实验二微生物接种技术

一、目的

微生物接种技术就是在灭菌条件下，用接种工具（针、环）从一支原菌种中挑取少许菌体，接入到另一支新的培养基上进扩大培养的技术。

了解学习灭菌操作技术；掌握斜面接种技术。

二、原理

接种就是在灭菌条件下，用接种工具（针、环）（如图3-1）从一支原菌种中挑取少许菌体，接入到另一支新的培养基上进扩大培养的技术。接种就是在灭菌条件下，用接种工具（针、环）从一支原菌种中挑取少许菌体，接入到另一支新的培养基上进扩大培养的技术。

我们要想得到大量的菌种，适应生产，科研和教学要求，就要进行微生物的接种，扩大菌种数量。接种因使用不同容器、不同的培养基，达到不同的目的，而有不同的接种方法，但是它们的基本要求是相同的。通常接种都应在空气经过消毒灭菌过的“接种室”、或接种箱或超净工作台内进行。

三、材料、试剂与器具

1．材料苏云金杆菌斜面菌种，牛肉膏蛋白

胨斜面培养基。

2．试剂 75%酒精或1：50的新法尔天水溶

液。

3．超净工作台，接种针（环），接种工具

（如图3-1）、酒精灯等。

图3-1 接种工具

A.接种环；

B.接种针；

C.接种钩；

四、操作步骤

（一）准备工作

1．接种或接种室使用前半天先擦洗干净，然后每立方米体积用5~10毫升福尔马林盛在容器中加热熏蒸或者是用1/10的福尔马林重量的高锰酸钾加到盛有福尔马林的容器中，不用加热，亦可进行熏蒸；也可用5%的石炭酸喷务灭菌；用紫外灯照射

20~30min。也可达到灭菌的目的。应注意，要把接种时要所需的用具（如接种针（环），酒精灯等）及培养基放入接种箱（室）一起灭菌消毒，但是菌种不能放入，以免死。超净工作要预先通风，紫外线照射30min方可使用。

2．进入接种室前先把手洗净，再用75%酒精或新洁尔灭擦两手，菌种试管表面同样要用酒精或新洁尔灭抹擦后才放入接种室（箱内）。

（二）接种技术

1、斜面菌种接种技术（从斜面培养基上的菌种接种至另一新的斜面培养基上的方法）。

（1）准备工作就绪后，点然酒精灯。

（2）将菌种和斜面培养基的两支试管用大拇指和其他四指握在左手中，使中指拉于两试管之间的部分，斜面向上，并使它们拉于水平位置，也可将试管放在左手掌中，用手指托住试管。

（3）先将棉塞用右手拧转松动，便以接种时拔出。

（4）右手拿接种环（拿的方法就和拿钢笔一样），在火焰上将环的部分烧红灭菌。环以上凡是在接种时可能进入试管的部分，均应用火烧过（如图3-2）。

以下操作都要把试管口靠近火焰旁进行。

（5）用右手小指、无名指和手掌拔掉棉塞（如图3-2）。

（6）用火焰灼烧管口，灼烧时应不断转动试管口（靠手腕的动作，使试管口沾染的小量菌得以烧死）。（如图3-2）。

（7）将烧过的接种针（环）触动没有长菌的培养基部分，使其冷却，以免烧死被接种的菌体，然后轻轻接触菌体，取出少许，慢慢将接种针（环）抽出试管（如图3-2）。

（8）迅速将接种针（环）在火焰旁无菌区伸进另一试管，在培养基斜面上轻轻划线，在上面接细菌，划线时要由底部划到顶部，由上而上，划线可划之字形，或划几条直线，但都不要把培养基划破，也不要使菌种沾污管壁（如图3-2）。

（9）将接种针（环）抽出，灼烧试管口，并在火焰旁将棉塞塞上。塞棉塞时，不要用试管去迎棉塞，以免试管在运动时纳入不洁空气（如图3-2）。

（10）把针（环）在火焰上再灼红灭菌，放下接种钟（环）后，再腾出手来将塞塞紧。（如图3-2）。

（11）全部培养基接种完毕后，要将试管斜面培养基包扎好，并标明姓名、时间和菌种名称；整理好接种室（箱）的台面，搞好清洁卫生。

2、液体接种技术（由斜面菌接入液体培养基内或液体菌种接入液体培养基）

（1）准备工作和操作方法与前相同，但可使试管向上略斜，以免培养液流出。

（2）将取得菌种的接种环送入液体培养基时，可使环在液体表面与管壁接触的部分轻轻摩擦。接种后塞棉塞，将试管在手掌中轻轻摇动，使菌体在培养基中分散开来。

（3）由液体菌种接种液体培养基时，接种用无菌滴管或移液管，接种量通常为培养液体积的1/10。无菌操作的注意事项与前相同，只是移液管不同于接种针，系由玻璃做成，它不能在火焰上灼烧，接种前在火焰上迅速通过一两次即可。

3、穿刺接种技术（深层柱形固体培养基的接种技术）（如图3-3）

（1）取两支新鲜半固体牛肉膏蛋白胨深层柱状培养基，做好标记（写上菌种名、接种日期和接种人等）。

（2）接种的方法是，用接种针沾取少量待接菌种，然后从柱状培养基的表面中心穿入其底部（但不要穿透），然后沿原刺入路线抽出接种针，注意接种针不要移动。

以上接好种的材料置于30℃下培养24~48h。

图3-3 穿刺接种技术

五、注意事项

1、菌种取出后，接种针（环）不要通过火焰、以免烧死菌体。

2、斜面接种时，不要使接种针（环）的碰到管壁；不要划破培养基，但也不能在试管空间划，一定要接触到斜面表面上划线接种。

3、接种前的准备和接种过程都要有无菌概念。

六、实验报告

培养后取出试管，观察划线接种效果、菌种生长情况，检查是否有杂菌生长，评价无菌操作的效果。

七、思考题

微生物接种时，通过哪些措施可防止杂菌污染？

如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合！

微生物实验操作

油镜的使用和维护目的：掌握油镜的使用与维护，熟悉油镜的使用原理。材料：显微镜，拭镜纸，液体石蜡油，二甲苯原理：油镜的透镜极小，工作焦距最短，光线通过玻璃和空气，由于介质密度不同发生折射，射入镜筒的光线极少，视野暗，物象不清晰。如在玻片与镜头（透镜）之间加上折光率和玻片（n=1.52）相近的香柏油（n=1.515）就可减少光线的折射，加强视野的亮度，获得清晰的物象。步骤：显微镜油镜的使用和维护 1.将显微镜平稳地安放在实验台适宜处。识别油镜头：标有100×、OIL、HI等字样。 2. 打开电源，用低倍镜对光，打开光圈，调节聚光镜的位置，使视野光线充足。 3. 标本上加镜油一滴，转动粗螺旋，使油镜头缓缓下降，用眼从侧面观察，直到油镜头浸入油中接近玻片为止。 4. 从目镜观察，同时徐徐转动粗螺旋提升，见模糊物象后再用细螺旋调节，直到见到清晰物象为止。 5. 观察完毕，粗螺旋提高镜头，取下标本片，油镜头使用后立即用擦镜纸擦净镜头上的油。如油已干，可在擦镜纸上滴少许二甲苯擦拭，并立即用另一擦镜纸

擦去二甲苯，因二甲苯能溶解镜头上的固定胶以致使镜头脱落。 6.将镜头转呈“八”字，调低聚光器，对号送入柜子内存放。革兰染色目的：掌握革兰染色的原理及操作。材料：干净玻片，接种环，葡萄球菌和大肠杆菌18-24h 培养后的混合菌液，酒精灯，一套革兰染液原理：主要为细胞壁结构的差异。G+三维肽聚糖结构的交联度大，通透性低，脂质少或无，酒精作用使孔径缩小；而G-肽聚糖为二维疏松结构，薄，外膜含大量脂质，易被酒精溶解，使细胞壁通透性增高，结晶紫-碘复合物被酒精溶解而脱色。步骤： 1. 细菌标本的制作（1）涂片：无菌操作。取一接种环混合细菌悬液，涂布成直径约1cm的涂片，涂片应薄而均匀。（2）干燥：涂片最好在室温中自然干燥。必要时可将标本面向上，放在酒精灯上方微火处干燥。（3）固定：标本面向上，在酒精灯火焰外焰按钟摆的速度来回通过3次，放置待冷后染色。固定的目的是

微生物学实验报告

2012级制药专业工业微生物学实验报告姓名: 刘甜甜学号: 2012304090 班级: 制药12-2班指导老师：王健日期：2014.6.11

一、实验目的 1、抑制或杀死微生物的一些物理、化学及生物的因素抑菌、杀菌的原理。 2、掌握物理、化学及生物的因素抑菌、杀菌的试验方法。 3、了解细菌的形态特征、染色特点。 4、了解细菌在普通培养基、选择培养基、血平板上的菌落特征。 5、掌握细菌分离划线培养的方法。 6、掌握细菌的初步生化反应。 7、掌握细菌密集划线法，掌握细菌K-B药敏纸片法。二、实验内容 1 细菌Gram’s stain染色，镜检，观察记录细菌形态和特色特征 1.1 实验原理：染色原理：G+菌与Gˉ菌细胞壁不同，G+菌比Gˉ菌细胞内核糖核酸镁盐含量高，G+菌比Gˉ等电点低。 1.2 实验步骤： 1.2.1.制片：○1涂片：取半滴生理盐水置一洁净玻片上，以无菌操作技术自平板上去菌落少许，与生理盐水混匀，均匀涂布约1cm2大小，自然干燥； ②固定：取含菌膜的玻片与酒精灯火焰上来回三次，使菌膜牢固附于玻片表面； 1.2.2染色：①初染：取结晶紫一到两滴覆盖于菌膜表面，轻微摇动，维持30〃~40〃,细流水冲洗，切勿直接冲洗涂片区域； ②媒染：取卢氏碘液1~2滴覆盖菌膜表面，轻微摇动，维持30〃~40〃,用上法细流水冲洗； ③脱色：取95%酒精2~3滴于菌膜表面，轻微摇动，局部接近无色即可, 用上法细流水冲洗； ④复染：取1：10稀释石炭酸复红覆盖涂片区域，轻微摇动，用上法细流水冲洗； ⑤吸水纸初步吸干玻片水分，然后自然干燥； 1.2.3 镜检：于涂片区域加半滴香波油，油镜（100倍目镜）下。图1：Gram’s stain（1000×）图2：染色试验三、分离培养 1实验原理：四区划线法是把混杂着在一起的微生物或同一微生物群体的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养繁殖后生成个菌落。有时这些单菌落并非由单个细胞繁殖而来，故必须反复分离多次才能得到纯种。其原理是微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离的目的。

微生物学实验知识点总结与实践应用

微生物实验知识总结与实践应用经过这学期学习和实验操作，我对《微生物实验》有了一些初步的认识，也从中学习到了有用的知识。《微生物学实验》是要求我们掌握实验知识的基本操作和技能训练，初步了解和掌握先进的技术和方法，与迅速发展的科学前沿接轨。微生物：包括细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生动物、显微藻类等在内的一大类生物群体，它个体微小，却与人类生活关系密切。涵盖了有益有害的众多种类，广泛涉及健康、食品、医药、工农业、环保等诸多领域。我将我这学期学到的微生物学知识，结合生活和工业当中的一些应用，归纳如下：在吾尔恩老师的带领下，我们先从最基本的知识学起。（1）无菌操作技术：高温对微生物具有致死效应，因此微生物在转接过程中，一般再火焰旁进行，并用火焰直接灼烧接种环，已达到灭菌的目的。在做实验时要保持严谨的态度，以后的实验中多数操作都必须再火焰旁进行。（2）培养基的制备：培养基是人工配置的生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴别微生物或积累代谢产物。自然界中培养基的种类很多，但是不同的培养基中，一般含有水分、碳源、氮源、无机盐和生长因子等，不同类别的微生物对PH值的要求一般不同。（3）消毒与灭菌：灭菌是用理化方法杀死一定物质中的微生物的微生物学基本技术。灭菌的彻底程度受灭菌时间与灭菌剂强度的制约。微生物对灭菌剂的抵抗力取决于原始存在的群体密度、菌种或

环境赋予菌种的抵抗力。灭菌是获得纯培养的必要条件，也是食品工业和医药领域中必需的技术。是指用物理或化学的方法杀灭全部微生物，使之达到无菌保障水平。经过灭菌处理后，未被污染的物品，称无菌物品。经过灭菌处理后，未被污染的区域，称为无菌区域。（4）平板分离与活菌计数：平板分离计数法是将待测菌液经适当稀释，涂布在平板上。经培养后在平板上形成肉眼可见的菌落。根据稀释倍数和取样量计算出样品中细胞密度。平板分离法主要有：1.平板划线分离法。2.稀释涂布平板法。（5）革兰氏染色法：革兰氏染色法可将细菌分为革兰氏阳性细菌（G+）和革兰氏阴性细菌（G-）两种类型。这是两种细菌细胞壁结构和组成的差异决定的。大肠杆菌是革兰氏阴性杆状细菌，金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性细菌，经过革兰氏染色后两者呈现不同的颜色，在显微镜下便于进行观察…… 我们学习微生物实验技术，就是要把微生物的实验技能应用于实践生产，培养繁育细菌收集细菌代谢产物，应用于药业、工业，产生经济利益。制备培养基是微生物实验技术操作的重要环节，按照培养基的功能分类培养基的类型有：1.选择培养基。2.鉴别培养基。在工业生产中常常应用于培养微生物的主要是-发酵罐。我将微生物在生产生活中的应用总结如下：微生物技术的应用在当今社会中已取得了很大的作用，在工业、农业、医药业、畜牧业等各个行业中都取得了长足的进展，但相对于

微生物的接种技术

1目的 1.1学习掌握微生物的几种接种技术 1.2建立无菌操作的概念，掌握无菌操作的基本环节 2实验说明将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。无论微生物的分离、培养、纯化或鉴定以及有关微生物的形态观察及生理研究都必须进行接种。接种的关键是要严格的进行无菌操作，如操作不慎引起污染，则实验结果就不可靠，影响下一步工作的进行。 3实验器材 3.1器械和用品酒精灯，玻璃铅笔，火柴，试管架、接种环、接种针、接种钩、滴管、移液管、三角型接种棒等接种工具。 3.2菌种和培养基菌种：大肠杆菌（Escherichia coli），金黄色葡萄球菌（Staphyloccus aureus）。培养基：普通琼脂斜面和平板,营养肉汤,普通琼脂高层(直立柱)。 4实验流程斜面接种法→液体接种法→固体接种法→穿刺接种法。 5操作步骤

5.1斜面接种法斜面接种法主要用于接种纯菌，使其增殖后用以鉴定或保存菌种。通常先从平板培养基上挑取分离的单个菌落，或挑取斜面，肉汤中的纯培养物接种到斜面培养基上。操作应在无菌室、接种柜或超净工作台上进行，先点燃酒精灯。将菌种斜面培养基(简称菌种管)与待接种的新鲜斜面培养基(简称接种管)持在左手拇指、食指、中指及无名指之间，菌种管在前，接种管在后，斜面向上管口对齐，应斜持试管呈45～0度角，并能清楚地看到两个试管的斜面，注意不要持成水平，以免管底凝集水浸湿培养基表面。以右手在火焰旁转动两管棉塞，使其松动，以便接种时易于取出。右手持接种环柄，将接种环垂直放在火焰上灼烧。镍铬丝部分（环和丝）必须烧红，以达到灭菌目的，然后将除手柄部分的金属杆全用火焰灼烧一遍，尤其是接镍铬丝的螺口部分，要彻底灼烧以免灭菌不彻底。用右手的小指和手掌之间及无名指和小指之间拨出试管棉塞，将试管口在火焰上通过，以杀灭可能沾污的微生物。棉塞应始终夹在手中如掉落应更换无菌棉塞。将灼烧灭菌的接种环插入菌种管内，先接触无菌苔生长的培养基上，待冷却后再从斜面上刮取少许菌苔取出，接种环不能通过火焰，应在火焰旁迅速插入接种管。在试管中由下往上做S形划线。接种完毕，接种环应通过火焰抽出管口，并迅速塞上棉塞。再重新仔细灼烧接种环后，放回原处，并塞紧棉塞。将接种管贴好标签或用玻璃铅笔划好标记后再放入试管架，即可进行培养。 5．2液体接种法多用于增菌液进行增菌培养，也可用纯培养菌接种液体培养基进行生化试验，其操作方法与注意事项与斜面接种法基本相同，仅将不同点介绍如下：由斜面培养物接种至液体培养基：用接种环从斜面上沾取少许菌苔，接至液体培养基时应在管内靠近液面试管壁上将菌苔轻轻研磨并轻轻振荡，或将接种环在液体内振摇几次即可。如接种霉菌菌种时，若用接种环不易挑起培养物时，可用接种钩或接种铲进行。

微生物学实验指导

实验一光学显微镜的使用及微生物形态的观察、大小的测定和计数一、实验目的１、掌握光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养 2、观察细菌、真菌、原生动物的标本装片,学会绘制生物图 3、掌握使用测微尺测量微生物大小的方法４、了解血球计数板的结构，掌握使用和计算方法二、实验器材１、显微镜２、微生物标本装片３、目、物镜测微尺４、血球计数板５、酵母菌液或霉菌孢子液 6、载波片、盖波片、烧杯、滴管、擦镜纸、香柏油、二甲苯等三、显微镜的构造、原理及使用方法 1、构造现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜,由机械装置和光学系统两大部分组成。机械装置包括镜筒、转换器、载物台、镜臂、镜座、调节器;光学系统包括目镜、物镜、聚光器、电光源。显微镜的总放大倍数为目镜和物镜的放大倍数的乘积。２、操作在目镜保持不变的情况下,使用不同放大倍数的物镜所能达到的分辨率及放大率都是不同的。一般情况下,特别是初学者，进行显微观察时应遵循从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序,因为低倍数物镜视野相对大,易发现目标及确定检查的位置。四、微生物大小的测量原理和方法微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小,只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和物镜测微尺。 1、目镜测微尺(图1-1）是一块圆形玻片,在玻片中央把5ｍｍ长度刻成5０等分，或把1０mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上（此处正好与物镜放大的中 --

-- 间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同,目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用物镜测微尺校正，以求出在一定放大倍数下,目镜测微尺每小格所代表的相对长度。 2、物镜测微尺(图１-２）是中央部分刻有精确等分线的载玻片,一般将lmm 等分为100格,每格长ｌ０μm （即0.0ｌmm), 是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将物镜测微尺放在载物台上,由于物镜测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成象进入视野,即物镜测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从物镜测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小,所以用物镜测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度,然后移去物镜测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。 3、目镜测微尺的校正把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把物镜测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清物镜测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与物镜测微尺的刻度平行，移动推动器,使两尺重叠,再使两尺的“０”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度（图1－３)，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和物镜测微尺的格数。因为物镜测微尺的刻度每格长l0μｍ，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。例如目镜测微尺５小格正好与物镜测微尺5小格重叠，已知物镜测微尺每小格为ｌ0μm ，则目镜测微尺上每小格长度为=5×10μm/５=1０μm 用同法分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。由于不同显微镜及附件的放大倍数不同,因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件(特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用,当更换不同放大倍数的目镜或物镜时,必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。 4、细胞大小的测定移去物镜测微尺,换上待测菌体的装片，先在低倍镜下找到目的物,然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值,即等于该菌的长和宽。结果计算：长μm=平均格数×校正值宽μｍ＝平均格数×校正值大小表示: 宽μm ×长μｍ五、微生物细胞数量的测定原理和方法 1、血球计数板是一块特制的厚型载玻片,载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半,每个半边上面各有一个计数区(图1-4），计数区图1-1 目镜测微尺图1-2 物镜测微尺图1-3 目、物镜测微尺的校正图1-4 血球计数板

微生物大小与数量的测定实验报告

山东大学实验报告2017年11月27日 ________________________________________ _________________________ 科目：微生物学实验题目：微生物大小与数量的测定姓名：丁志康一、目的要求 1.学习并掌握用测微尺测定微生物大小的方法。 2.增强微生物细胞大小的感性认识。 3. 明确血细胞计数板计数的原理。 4. 掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。二、基本原理一）微生物大小的测定 1.微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定，需要在显微镜下，借助于特殊的测量工具——测微尺，包括目镜测微尺和镜台测微尺。 2.镜台测微尺是中央部分可有精确等分线的载玻片，一般是将1mm等分为100格每格长0.01mm（即10μm）。镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是用于矫正目镜测微尺每格的相对长度。 3.目镜测微尺是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，有等分为50小格和100小格两种。测量时，需将其放在接目镜中的隔板上，用以测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格所代表的实际长度也不一样。因此，用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求出该显微镜在一定大放大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，即可计算出细胞的实际大小。 4.球菌用直径来表示其大小；杆菌则用宽和长的范围来表示。如金黄色葡萄球菌直径约为0.8μm，枯草芽孢杆菌大小为0.7~0.8×2~3μm。二）微生物数量的测定 1.微生物数量的测定有多种方法，本次试验中使用显微镜直接计数法。显微镜直接计数法是将少量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上(又称计菌器)，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。目前国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及Hawksley 计菌器等，它们都可用于酵母、细菌、霉菌孢子等悬液的计数，基本原理相同。后两种计菌器由于盖上盖玻片后，总容积为0.02mm3，而且盖玻片和载波片之间的距离只有0.02mm，因此可用油浸物镜对细菌等较小的细胞进行观察和计数。（除了用这些计菌器外，还有在显微镜下直接观察涂片面积与视野面积之比的估算法，此法一般用于牛乳的细菌学检查。)显微镜直接计数法的优点是直观、快速、操

微生物检验操作步骤

微生物检验操作步骤 Company Document number：WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998

样品制备：取样品 10 g/ml加入至 90 ml灭菌生理盐水中，混匀，制成 1 ︰ 10 的稀释液；菌落总数：（结果报告：XXX cfu /g(ml)）取上述 1 ︰ 10 的稀释液 1 ml加入至 9 ml灭菌生理盐水中，充分混匀，制成 1 ︰100 的稀释液；取上述两个稀释级的稀释液分别加入2块平皿中，每块平皿中加 20 ml，然后往平皿中倒入约45℃的卵磷脂吐温80琼脂培养基，待培养基凝固，倒置放于36+/-1 ℃培养箱中培养 48 h，点计菌落数。霉菌和酵母菌：操作同菌落总数，加入的培养基为虎红培养基，待培养基凝固，倒置放于℃培养箱中培养 72 h，分别点计霉菌和酵母菌数。粪大肠菌群：（结果报告（未）检出/ ）取上述 1 ︰ 10 的稀释液 10 ml加入至 10 ml 双倍乳糖胆盐培养基中，摇匀，置 44 ℃培养箱中培养 48 h；如果培养物产酸产气（现象为培养基呈黄色，小倒管内有气泡），则应取培养物分别接种至伊红美蓝琼脂平板于 37 ℃培养 18-24 h和蛋白胨水培养基中于 44 ℃培养 24 h。在上述平板上，粪大肠菌群呈深紫黑色、圆形突起的菌落，并有金属光泽。挑取分离的单个菌落，进行革兰氏染色和镜检，在显微镜下应观察到红色短杆状的菌。挑取菌落时，应使灭菌的接种环冷却后再行操作。

上述蛋白胨水培养基的培养物还需做靛基质试验，阳性现象为培养物表层出现玫瑰红色。铜绿假单胞菌：（结果报告（未）检出/ ）取上述 1 ︰ 10 的稀释液 10 ml加入至 90 ml SCDLP 培养基中，摇匀，置 37 ℃培养箱中培养 18-24 h；挑取上述培养物，接种至十六烷基三甲基溴化铵琼脂平板于 37 ℃培养 18-24 h；在该平板上，铜绿假单胞菌应为灰白色色、圆形湿润的菌落，周围培养基溶有水溶性色的色素；挑取分离的单个菌落，染色镜检，在显微镜下应观察到红色杆状的菌。如果平板上只分离到1个可疑菌落，不够做生化试验，则应挑取该菌落于SCDLP增菌培养。取分离的菌落分别做氧化酶试验、绿脓菌素试验、硝酸盐还原产气试验、明胶液化试验和 42℃生长试验。金黄色葡萄球菌：增菌培养同铜绿假单胞菌项下，挑取上述增菌液的培养物，接种至 B-P 平板于 37 ℃培养 24-48 h；在该平板上，金黄色葡萄球菌应为灰黑色、圆形的菌落，菌落周围有混浊带和透明环挑取分离的单个菌落，染色镜检，在显微镜下应观察到紫色球状的菌。取分离的菌落分别接种至甘露醇发酵培养基和肉汤培养基中，于 37 ℃培养24 h；取上述肉汤培养物，做血浆凝固酶试验。

微生物生理生化反应实验报告

山东大学实验报告2012年 12 月 4日姓名系年级 2011级生科2班组别四科目微生物学实验题目微生物的生理生化反应微生物的生理生化反应一、【实验目的】 1. 证明不同微生物对各种有机大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。 2.掌握进行微生物大分子物质水解试验的原理和方法。 3.了解糖发酵的原理和在肠细菌坚定中的重要作用。 4.掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。 5. 了解吲哚和甲基红试验的原理以及其在肠道细菌鉴定中的意义和方法。二、【实验仪器与试剂】菌种：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、普通变形杆菌、产气肠杆菌培养基：培养基：固体淀粉培养基、固体油脂培养基（大分子水解试验）；葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基（内装有倒置的德汉氏小管）（糖发酵试验）；蛋白胨水培养基（吲哚试验）；葡萄糖蛋白胨水培养基；试剂：卢戈氏碘液、乙醚、吲哚试剂、甲基红试剂、蒸馏水、仪器：酒精灯、接种针、培养皿、试管、试管架、烧杯、量筒、德汉氏小管三、【实验原理】 1.在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢，代谢过程主要是酶促反应过程，由于各种微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。 2.淀粉的水解：由于微生物对淀粉这种大分子物质不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解才能被微生物吸收利用.胞外酶主要为水解酶,通过加水裂解大的物质为较小的化合物,使其能被运输至细胞内.如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精,双糖和单糖；而淀粉遇碘液会产生蓝色，因此能分泌胞外淀粉酶的微生物，则能利用其周围的淀粉，在淀粉培养基上培养用碘处理其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈，据此可分辨微生物能否产生淀粉酶。 3.油脂的水解：在油脂培养基上接种细菌，培养一段时间后观察菌苔的颜色，若出现红色斑点，则说明此中菌可产生分解油脂的酶。 4.糖发酵试验：糖发酵试验是常用的鉴别微生物的生化反应,在肠道细菌的鉴定上尤为重要.绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源,但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异.有些细菌能分解某种糖产生有机酸(如乳酸,醋酸,丙酸等)和气体(如氢气,甲烷,二氧化碳等);有些细菌只产酸不产气. 例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气。产酸后再加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。 5.IMVC实验主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌。（1）吲哚试验：是用来检测吲哚的产生，在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。但并非所有的微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，所以吲哚实验可以作为一个生物化学检测

(完整版)微生物的接种技术

微生物的接种技术 1 目的 1.1学习掌握微生物的几种接种技术 1.2 建立无菌操作的概念，掌握无菌操作的基本环节 2 实验说明将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。无论微生物的分离、培养、纯化或鉴定以及有关微生物的形态观察及生理研究都必须进行接种。接种的关键是要严格的进行无菌操作，如操作不慎引起污染，则实验结果就不可靠，影响下一步工作的进行。 3 实验器材 3.1 器械和用品酒精灯，玻璃铅笔，火柴，试管架、接种环、接种针、接种钩、滴管、移液管、三角型接种棒等接种工具。 3.2 菌种和培养基菌种：大肠杆菌（Escherichia coli），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。培养基：普通琼脂斜面和平板,营养肉汤,普通琼脂高层(直立柱)。 4 实验流程斜面接种法→液体接种法→固体接种法→穿刺接种法。 5 操作步骤 5.1 斜面接种法斜面接种法主要用于接种纯菌，使其增殖后用以鉴定或保存菌种。通常先从平板培养基上挑取分离的单个菌落，或挑取斜面，肉汤中的纯培养物接种到斜面培养基上。操作应在无菌室、接种柜或超净工作台上进行，先点燃酒精灯。将菌种斜面培养基(简称菌种管)与待接种的新鲜斜面培养基(简称接种管)持在左手拇指、食指、中指及无名指之间，菌种管在前，接种管在后，斜面向上管口对齐，应斜持试管呈45～0度角，并能清楚地看到两个试管的斜面，注意不要持成水平，以免管底凝集水浸湿培养基表面。以右手在火焰旁转动两管棉塞，使其松动，以便接种时易于取出。

右手持接种环柄，将接种环垂直放在火焰上灼烧。镍铬丝部分（环和丝）必须烧红，以达到灭菌目的，然后将除手柄部分的金属杆全用火焰灼烧一遍，尤其是接镍铬丝的螺口部分，要彻底灼烧以免灭菌不彻底。用右手的小指和手掌之间及无名指和小指之间拨出试管棉塞，将试管口在火焰上通过，以杀灭可能沾污的微生物。棉塞应始终夹在手中如掉落应更换无菌棉塞。将灼烧灭菌的接种环插入菌种管内，先接触无菌苔生长的培养基上，待冷却后再从斜面上刮取少许菌苔取出，接种环不能通过火焰，应在火焰旁迅速插入接种管。在试管中由下往上做S形划线。接种完毕，接种环应通过火焰抽出管口，并迅速塞上棉塞。再重新仔细灼烧接种环后，放回原处，并塞紧棉塞。将接种管贴好标签或用玻璃铅笔划好标记后再放入试管架，即可进行培养。 5．2 液体接种法多用于增菌液进行增菌培养，也可用纯培养菌接种液体培养基进行生化试验，其操作方法与注意事项与斜面接种法基本相同，仅将不同点介绍如下：由斜面培养物接种至液体培养基：用接种环从斜面上沾取少许菌苔，接至液体培养基时应在管内靠近液面试管壁上将菌苔轻轻研磨并轻轻振荡，或将接种环在液体内振摇几次即可。如接种霉菌菌种时，若用接种环不易挑起培养物时，可用接种钩或接种铲进行。由液体培养物接种液体培养基时，可用接种环或接种针沾取少许液体移至新液体培养基即可。也可根据需要用吸管、滴管或注射器吸取培养液移至新液体培养基即可（图4-5）。接种液体培养物时应特别注意勿使菌液溅在工作台上或其他器皿上，以免造成污染。如有溅污，可用酒精棉球灼烧灭菌后，再用消毒液擦净。凡吸过菌液的吸管或滴管，应立即放入盛有消毒液的容器内。 5.3 固体接种法普通斜面和平板接种均属于固体接种，斜面接种法已讲了，不再赘述。固体接种的另一种形式是接种固体曲料，进行固体发酵。按所用菌种或种子菌来源不同可分为：用菌液接种固体料，包括用菌苔刮洗制成的菌悬液和直接培养的种子发酵液。接种时按无菌操作将菌液直接倒入固体料中，搅拌均匀。但要注意接种所用水容量要计算在固体料总加水量之内，否则会使接种后含水量加大，影响培养效果。用固体种子接种固体料。包括用孢子粉、菌丝孢子混合种子菌或其他固体培养的种子菌。将种子菌于无菌条件下直接倒入无菌的固体料中即可，但必须充分搅拌使之混合均匀。一般是先把种子菌和少部分固体料混匀后再拌大堆料。

微生物实验操作步骤

微生物试验操作步骤 1.前期准备工作（红色字体需要购买） 10ml离心管（80管）、培养皿（预实验36板，正式试验648板，共计684板）、EP管（预实验36管，正式试验108管，144管）、枪头（5ml、1ml、200ul）、生理盐水现配现用（0.85）2.，灭菌处理将离心管、枪头、生理盐水、培养基放入高压灭菌锅中灭菌处理后待用。 3.制备不同梯度的样品溶液预实验 a.梯度稀释试验前一天晚上取置于-80℃盲肠食糜样品于4℃冰箱融化，将需要用到的离心管和EP管分别编号待用。试验期间取盲肠食糜0.5~1g于灭菌后的10ml离心管中，按1：10比例加入生理盐水，制成10-1浓度的样品溶液。然后取0.5ml10-1浓度的样品溶液于下一离心管，按1：10比例加入生理盐水，制成10-2浓度的样品溶液。然后然后取0.1ml10-2浓度的样品溶液于EP管中，按1：1010-3比例加入生理盐水，制成10-3浓度的样品溶液。然后依次如上分别配制10-4、10-5、10-6、10-7、10-8样品溶液。每一次取样前离心管和EP管都要在微型振荡器上震荡混匀。 b.接种和培养：按照平板涂布法进行。分别取各稀释管溶液100μl接种到选择性培养基，大肠杆菌选择性培养基置普通培养箱，37℃培养24h。乳酸菌选择性培养基置5%CO2培养箱，37℃培养48h。双歧杆菌选择性培养基置厌氧发酵罐内，37℃培养48h。沙门氏菌选择性培养基置普通培养箱，37℃培养24h。 c. 微生物计数与鉴定：采用常规微生物平板菌落计数法，选择长有30-300个菌落的平板较为合适，用每克肠道内容物中细菌个数的对数表示( 1gCFU /g) 正式试验按照预实验操作步骤及适宜梯度进行试验。 4.培养基总需氧菌营养琼脂（NA）34567 乳酸菌MRS琼脂碱性厌氧234567 双歧杆菌BL琼脂厌氧234567产气袋大肠杆菌麦康凯需氧234567 沙门氏菌XLD 需氧2345

微生物学实验报告--第八周

年级：2009 专业：医学检验班级：一班姓名：赵富海学号：2009221792 实验八、细菌的药物敏感试验【K-B法】菌种（均为幼龄菌）：金黄色葡萄球菌1.5×108/ml、大肠埃希菌1.5×108/ml 药物纸片：青霉素、庆大霉素、新诺明、环丙沙星方法： 1.涂菌（棋盘划线法），室温放10min； 2.贴药敏纸片，注意间距（大于24mm）和边距（大于15mm）； 3.置35℃24h判读结果。结果如图所示：金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌抗菌药物敏感性试验评价结果实验结论：金黄色葡萄球菌对青霉素耐药，对庆大霉素、新诺明、环丙沙星敏感。【试管稀释法】菌种：金黄色葡萄球菌1.5×108/ml、大肠b1.5×108/ml 抗生素：庆大霉素32u/ml 方法： 1.对倍稀释抗生素

2.加菌液0.1ml/管，摇均35℃16—18h 3.判读MIC 试验操作如下图所示：注意:设立对照管(肉汤对照管,待测菌生长对照管和质控菌生长对照管) 结果判断: 不出现肉眼可见生长的最低药物浓度为该药对该细菌的MIC. 如图：实验结论：MIC=原药物浓度(32u/ml) ×稀释倍数(1:24)=2u/ml 【联合药敏试验】（示教）金黄色葡萄球菌大肠b 结果判断：金黄色葡萄球菌联合药敏试验结果判读：

①青+链=青单+链单→相加作用 ②青+红=青单+红单→相加作用 ③青+万=青单+万单→相加作用 ④青+林＞青单+林单→协同作用大肠b联合药敏试验结果判读： ①青+红=青单+红单→相加作用 ②青+链=青单+链单→相加作用 ③青+林=青单或林单→无关作用 ④青+南＞青单+南单→协同作用【实验讨论】 1．K-B法原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上。纸片中所含有的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度。并与该药对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关关系，即抑菌圈愈大，MIC 愈小。 2. K-B法影响因素 ①培养基的质量，如PH、深度、硬度和表面湿度等； ②药敏纸片的质量，含药量和保存方式； ③接种菌量正确与否是影响结果的重要因素之一，取决于比浊标准的配制，正确使用和保存； ④试验操作质量：接种细菌后贴片时5~15分钟； ⑤孵育条件，温度和时间：培养时间16~18h,不要超过24h。 3．稀释法原理：以水解酪蛋白（MH）液体培养基将抗生素作不同浓度的稀释，然后种入待测细菌，定量测定抗菌药物对被测菌的最低抑菌浓度(MIC)或最低杀菌浓度（MBC）。 4. 稀释法影响因素：培养基、接种菌量、蛋白质结合率、抗菌药物的配制、结果观察的时间等因素均能影响本试验的结果。 5．抗生素药物敏感性试验（AST）的意义 ①可预测抗生素治疗的效果，既AST试验结果为“敏感”时，治疗可能有效；试验结果为“耐药”时，使用该药物治疗肯定失败； ②指导临床医生选择使用抗生素，AST的结果往往在给予病人经验性治疗24~48h之后，若AST结果为“敏感”，该治疗为有效，若结果为“耐药”，即应更换药物； ③提供所选择药物的依据； ④监测耐药性，分析耐药菌的变迁，掌握耐药菌感染病的流行病学，控制和预防耐药菌感染的发生和流行。 6．通过此次实验掌握纸片扩散法（K-B法）、试管稀释法的原理、操作方法、结果的判读及其临床意义，并掌握联合药敏试验结果的观察、判断。

微生物学实验

微生物学实验实验一常用培养基的制备、灭菌与消毒一、实验目的了解培养基的配制原理；掌握配制培养基的一般方法和步骤；了解常见灭菌、清毒基本原理及方法；掌握干热天菌、高压蒸汽灭菌及过滤除菌的操作方法。二、实验原理培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供微生物生长繁殖之用。干热天菌、高压蒸汽灭菌方法主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。三、试剂与器材 1.器材试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、培养基、分装器、天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH度纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、吸管、培养皿、电烘箱、注射器、微孔滤膜过滤器、镊子等。 2.试剂牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂四、实验内容 1.称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→无菌检查 2.干热灭菌：装入待灭菌物品→升温→恒温→降温→开箱取物 3.高压蒸汽灭菌：加水→装物品→加盖→加热→排冷空气→加压→恒压→降压回零→排汽→取物→无菌检查 4.过滤除菌：组装灭菌→连接→压滤→无菌检查→清洗灭菌五、关键步骤及注意事项 1.要严格按配方配制。 2.调pH不要过头。

3.干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70oC 以下放物、取物。 4.高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零取物。 5.过滤除菌要注意各部件灭菌，压滤时，压力要适当，不可太猛太快，滤膜要注意清洗保存。六、思考题 1.培养基配好后，为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后的培养基是无菌的? 2.在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题?为什么? 3.培养微生物的培养基应具备哪些条件?为什么? 4.培养基的配制原则是什么? 实验二土壤中微生物分离纯化培养一、实验目的掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术；了解不同的微生物菌落在斜面上、半固体培养基和液体培养基中的生长特征；进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术；掌握微生物培养方法。二、实验原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的分离、纯化方法：单细胞挑取法，稀释涂布平板法，稀释混合平板法，平板划线法稀释涂布平板法步骤：倒平板－制备土壤污水稀释液－涂布－培养－挑菌落；平板划线法步骤：倒平板－标记培养基名称－划线。三、试剂与器材 1.器材盛9m1无菌水的试管、盛90m1无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶、无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、酒精灯、无菌培养皿、显微镜、血细胞计数板等。 2.试剂牛肉膏蛋白胨培养基，高氏1号培养基，查氏培养基四、实验内容

微生物实验室技术操作规范

实验室技术操作规范一、无菌操作要求食品微生物实验室工作人员，必须有严格的无菌观念，许多试验要求在无菌条件下进行，主要原因：一是防止试验操作中人为污染样品，二是保证工作人员安全，防止检出的致病菌由于操作不当造成个人污染。 1.接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。 2. 进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。 3. 接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。 4. 进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。 5. 从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。 6. 接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。 7. 接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min，再经火焰烧灼。 8. 吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。二、无菌间使用要求 1. 无菌间通向外面的窗户应为双层玻璃，并要密封，不得随意打开，并设有与无菌间大小相应的缓冲间及推拉门，另设有0.5-0.7m2的小窗，以备进入无菌间后传递物品。 2. 无菌间内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。 3. 无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。 4. 处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。 5. 在无菌间内如需要安装空调时，则应有过滤装置。三、消毒灭菌要求微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。 1．灭菌前准备（1）所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面通气孔打开。（2）装培养基的三角瓶塞，用纸包好，试管盖好盖，注射器须将管芯抽出，用纱布包好。

【实验报告】微生物学实验报告格式

微生物学实验报告格式专业学号姓名实验一、???培养基的配制和高压蒸汽灭菌一、实验目的二、实验原理三、实验材料（实际用到哪些试剂、材料、玻璃器皿等都要写出，包括数量）四、实验步骤（按照实际步骤填写,切忌抄袭）五、注意事项（自己总结实验过程中的注意点）六、思考题 1、简述培养基的配制原则？ 2.为什么湿热灭菌比干热灭菌法更有效？ 3.高压蒸汽灭菌时，为什么要先将灭菌锅锅内的冷空气完全排尽？实验二自生固氮菌的分离纯化（这是个综合实验，请大家回顾三周来的所有操作步骤，将其整理成连贯完整的一份报告，注意每次实验的衔接，不要把其他的实验项目写进来，但也不要漏写该实验的相关步骤。）一、实验目的

二、实验原理三、实验材料（整个综合实验有涉及到的材料都要列出）四、实验步骤（详叙每周所做的相关步骤）五、注意事项（自己总结实验过程中的注意点）六、思考题 1、划线分离时，为什么每次都要将接种环上多余的菌体烧掉？划线为何不能重叠？ 2、如何从自然界中分离自己所需要的纯培养？实验三平板培养测数法一、实验目的二、实验原理三、实验材料（实际操作有涉及到的材料都要列出）四、实验步骤（详叙相关步骤）五、实验结果六、注意事项（自己总结实验过程中的注意点）七、思考题 1、平板菌落计数法中，为什么溶化后的培养基再冷却至45℃左右才能倒平板？

2、本次实验是否成功？如果失败，试分析原因。实验四简单染色一、实验目的二、实验原理三、实验材料（包括菌种、染料、玻璃器皿）四、实验步骤五、实验结果（黏贴染色结果图片并描述所观察到的细菌的显微形态）六、思考题 1、简单染色要获得成功，有哪些问题需要注意，为什么？实验五革兰氏染色一、实验目的二、实验原理三、实验材料（包括菌种、染料、玻璃器皿）四、实验步骤五、实验结果（黏贴染色结果图片并判断自己分离到的菌种是G还是G+-？）六、思考题 1、革兰氏染色要获得成功，有哪些问题需要注意，为什么？

食品微生物学实验技术思考题答案

食品微生物学实验技术思考题答案 1. 用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间加滴什么油?起什么作用？答：应该先用擦镜纸将镜头擦干净,以防上次实验的污染.操作时,先低倍再高倍.用完要擦掉油.加香柏油,作用是增加折光率,也就是增加了显微镜的分辨率.油的折光率和分辨率成反比(有公式),同时与波长成正比. 2. 列表比较低倍镜、高倍镜及油镜各方面的差异。为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作答：使用高倍镜和油镜时镜头距离标本较近，而粗调节器的调节幅度较大，粗调节器的误操作会使镜头大幅度向标本移动，很容易损坏标本和镜头。一般先用低倍镜找到物象后换到高倍镜，就只需要用细调节器了。 3. 什么是物镜的同焦现象？它在显微镜观察中有什么意义？答：在一般情况下，当物像在一种物镜中已清晰聚焦后，转动物镜转换器将其他物镜转到工作位置进行观察时，物像将保持基本准焦的状态，这种现象称为物镜的同焦。利用这种同焦现象，可以保证在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作距离短的物镜时仅用细调节器即可对物像清晰聚焦，从而避免由于使用粗调节器时可能的误操作而损坏镜头或载玻片。 4. 影响显微镜分辨率的因素有哪些？答：物镜的NA 值（物镜的数值孔径）与照明光源的波长 5. 根据你的实验体会,谈谈应如何根据所观察微生物的大小,选择不同的物镜进行有效地观察答：细菌用油镜，真菌用高倍镜。都是先用低倍镜找到目标后，再用高倍镜调到合适的视野和合适的清晰度。答：放线菌、酵母菌、多细胞真菌相对较大，用放大40 倍的物镜就可以看了，细菌小，要用放大1000 倍的物镜看，感觉还很小。病毒那就要用电子显微镜看了。 6. 哪些环节会影响革兰色染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？答：涂片环节、加热固定环节、脱色环节；其中最关键的环节是脱色环节 7. 进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题? 答：着色不均，染色效果不好。阴性阳性不明显分不太清楚,问题是：不便于显微镜下观察是阳性菌还是阴性菌 8. 革兰氏染色时，初染前能加碘液吗?乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色? 答：不可以。因为碘与染料会结合成大分子，使得染料分子不能穿过细胞的细胞壁，对

实验微生物接种技术

实验微生物接种技术一、目的：学习微生物工作的基本接种方法，建立纯培养技术中的“无菌”概念，掌握无菌操作技术。二、原理：所谓接种就是将一定量的纯种微生物在无菌操作条件下转移到另一已灭菌，并适宜于该菌生长繁殖所需的培养基上的过程。本实验要求严格进行无菌操作，一般是在无菌操作台或在实验室内火焰旁进行。根据不同的实验目的和培养方式，可以采用不同的接种工具和接种方法。三、实验材料：斜面培养基、液体培养基、平板培养基、记号笔、酒精灯、接种针、消毒酒精、涂布棒等。四、操作步骤（一）无菌操作菌种分离或移接工作应在无菌环境中进行，接种室、接种箱或超净工作台是常用的接种环境。用前先清洁好卫生，再进行消毒处理。可用紫外线灯和甲醛熏蒸的双重作用，或用3%来苏尔及其他表面消毒进行喷雾。操作者的手应先用肥皂洗净，再用酒精棉球消毒；整个操作过程都要靠近酒精灯火焰；接种工具在用前和用后必须在灯焰上灭菌；棉塞不得乱放，操作中只能夹在手上；不能有跑、跳等力度大的动作，以免引起空气大振动而增加染菌机会。（二）接种方法（1）斜面接种：从已长好微生物的菌种管移接到另一斜面管的方法。此法用于好气性微生物的接种。左手持菌种管和斜面管，使斜面向上，并尽量放平。用右手先将棉塞拧转松动，再拿接种环，用右手的小指、无名指和手掌拨下棉塞并夹紧，同时将管口在火焰上燃烧一圈，接种环灼烧灭菌后插入管内，冷却、挑菌，立即转入斜面管底部，沿斜面划曲线或直线。图1. 斜面接种示意图

（2）液体接种：由斜面菌接种到液体培养基（如试管或三角瓶等）中的方法。操作与上法基本一致，只是在将接种环送入液体培养基中时使环在液体与管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散，然后塞上棉塞，再轻轻摇动均匀，即可培养。如果菌种是培养在液体培养基中时，一般用移液管或滴管接种。（3）穿刺接种：用接种针挑取菌种后，插入深层固体培养基内，（不要刺到底部），再沿原路拔出，此法用于厌气性细菌接种、检查细菌的运动能力。（4）平板接种：将菌种接至培养皿的方法，平板接种的目的是观察菌落形态、分离纯化菌种，活菌计数以及在平板上进行各种试验时采用的一种接种方法，可分为下面几种： 1)斜面接平板 a.划线法：见平板划线分离法。 b.点种法：一般用于观察霉菌和酵母细胞，轻轻点在平板的表面（根霉点一点，曲霉、酵母可点3-4点）即可。 2)平板接斜面：一般是将经平板分散培养得到的单菌落接种到斜面，以便作鉴定或扩大培养、保存之用。五、思考题 1．何谓无菌操作？接种前应作哪些准备工作？ 2．总结几种接种方法的要点及应注意的事项？

实验二 微生物接种技术