退化与可育材料也未见有明显差异(图7C，7D)。

电镜观察可以清楚地看到，花粉母细胞发育正常，核居中，核膜清晰(图8A，8F) ，有一层清晰可见的花粉母细胞壁(图8C)，细胞器丰富，线粒体正常(图8D)，唯一较明显的差异是，花粉母细胞期四层细胞液泡化较明显(图8B)，四分体能正常形成(图8H，8G，8I)，四分体以后的药壁组织如中层细胞和绒毡层细胞均能正常降解(图8J，8K，8L)。但在单核小孢子期，尽管四分体内小孢子已经有正常的花粉壁沉积(图8M)，但四个小孢子仍粘在一起不能分开。包裹在小孢子周围的胼胝质(β-1,3-glucan)要比可育材料降解缓慢(图8M，8N)，在电镜下可以观察到，胼胝质至花粉发育后期逐渐消失(图8M-8P)。然而，围绕在四个小孢子外

的一层很薄的膜(花粉母细胞壁)(图8N)，直到花药发育晚期仍清晰可见。此时，败育的空腔花粉仍粘在一起具有不规则的花粉壁结构(图8Q，8U))，除了小孢子发育的败育特征，花药壁包括绒毡层，中层和外表皮均基本与可育材料一致(图8O，8R)。表明甘蓝显性不育小孢子不能正常分开主要是因为花粉母细胞壁不能降解而不是胼胝质的延迟降解。

3 讨论

3.1 三种雄性不育类型花药发育的主要败育特征比较

迄今为止，在甘蓝类蔬菜中发现的不育材料有14个核不育材料和11个异源胞质不育材料。早在1994年，卞春松通过石蜡切片观察并比较了四种甘蓝雄性不育的细胞学败育特征【4】。本实验利用更为先进的树脂半薄切片及超薄切片技术，分别对三种雄性不育类型的细胞结构和亚细胞结构进行了全面的分析，以期为进一步阐明甘蓝雄性育性形成的分子机理提供理论依据。实验结果表明，隐性核不育类型主要败育特征为：花粉母细胞期绒毡层细胞和中层细胞发育异常，且异常特征在不同植株上表现不一致，四分孢子正常释放后迅速败育彻底；萝卜胞质不育类型败育特征主要表现为：从减数分裂后期开始绒毡层细胞活动异常,绒毡层细胞进行加厚，其大部分四分孢子能自由释放但受绒毡层细胞挤压败育，但与卞春松不一致的是，电镜照片清楚地表明其小孢子外壁孢粉素沉积延迟，但最终能发育出较为完全的花粉外壁，这可能是由于光学显微观察的分辨率不高所致；显性核不育由于是我国特有的甘蓝核不育突变体【5】，并且已经成功应用于甘蓝杂交育种，因此研究得较为深入。继卞春松后，刘玉梅又进一步对显性不育材料通过电子显微镜观察其超微结构，证实其败育高峰在花粉母细胞至小孢子单核期【6】，主要特征是四分小孢子不能分开。本实验对显性不育败育特征的一个重要发现是，其败育的直接原因可能并不是已经发现的包裹四分体的胼胝质壁延迟降解，而是包裹整个四分体的一层在电镜下可清楚观察到的花粉母细胞壁的永久存在(图8N)。这个败育特征和拟南芥雄性不育突变体相似【7,8】，暗示二者可能具有相似的败育分子机理，为我们进一步探明显性不育的分子机理提供了重要线索。

3.2 药壁组织与小孢子的协调作用

植物雄蕊的发育是二倍体药壁组织(特别是绒毡层)和单倍体小孢子的特定基因精确调控、协同作用的结果【9】。绒毡层是药壁内部紧邻花粉母细胞或小孢

子的一层细胞，长期的研究表明，其在花粉形成和发育过程中起关键作用【10】。在许多植物雄性不育材料中均发现绒毡层异常发育【9】，我们的实验表明，隐性核不育和萝卜胞质不育均在早期观察到明显的绒毡层结构和发育的异常，隐性核不育则绒毡层既有提前脱落的特征又有绒毡层延迟解体的特征，萝卜胞质不育则表现最为明显的是其绒毡层细胞异常膨大增生。而显性核不育绒毡层细胞的尽管败育特征不明显，但其最主要的败育特征如胼胝质延迟降解和花粉母细胞壁不能降解，其直接原因推测应该是绒毡层功能异常，可能显性不育绒毡层只是分泌降解胼胝质或花粉母细胞壁的酶的基因功能受阻，但绒毡层细胞结构在形态上差异并不明显。尽管在三种雄性不育类型中，均观察到绒毡层结构异常，但仅以细胞学观察的结果我们难以确定，是小孢子败育刺激了绒毡层的异常发育，还是绒毡层的异常干扰了小孢子的正常发育。

4小结

本实验利用光学显微镜和电子显微镜在细胞水平和亚细胞水平，对三种我国研究和利用较多的甘蓝雄性不育类型进行了较为全面的系统的雄性败育特征和时期分析，以期为进一步阐明甘蓝雄性育性形成的分子机理提供理论依据。

实验结果表明：

(1) 隐性核不育类型主要败育时期为减数分裂期，主要败育特征为花粉母细胞期绒毡层细胞和中层细胞异常且异常特征在不同植株上表现不一致，四分孢子正常释放后不能形成正常花粉壁并迅速败育。

(2) 萝卜胞质不育类型主要败育时期在四分体前期，败育特征主要表现为从减数分裂后期开始绒毡层细胞活动异常,绒毡层细胞进行加厚，其大部分四分孢子能自由释放但受绒毡层细胞挤压败育，其小孢子外壁孢粉素沉积延迟，但最终能发育出较为完全的花粉外壁。但部分中层细胞直至花药开裂仍不能降解，以及花粉壁延迟形成也可能是萝卜胞质不育相关基因导致的重要败育特征。

(3) 显性核不育类型主要败育时期在四分体后期，主要败育特征是小孢子不能自由释放但花粉壁能正常沉积孢粉素。

(4) 本实验另一个重要发现是，显性不育其败育的直接原因可能并不是已经发现的包裹四分体的胼胝质壁延迟降解，而是包裹整个四分体的一层在电镜下可清楚观察到的花粉母细胞壁的永久存在。

附录（一）(节选)

。。。

图1 正常可育花药发育过程光学显微观察

A 为造孢细胞期；

B 为小孢子母细胞期；

C 为四分体时期；

D 为小孢子释放期 ；

E 为小孢子成熟期；

F 为花药开裂期

A B

D E

F C Nu PW

图2 正常可育花药发育电镜观察（放大倍数及标尺见图片）Va,液泡; Nu, 核; Ca, 胼胝质壁; Mi, 线粒体; Ex, 花粉外壁; ML,中间层; PW, 花粉母细胞壁; Ta, 绒毡层。白色箭头指示花粉外壁；黑色菱形指示中间层；黑色箭头指示花粉母细胞壁；黑色三角指示绒毡层。

A 花粉母细胞发育正常，孢子囊和四层细胞清晰可辨；

B 花粉母细胞发育正常, 排列紧密核居中；

C 花粉母细胞核膜清楚，细胞核大，核仁大；

A E D C

B G

F H I J

L K Va ML

Ta

D 四分体期四分孢子绒毡层结构清晰；

E 四分体期绒毡层结构及核清晰，细胞液泡化，有淀粉粒沉积；

F 四分孢子核大，外被一层厚厚的胼胝质；

G 四分孢子内单个小孢子核大居中，核质、胞质稠密，线粒体丰富；

H 单核小孢子时期药壁外层和内层液泡化膨大，绒毡层细胞降解，花粉外壁部分形成；

I 单核小孢子核居中，核膜清楚，胞质稠，质体丰富；

J 单核晚期形成中心大液泡将核挤向一边，小孢子壁继续增厚；

K 二核小孢子，小孢子壁基本形成，中心液泡消失；

L 成熟花粉粒形成覆盖层，基粒棒，基底层，外壁内层四层花粉壁；

参考文献

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