流式细胞术检测体液T淋巴细胞亚群的临床应用

流式细胞术检测体液T淋巴细胞亚群的临床应用
流式细胞术检测体液T淋巴细胞亚群的临床应用

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?临床研究?流式细胞术检测体液T淋巴细胞亚群的临床应用

莫扬1,许小东2

(华中科技大学同济医学院附属裹樊医院检验科,湖北襄樊441021;2.卫生部北京医院流式细胞仪室100730)

【摘要】目的探讨胸水、腹水、肺泡灌洗液T淋巴细胞亚群的榆测方法及临床价值。方法采用流式细胞术检测良、恶性疾病患者的50例胸水、46例腹水、47例肺泡灌洗液(BALF)中T淋巴细胞亚群的水平并分组进行比较。结果1)胸水:结核性胸膜炎组胸水Ts细胞占T淋巴细胞的(27.36±6.41)%、Th细胞占T淋巴细胞的(67.98±7.41)%、Th/Ts比值为2.60±0.64,肺部恶性肿瘤组胸水Ts细胞占T淋巴细胞的(67.97士4.20)%、Th细胞占T淋巴细胞的(37.61±4.80)%、Th/Ts比值为0.47-4-0.10,与结核性胸膜炎组比较,恶性组Th、Th/Ts比值显著F降(P<0.01)而Ts显著升高(P<0.01);2)肺泡灌洗液:肺良性疾病组肺泡灌洗液Ts细胞占T淋巴细胞的(44.54-4-9.56)%、Th细胞占T淋巴细胞的(49.28-+4-12.88)%、Th/Ts比值为1.13±0.29,肺部恶性肿瘤组肺泡灌洗液Ts细胞占T淋巴细胞的(65.11±7.77)%、Th细胞占T淋巴细胞的(34.57±6.65)%、Th/Ts比值为0.54-4-0.19,与良性病变组比较,恶性组Th卜.降(P<o.05),Th/Ts比值显著卜.降(P<0.01),而Ts显著升高(P<0.01)。3)腹水:结核性腹膜炎组腹水Ts细胞占T淋巴细胞的(33.11±3.34)%、Th细胞占T淋巴细胞的(66.69±3.78)%、Th/Ts比值为2.03士0.28,恶性组腹水Ts细胞占T淋巴细胞的(56.64±9.34)%、Th细胞占T淋巴细胞的(35.86士3.30)%、Th/Ts比值为0.65±0.10,与结核性腹膜炎组比较,恶性组Th、Th/Ts比值显著F降(P<0.01),而Ts显著升高(P<o.01)。结论胸腹水、肺泡灌洗液T淋巴细胞亚群检测可用于分析性质并有助于评估患者局部免疫功能状态。

【关键词】支气管肺泡灌洗液;流式细胞术;T淋巴细胞哑群

中图分类号:R446.61文献标识码:A文章编号:1673—4130(2010)01—0050—02

InvestigationofTlymphocytesubsetsinfluidofthepatientsbyflowcytometry

MOYankl,XUXiao-dong2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,AfJ’iliatedxiangJanHospital,TD竹gJi

MedicineCollege,

HuazhongScienceandTechnologyUniversity,Xiangfan,Hubei441021,China)[Abstract]0bjectiveToevaluatethemethodoffloweytometricanalysisofTlymphocytesubsetsinbodyfluidofthepa—tients.MethodsInovdertogetTlymphocytesby3-colourstainingmethodutilizingSSC/CD3Percpantibody,47bronchoalveolarlavagefluidand50weretestedbyflowcytometery.Results1)ThepercentageofThis(67.98±7.41)%,Ts(27.36士6.41)%andTh/Ts(2.60±0.64)inBAI。Fwithlungcancer。andthepercentageofThis(37.61士4.8)%,Ts(67.97±4.20)%,andTh/Ts(0.47士0.10)inBALFwithlungcancerrespectively。andtheThcellsinBALFwithlungcancerwerelowerthanthoseinthebenignpulmonarydisorder(P<0.05)。andtheTh/TsratiowassignificantlylowerwhiletheTscellsweresignificantlyhigherinBALFoflungcancer(P<0.01),eompariedwiththebenignpulmonarydisorder;2)ThepercentageofThis(35.76+-7.71)%andTs(64.31士7.37)%andTh/Ts(0.57土0.18)inBALFwithlungcancer,andthepercentageofThis(49.27土12.88)%,Ts(44.54士9.56)oA,andTh/Tsis(1.13±0.29)inBALFwithbenignpulmonarydisorder.TheThcellsinBALFwithlungcancerwaslowerthanthoseinthebenignpulmonarydisorder(P<0.05),theTh/TsratioweresignificantlylowerandtheTscellsweresignificantlyhigherinBALFoflungcancer(P<0.01)compariedwiththebenignpulmonarydisorder;3)ThepercentageofThis(35.76士7.71)%,Tsis(64.31±7.37)%andTh/Tsare(0.57士0.18)inBALFwithlungcancer,andthepercentageofThis(49.27土12.88)%,Tsis(44.54±9.56)%,andTh/Tsis(1.13±0.29)inBALFwithbenignpulmonarydisorder.Respectively,theThcellsin

BALFwithlung

cancerwerelowerthanthosein

thebenignpulmonarydisorder(P<0.05),theTh/Tsratioweresignificantlylow—

erandtheTscellsweresignificantlyhigherinBALFoflungcancer(P<0.01)compariedwiththebenignpulmonarydisorder.Con‘clusionTheimmunityfunctioninthepatientswithlungcancerwassignificantlydecreased.FlowcytometrieapproachisvaluableinanalyzingTlymphocytesubsetsinBAI。F.

[Keywords]Bronchoalveolarlavagefluid;Flowcytometry;T-lymphocytesubsets

恶性浆膜腔积液确诊的金标准是在积液巾找到肿瘤细胞。然而在临床上,常有高度怀疑为恶性积液但未能找到肿瘤细胞的情况,从而影响到诊断的最终判断。笔者通过对患者胸水、腹水、肺泡灌洗液T淋巴细胞亚群的分析判断其性质,为临床恶性积液的诊断提供了一种检测指标,现报道如下。

资料与方法

1.标本来源病例为2006年6月至2007年12月在襄樊市巾心医院及卫生部北京医院呼吸科、消化科、肿瘤科住院治疗的相应疾病患者。1)胸水来源:肺癌20例(均经病理最终证实),年龄31~69岁,男17例,女3例。组织学分型:鳞癌14例。腺癌4例,小细胞癌2例;结核性胸膜炎30例,年龄26~68岁,男18例,女12例。刷检见结核杆菌(抗酸染色阳性)确诊。2)肺泡灌洗液来源:肺癌组25例(男15例、女10例),均经病理证实,年龄39~71岁;肺部良性疾病组22例(男15例、女7例),年龄28~70岁,其中肺结核8例、肺炎ll例、肺结节病3

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例。3)腹水来源:28例,平均年龄48岁,其中肝癌10例、胃癌

11例,结肠癌5例,卵巢癌2例,均经病理最终证实。

2.仪器试剂采用美国BDFACSCalibur流式细胞仪,

CD4FITC/CD8PE/CD3PerCP■色荧光抗体及同型对照、红细

胞裂解液、荧光校准微球均购自BD公司。

3.方法1)样晶的制备:肺泡灌洗液经尼龙布过滤去掉

杂质和痰液,胸水腹水以肝素抗凝采集,标本以1500r/rain离

心5min,弃上清液,PBS洗涤。计数并调节细胞数为2×106/

mL/管,加入cD4FITC/CD8PE/CD3PerCP荧光抗体20弘L,

窀温避光孵育20min,加1:9配制的红细胞裂解液2mI。,避

光10min,1500r/min离心5min,弃上清液,PBS缓冲液2

mI.离心洗涤,0.5mLPBS缓冲液重悬细胞。同时另一管做

同型对照。2)流式细胞仪测定:以荧光微球calibrite3-colour

校准仪器光路使其分辨率达到最佳工作状态,采用cellquest

Pro软件获取与分析数据。调节电压、阈值、补偿使细胞在图

中分布在合适的位置,在FSC/SSC图中圈出淋巴细胞群为

(R1),SSC/CD3图中以CD3+细胞群圈『J(R2)以排除巨噬细

胞、碎片及其他成分的干扰,建立CD4/CD3、CD8/CD3散点图

并设置为显示G3=RI×R2门内的细胞,获取细胞总数10000

个,根据I司型对照设十字门分析Th(CD3+CD4+)和Ts(CD3+

CD8+)的表达情况。同时计算出Th/Ts比值。3)统计分析:两

组数据统计以孑-4-_s表示,应用Excel统计软件进行统计学分

析,两组间比较采用£检验,P<o.05为差异有统计学意义。

结果

1.结核性胸膜炎与肺癌患者胸水T淋巴细胞亚群比较,

见表1。肺癌组与结核性胸膜炎组相比Th显著减少(P<

0.01),Ts显著增高(P<0.01),Th/Ts比值显著减低(P<

0.01)。

表1胸水T淋巴细胞亚群在结核胸膜炎及肺炎患者的表达

注:与结核性胸膜炎组比较。。P<0.01。

2.肺恶性肿瘤患者组和良性病变组的肺泡灌洗液T淋巴

细胞亚群的结果比较,见表2。恶性肿瘤患者肺泡灌洗液中T

淋巴细胞亚群与良性病变组比较Th下降(P<0.05),Th/Ts

比值显著下降(P<0.01),『『|iTs显著升高(P<0.01)。

表2肺泡灌洗液T淋巴细胞亚群在肺良性疾病及

肺部恶性肿瘤患者的表达

注:与肺部良性疾病组比较,。P<0.05,一P<0.01。

表3结核性腹膜炎及癌性腹水T淋巴细胞哑群的表达

注:与结核性腹膜炎比较,。P<0.01。

3.结核性腹膜炎及恶性腹水T淋巴细胞亚群的比较,见?51?

表3。恶性腹水组与结核性腹膜炎组相比Th显著减少(P<0.01),Ts显著增高(P<0.01),Th/Ts比值显著减低(P<0.01)。

讨论

某些疾病时人体浆膜腔会出现过多的液体积存,如肺结核、肺癌时引起胸腔积液,消化系统疾病时出现腹腔积液。肺部疾病患者进行支气管肺泡灌洗町采取到肺泡表面衬液,对这些液体性质的检测有助于疾病的诊断和鉴别诊断。

机体依靠各种免疫细胞之I.日j的相互协作和制约维持正常的免疫功能状态。恶性肿瘤患者普遍存在免疫功能低下,免疫细胞不能有效识别、排斥和杀灭肿瘤细胞是肿瘤发生的根本原因。抗肿瘤免疫以细胞免疫为主,T细胞在免疫监视、杀伤靶细胞及免疫调节方面具有极其重要的作用。T淋巴细胞进一步分化为辅助性T淋巴细胞(Th,CD3+CD4+)和细胞毒性T淋巴细胞(Ts,CD3+CDS+),对于抗原刺激的应答,辅助性T淋巴细胞分泌细胞因子,辅助诱导其他免疫细胞共同发挥抗肿瘤作用。近来研究发现,辅助性T淋巴细胞可被肿瘤细胞直接活化而不需要抗原呈递细胞系统,对肿瘤细胞也有直接杀伤作用,并且在机体的肿瘤免疫中有重要的记忆功能,对再次抗肿瘤免疫起决定性的作用【1],Th细胞数量减少造成T细胞产生细胞因子的能力下降,抗瘤效应明显降低,可使肿瘤细胞发生免疫逃逸;Ts细胞通过分泌抑制因子在免疫反应中起负相作用,抑制抗体形成及细胞免疫反应,还可以通过与Th细胞争夺IL一2等细胞因子来维持自身生长,造成效应性T细胞不能活化,肿瘤不被杀伤口]。细胞免疫功能改变往往敏感地表现在Th/Ts比值改变上,Th/Ts比值的下降被认为是疾病严重和预后不良的重要指标之一。正常情况下,T细胞及眶群的数目在周围组织中相对稳定,机体发生肿瘤时,肿瘤局部的微环境紊乱,Th、Ts平衡打破,表现为局部的Ts亚群增高,Th/Ts比值减低口4J。

本文资料显示,恶性腹水组、肺癌组胸水及灌洗液巾的Th、Th/Ts比值明显低于非恶性组,Ts细胞增高,说明肿瘤患者有抑制功能的T细胞增加杀伤肿瘤的T辅助细胞明显减少。随着肿瘤不断牛长,机体对肿瘤细胞产牛免疫耐受,加之肿瘤本身产生的一些免疫抑制闪子抑制免疫细胞的功能,从而导致机体免疫功能进行性下降[5],是肿瘤发生、发展的原因之一。

结核是由结核杆菌引起的一种感染性疾病,机体抗结核主要是T淋巴细胞介导的细胞免疫反应,本文资料显示结核性胸水及腹水中Th细胞显著增高,说明结核患者存在局部免疫力增强,这与淋巴细胞定向募集有关。黄泽信等[6]发现结核性胸腔积液巾II,16水平明显高于癌性胸腔积液中IL_16水平,并且胸腔积液中IL-16水平与CD4+细胞数呈正相关,提示胸腔积液中的IL-16有可能具有趋化CD4+细胞的作用,能够将CD4+细胞浸润到胸膜腔。

本文资料显示,肿瘤患者局部体液中Th/Ts比值减低而结核患者局部体液Th/Ts比值增高,说明肿瘤免疫和抗感染免疫虽然都足以细胞免疫为核心,但免疫反应的结果却是截然不同。体液和灌洗液T淋巴细胞亚群反映了患者局部免疫功能的异常,可作为判断性质的一项指标,『『|i流式细胞仪为我们提供r准确、快捷的检测手段。

参考文献:

[1]吉春宇,杨异,赵珩,等.手术对肺癌患者(下转第53页)

鬯堕丝堕堕堂垒查!!!!芏!旦笙!!鲞箜!塑!坐』!苎!!尘!:』!!竺翌丝!!:坠!:!!!垒堕!?53?

3.60例经拉米大定抗病毒治疗的患者血清HBV-I,P和出率差异无统计学意z(x2—0.25,P>0.05),结果见表3。HBVDNA的阳性结果分析:HBV—I。P和HBVDNA阳性检

表1HBVM、HBVDNA、HBVLP检测结果

表2200例HBsAg阳性血清

HBVDNA、HBV~I。P、HBeAg结果

表360例拉米大定治疗血清HBVDNA、HBV—LP结果

讨论

HBVDNA和HBeAg是日Ij{『临床用于反映HBV感染,复制的最耍标志,传统认为HBeAg转阴提示HIjV病毒停止复制。本研究显示,在HBeAg阴性组中部分标本仍存在DNA病毒复制,并且HBVDNA与HBVI。P的阳性差异无统计学意义,说明HBV—LP作为新的检测乙肝病毒复制的指标优于HBeAg,且与HBVDNA有较好的一致性,其可能原因:1)HBV为逃避宿宅的免疫反应常发生基因突变,HBV基闪前C区或CP区发生突变后不能合成HBeAg[3]。2)HBv-LP是HBVDane颗粒和亚病毒颗粒(管状颗粒)的主要包膜成分,可形成2个跨膜拓扑结构¨],在形成拓扑结构过程中,在胞质滞留的前S2区有机会与细胞中信号转导相关因子相互作用发挥其反式激活作用,这种反式激活作用与HBV病毒的复制程度密切相关,是HBV颗粒成熟包装的关键㈨。

拉米夫定是14前乙肝患者治疗的常用药。本研究显示,HBV-LP和HBVDNA在抗病毒治疗患者中,阳性检出率的一致性好,说明HBV-LP可用为一种新的指标判断乙肝患者抗病毒治疗的效果。

综上所述,血清HBV—LP测定是反映乙肝患者体内病毒复制、疗效和判断预后的新的敏感性指标,对指导临床乙肝的治疗具有较高的运用价值。

参考文献:

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(本文责任编辑陈开红收稿日期:2009—10-08)

(上接第51页)

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(本文责任编辑陈开红收稿日期:2009—10-08)

淋巴细胞亚群(详细资料)

机体免疫状态是衡量机体是否患病的重要指标,目前多采用流式细胞术来监测机体的免疫状态,其中最重要的指标是检测T、B和NK淋巴细胞的水平。 T细胞主要包括T辅助细胞(Th)和T抑制细胞(Ts)细胞亚群。CD3+细胞代表外周血中总的成熟T细胞,理论上应约等于CD4+细胞和CD8+细胞的总和,但往往出现CD4+加CD8+细胞之和大于CD3+,这是因为CD4+细胞包括CD3+/CD4+细胞(真正Th细胞)和CD3-CD4+细胞(非Ts细胞),而后者包括CD3-CD8+CD16+56+细胞(一部分NK细胞)和CD3-CD8+CD16+56-(未知细胞)。由此可见,真正的TH细胞是CD3+CD4+细胞,真正Ts细胞是CD3+CD8+细胞。尤其当患者NK细胞明显增加时,会使CD4细胞和CD8细胞的总和远大于CD3+细胞,因此,用三色荧光标记才能分析真正的辅助性T细胞和抑制性T细胞。 首先在淋巴细胞中识别出CD3细胞,然后在CD3细胞中再区分CD4+和CD8+细胞。NK细胞的表面无T细胞和B细胞表面标志,但有CD16和CD56等标志,用CD16+56抗体能鉴定出NK细胞(一定是CD3阴性),CD3-CD16+56+细胞才是真正的NK细胞。根据是否表达CD8,又可将NK细胞分为CD3-CD8+CD16+56+细胞(所占比例小,不影响CD8比例)和CD3-CD8-CD16+56+细胞(主要成分)。 B细胞的表面标志是CD19,理论上CD3-CD19+细胞才是真正的B淋巴细胞。但 CD3+CD19+细胞很少,可忽略不计,所以CD19+细胞就是B淋巴细胞。 在抗肿瘤效应中,CD4和CD8分别是T淋巴细胞的辅助/诱导细胞亚群与抑制/细胞毒细胞亚群,CD4细胞的主要功能是通过其分泌的淋巴因子,增强和扩大免疫应答过程,辅助诱导其它免疫细胞如杀伤性T细胞,B细胞等共同发挥抗肿瘤作用,CD4细胞的减少,导致免疫功能低下。CD4/CD8比值是重要的免疫状态监测指标,其比例的降低与免疫系统损害的程度相关。 CD4降低见于恶性肿瘤、遗传性免疫缺陷症、艾滋病、应用免疫抑制剂者;CD8降低见于自身免疫性疾病或变态反应性疾病;CD4/CD8比值升高见于恶性肿瘤、自身免疫性疾病、变态反应、病毒感染等;CD4/CD8比值降低见于艾滋病(常小于0.5)。监测器官移植排斥反应时,CD4/CD8比值升高预示可能发生排斥反应。

淋巴细胞亚群分析与临床---陈建林

一、流式淋巴细胞亚群检测的临床意义 1.了解不同情况下机体免疫功能状态 肿瘤(手术、放化疗患者的免疫功能检测) 感染(脓毒血症、重症监护患者等) 自身免疫病、免疫缺陷病等 不孕不育 某些血液系统疾病 其他:慢性肾病、骨髓移植恢复期等 2.辅助临床疾病的诊断 3.探索疾病的发病机理、病程及预后 4.观察监测疗效,指导临床建立治疗方案 二、淋巴细胞的分类及功能 B细胞(CD19+):体液免疫 辅助/诱导T细胞(Th):介导和增强免疫应答 (CD4+) 淋巴细胞T细胞(CD3+)细胞毒性(Tc) /抑制性T细胞(Ts): 抗病毒、抗肿瘤 (CD8+) 调节性T 细胞(Treg):抑制免疫应答、维持免疫耐受 (CD4+CD25+) NK细胞:抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节 (CD16+/CD56+) 三、流式淋巴细胞亚群检测的临床应用 淋巴细胞亚群检测与儿科疾病 (一)评估机体免疫功能状态 多种小儿疾病原发或继发疾病均存在T细胞异常,观察T细胞变化,对小儿疾病病因、发病机制以及协助临床诊断与治疗等具有重要价值。 类型指标CD3+ CD4+CD8+CD4+/CD8+细菌性肺炎↓↓↓↓↑↓↓ 支原体肺炎↓↓↓↓↓↓↓↓ 病毒性肺炎↓↓↓↓↓↓↓↓ 传单增多症↑↑↓↓↑↑↓↓ 支气管哮喘↑↓↑

T 细胞CD4、CD8、CD3 检测介入时间-----结合退热、消咳、肺罗音消失时间观察T 细胞变化,特别针对儿科患者可合理调节抗生素使用,改善预后,避免药物损伤. (二)原发性免疫缺陷病的早期识别和干预 1.流式细胞仪分析T细胞亚群(包括CD3+、CD4+和CD8+)、B细胞(CD19+) 和NK细 胞(CD16+/CD56+)比例等主要检查项目,可对大多数原发性免疫缺陷病患儿作出诊断。 2.评估免疫接种前机体免疫状态 案例:T/B细胞联合免疫缺陷患 儿,未评价免疫系统功能,直接 接种灭活疫苗,造成严重感染T 细胞CD4、CD8、CD3 检测介入时间-----结合患儿科反复感染的临床症状及时检测; 在疫苗接种前2-3天作出评估。 淋巴细胞亚群检测在肿瘤临床的应用 恶性肿瘤的发生、发展、转移与人体免疫功能下降密切相关。人体的抗肿瘤免疫以细胞 免疫为主,体内发挥抗肿瘤免疫作用主要由CD4和CD8细胞完成。 (一)评价肿瘤患者的整体免疫功能 1.肿瘤患者处免疫抑制状态,T淋巴细胞降低。 2.肿瘤患者T淋巴细胞与病程相关,随病程逐渐降低。 CD3、CD4、CD4/CD8细胞数下降程度:Ⅳ期> Ⅲ期> Ⅱ期>Ⅰ期3.肿瘤患者T淋巴细胞持续低下,转移率高、易复发

T淋巴细胞亚群检测操作程序

一、目的: 保证流式细胞仪检测外周血中T淋巴细胞亚群检验的工作质量,旨在保证正确的T淋巴细胞亚群检测标准操作程序和控制检测结果的精确度与准确度。 二、修改程序: 本标准操作程序的改动,可由任一使用本SOP的工作人员提出,并报经下述人员批准签字:质量主管、授权人(科主任),方可改动。 三、适用范围: 外周血中T淋巴细胞亚群的绝对计数检测。 四、实验原理: 人的T淋巴细胞根据其生物功能和细胞表面抗原的表达可分为二大类:辅助/诱导T细胞和抑制/细胞毒T细胞。辅助/诱导T淋巴细胞表达CD3和CD4;抑制/细胞毒T细胞表达CD3和CD8。利用各种单克隆抗体与淋巴细胞表面抗原结合,再配多色荧光染料以及绝对计数管,即可以把T淋巴细胞区分为两种亚型,进面得到各亚群的绝对值。 六、主要试剂: CD4-FITC/CD8-PE/CD3-APC/CD45-PC7 (美国BCs公司;CAT:IM3548), 七、实验操作: 1、标本采集:使用EDTA-K2抗凝真空采血管,抽取静脉血2ml。 2、染色和固定细胞: (1)标本管编号A,取一只流式专用管A1。 (2)A1管加入CD4-FITC/CD8-PE/CD3-APC/CD45-PC7 20ul。 (3)A1管中再加入全血100ul,混均。 (4)置室温,避光孵育15min。

(5)加入FACSLysing溶血液2.0ml,置室温,避光孵育10min。 (6)300g离心5min,弃上清液。 (7)PBS洗涤细胞两次,300g离心5min,弃上清液。 3、上机检测;分析结果;打印实验报告。 八、参考值: 总T细胞(CD3+):59.4-84.6 辅助/诱导T细胞(CD3+CD4+): 28.5-60.5 抑制/细胞毒T细胞(CD3+CD8+): 11.1-38.3 Th/Ts: 0.9-3.6 九、临床意义: T淋巴细胞可以分为辅助/诱导T细胞和抑制/细胞毒T细胞。测定CD4和CD8可用于化疗、自身免疫病的免疫监视。在造血干细胞移植患者中,CD4+细胞恢复晚于CD8+细胞,导致Th/Ts比例显著下降。HIV及某些病毒感染(EB病毒、SARS病毒等)患者Th/Ts比例也下降显著。 十、质量控制: 1、先用标准微球调整仪器,正确设置电压、补偿。 2、健康人CD4+细胞加CD8+细胞总数应大约等于CD3总数;免疫病、淋 巴瘤可能有较大差异。 3、收集细胞太少(少于500个)、碎片污染太多(超过10%)、门中淋巴细 胞不纯(小于90%)可能引起实验结果不正确。 4、建议使用逻辑设门方法(CD45-SSC设门与FSC-SSC设门)减少杂质的 干干扰。

淋巴细胞亚群检测

淋巴细胞亚群检测 检测对象 原则:免疫功能受损者均应常规评估淋巴细胞亚群 免疫功能包括: 免疫防御功能 免疫自稳和耐受功能 免疫监视功能 免疫防御功能受损 易发生感染 反复感染 严重感染 多种病原与特殊病原感染 常规治疗效果不佳的感染 除了宿主免疫防御受损容易造成上述少见感染状况之外,感染本身也可造成继发性免疫防御受损,因此免疫评估应注意原发和继发两方面的问题。 免疫自稳和耐受功能受损 过敏性疾病:并非所有这类患者都需要进行淋巴细胞亚群的检测。对于一些严重的过敏患者应考虑淋巴细胞亚群的检测。

①婴幼儿时期全身严重湿疹样表现。 ②嗜酸性粒细胞显著增多 ③血清IgE水平明显增高(IgE>1000IU/L) ④伴有反复、严重感染的患者 自身免疫和自身炎症性疾病 ①存在难以控制的自身免疫反应情况及出现明显的自身免疫性淋巴增殖情况 ②合并反复感染的患者 ③存在自身炎症反应 ④长期免疫抑制药物、生物制剂使用前后 免疫监视功能受损 主要引起肿瘤 血液系统肿瘤:儿童时期最为多见的是血液系统肿瘤 其他肿瘤及实体瘤:其他系统肿瘤患者也应酌情进行淋巴细胞亚群的检测,既可能存在原发性淋巴细胞亚群的异常,也可能出现继发性改变,尤其是进行各种化疗时,淋巴细胞亚群大多会受到影响 其他特殊情况 血常规中淋巴细胞明显异常 家族成员中有免疫缺陷病史

长期使用免疫抑制剂者 淋巴细胞亚群分析结果判读,应对淋巴细胞亚群的相对计数和绝对计数分别进行判别。 结果分析 (一)基本数据判断 1.相对计数的3个基本公式: FCM检测淋巴细胞亚群结果应首先根据下述3个公式进行评估[15]。公式1: CD3+%+CD19+%+CD16+/CD56+%=100%±5% 公式2:CD4+%+CD8+%=CD3+%±5% 公式3:CD4+/CD8+比值>1.0(1.5~2.0,新生儿期可达4.0) 2.相对计数基本公式意义: (1) CD3+%+CD19+%+CD16+/CD56+%明显大于或小于100%±5%,提示检测系统异常或存在明显淋巴细胞亚群异常。(2) CD4+%+CD8+%之和明显大于或小于CD3+%±5%,提示存在双阳性(CD4+CD8+)或双阴性(CD4-CD8-)T淋巴细胞。(3)一般情况CD4+/CD8+比值>1,年龄越小CD4+/CD8+比值越大。CD4+/CD8+比值<1,提示T淋巴细胞亚群存在异常。 3.绝对计数的判断: 绝对数标准不同仪器和年龄段及人群存在差别。个体间变化也比较大。各个实验室所采用的标准有所不同。应根据实验室的参考范围进

流式细胞术检测体液T淋巴细胞亚群的临床应用

?50?垦竖垫墼堕堂垄查!!!!生!旦箜!!鲞箜!塑丛』!坐!!型!』竺!!!型垫!!!y堕:!!:垒坠! ?临床研究?流式细胞术检测体液T淋巴细胞亚群的临床应用 莫扬1,许小东2 (华中科技大学同济医学院附属裹樊医院检验科,湖北襄樊441021;2.卫生部北京医院流式细胞仪室100730) 【摘要】目的探讨胸水、腹水、肺泡灌洗液T淋巴细胞亚群的榆测方法及临床价值。方法采用流式细胞术检测良、恶性疾病患者的50例胸水、46例腹水、47例肺泡灌洗液(BALF)中T淋巴细胞亚群的水平并分组进行比较。结果1)胸水:结核性胸膜炎组胸水Ts细胞占T淋巴细胞的(27.36±6.41)%、Th细胞占T淋巴细胞的(67.98±7.41)%、Th/Ts比值为2.60±0.64,肺部恶性肿瘤组胸水Ts细胞占T淋巴细胞的(67.97士4.20)%、Th细胞占T淋巴细胞的(37.61±4.80)%、Th/Ts比值为0.47-4-0.10,与结核性胸膜炎组比较,恶性组Th、Th/Ts比值显著F降(P<0.01)而Ts显著升高(P<0.01);2)肺泡灌洗液:肺良性疾病组肺泡灌洗液Ts细胞占T淋巴细胞的(44.54-4-9.56)%、Th细胞占T淋巴细胞的(49.28-+4-12.88)%、Th/Ts比值为1.13±0.29,肺部恶性肿瘤组肺泡灌洗液Ts细胞占T淋巴细胞的(65.11±7.77)%、Th细胞占T淋巴细胞的(34.57±6.65)%、Th/Ts比值为0.54-4-0.19,与良性病变组比较,恶性组Th卜.降(P<o.05),Th/Ts比值显著卜.降(P<0.01),而Ts显著升高(P<0.01)。3)腹水:结核性腹膜炎组腹水Ts细胞占T淋巴细胞的(33.11±3.34)%、Th细胞占T淋巴细胞的(66.69±3.78)%、Th/Ts比值为2.03士0.28,恶性组腹水Ts细胞占T淋巴细胞的(56.64±9.34)%、Th细胞占T淋巴细胞的(35.86士3.30)%、Th/Ts比值为0.65±0.10,与结核性腹膜炎组比较,恶性组Th、Th/Ts比值显著F降(P<0.01),而Ts显著升高(P<o.01)。结论胸腹水、肺泡灌洗液T淋巴细胞亚群检测可用于分析性质并有助于评估患者局部免疫功能状态。 【关键词】支气管肺泡灌洗液;流式细胞术;T淋巴细胞哑群 中图分类号:R446.61文献标识码:A文章编号:1673—4130(2010)01—0050—02 InvestigationofTlymphocytesubsetsinfluidofthepatientsbyflowcytometry MOYankl,XUXiao-dong2 (1.DepartmentofClinicalLaboratory,AfJ’iliatedxiangJanHospital,TD竹gJi MedicineCollege, HuazhongScienceandTechnologyUniversity,Xiangfan,Hubei441021,China)[Abstract]0bjectiveToevaluatethemethodoffloweytometricanalysisofTlymphocytesubsetsinbodyfluidofthepa—tients.MethodsInovdertogetTlymphocytesby3-colourstainingmethodutilizingSSC/CD3Percpantibody,47bronchoalveolarlavagefluidand50weretestedbyflowcytometery.Results1)ThepercentageofThis(67.98±7.41)%,Ts(27.36士6.41)%andTh/Ts(2.60±0.64)inBAI。Fwithlungcancer。andthepercentageofThis(37.61士4.8)%,Ts(67.97±4.20)%,andTh/Ts(0.47士0.10)inBALFwithlungcancerrespectively。andtheThcellsinBALFwithlungcancerwerelowerthanthoseinthebenignpulmonarydisorder(P<0.05)。andtheTh/TsratiowassignificantlylowerwhiletheTscellsweresignificantlyhigherinBALFoflungcancer(P<0.01),eompariedwiththebenignpulmonarydisorder;2)ThepercentageofThis(35.76+-7.71)%andTs(64.31士7.37)%andTh/Ts(0.57土0.18)inBALFwithlungcancer,andthepercentageofThis(49.27土12.88)%,Ts(44.54士9.56)oA,andTh/Tsis(1.13±0.29)inBALFwithbenignpulmonarydisorder.TheThcellsinBALFwithlungcancerwaslowerthanthoseinthebenignpulmonarydisorder(P<0.05),theTh/TsratioweresignificantlylowerandtheTscellsweresignificantlyhigherinBALFoflungcancer(P<0.01)compariedwiththebenignpulmonarydisorder;3)ThepercentageofThis(35.76士7.71)%,Tsis(64.31±7.37)%andTh/Tsare(0.57士0.18)inBALFwithlungcancer,andthepercentageofThis(49.27土12.88)%,Tsis(44.54±9.56)%,andTh/Tsis(1.13±0.29)inBALFwithbenignpulmonarydisorder.Respectively,theThcellsin BALFwithlung cancerwerelowerthanthosein thebenignpulmonarydisorder(P<0.05),theTh/Tsratioweresignificantlylow— erandtheTscellsweresignificantlyhigherinBALFoflungcancer(P<0.01)compariedwiththebenignpulmonarydisorder.Con‘clusionTheimmunityfunctioninthepatientswithlungcancerwassignificantlydecreased.FlowcytometrieapproachisvaluableinanalyzingTlymphocytesubsetsinBAI。F. [Keywords]Bronchoalveolarlavagefluid;Flowcytometry;T-lymphocytesubsets 恶性浆膜腔积液确诊的金标准是在积液巾找到肿瘤细胞。然而在临床上,常有高度怀疑为恶性积液但未能找到肿瘤细胞的情况,从而影响到诊断的最终判断。笔者通过对患者胸水、腹水、肺泡灌洗液T淋巴细胞亚群的分析判断其性质,为临床恶性积液的诊断提供了一种检测指标,现报道如下。 资料与方法 1.标本来源病例为2006年6月至2007年12月在襄樊市巾心医院及卫生部北京医院呼吸科、消化科、肿瘤科住院治疗的相应疾病患者。1)胸水来源:肺癌20例(均经病理最终证实),年龄31~69岁,男17例,女3例。组织学分型:鳞癌14例。腺癌4例,小细胞癌2例;结核性胸膜炎30例,年龄26~68岁,男18例,女12例。刷检见结核杆菌(抗酸染色阳性)确诊。2)肺泡灌洗液来源:肺癌组25例(男15例、女10例),均经病理证实,年龄39~71岁;肺部良性疾病组22例(男15例、女7例),年龄28~70岁,其中肺结核8例、肺炎ll例、肺结节病3

流式细胞术检测淋巴细胞亚群操作规程

流式细胞术检测淋巴细胞亚群操作规程 一、编号:JS0604 二、标题:流式细胞术检测淋巴细胞亚群操作规程 三、关键词:流式细胞术淋巴细胞操作规程 四、目的:规范流式细胞术检测淋巴细胞亚群的实验操作 五、背景知识:T细胞亚群变化的临床意义主要表现在肿瘤、自身免疫性疾病中。在感染性疾病中,因为CD4+ T细胞是辅助、诱导T细胞的标志,CD4+ T 细胞下降常见于某些病毒感染性疾病,如AIDS、巨细胞病毒感染、瘤型麻风。而CD4+ T细胞长期低于正常水平,常提示患者易于被病毒等微生物侵袭。CD8+是抑制、杀伤T细胞的标志,在传染性单核细胞增多症、巨细胞病毒感染、慢性乙型肝炎等感染性疾病中,CD8+ T细胞常升高。CD4+/CD8+细胞比值下降,除肿瘤等疾病外,常见于AIDS、瘤型麻风、传染性单核细胞增多症、巨细胞病毒感染、血吸虫病等。 六、原理:利用不同荧光物质标记的抗CD3、CD4、CD8单克隆抗体,与待测成分作用,然后上流式细胞仪检测待测细胞。待测细胞随流动室内的流动鞘液排列成单列,一个个迅速通过激光聚焦区,激光在对每个细胞进行照射时可同时得到前向角散射和侧向角散射2种散射光以及激发荧光标记物质发出的信号,利用这些信号,可计算出CD3+、CD4+、CD8+的相对含量,从而得出各细胞群的相对比值。 七、仪器设备和材料:肝素抗凝静脉血1ml,不同荧光素标记的抗CD3、CD4、CD8单克隆抗体,同型阴性对照荧光物,溶血剂,固定剂,流式细胞仪。 八、操作步骤 1、100μ1抗凝血加20μl荧光单克隆抗体,同时做阴性对照。 2、避光室温作用20min,溶去红细胞后,固定剂固定。 3、上流式细胞仪测定,以阴性对照测出本底参数,调节荧光补偿,设定阳性参数值,软件将计算出阳性表达细胞比例。 九、注意事项 1、为保证所得结果的可靠性,每次试验前应以标准荧光微球检测仪器的变异系数。

BD流式临床检测分析-外周血淋巴细胞亚群分析

BD流式细胞术临床应用研究—外周血淋巴细胞亚群分析 临床背景: 淋巴细胞是机体细胞免疫和体液免疫应答的重要细胞成分。正常情况下,各淋巴细胞亚群(包括T细胞、B细胞、NK细胞等)可维持一定数量和比例,相互作用,稳定调节,维持着机体的正常免疫功能。当不同淋巴细胞亚群的量及功能发生异常改变时,机体会产生一序列病理变化和免疫功能障碍,导致疾病的发生。相反,测定淋巴细胞亚群的变化,也能对疾病早期诊断和控制、临床治疗指导等提供理论依据和数据支持。利用流式细胞术对外周血淋巴细胞亚群分析已广发应用月多种疾病的辅助诊断,如恶性肿瘤、血液病、自身免疫和免疫缺陷病等,对分析发病机理、观察疗效及监测预后等也具有重要意义。 检测目的: 分析外周血淋巴细胞亚群,了解患者免疫功能的异常,辅助临床诊断和治疗 常用检测项目及抗体使用: 总T细胞(CD3+):正常值50-84%。细胞降低见于恶性肿瘤、自身免疫疾病、先天性免疫缺陷等;细胞增高见于慢性活动性肝炎、重症肌无力等;所需抗体为CD3。 总B细胞(CD3-/CD19+):正常值5-18%。细胞增多见于自身免疫性疾病;细胞降低见于传染性单核细胞增多症等;所需抗体为CD3和CD19. T辅助/诱导淋巴细胞(CD3+/CD4+):正常值27-51%。细胞减少见于恶性肿瘤;抗体为CD3和CD4。 T抑制/毒性淋巴细胞(CD3+/CD8+)正常值15-44%。细胞增多见于自身免疫性疾病;抗体为CD3和CD8

T辅助:T抑制细胞(CD4+:CD8+):正常值1.4-2.0。比值降低见于艾滋病、SLE肾病、传染性单核细胞增多症、急性巨细胞病毒感染、骨髓移植恢复期等;逼孩子增高见于类风湿性关节炎、I型糖尿病等; NK细胞(CD3-/CD16+/CD56+):正常值7-40%,细胞降低见于恶性肿瘤特别是中晚期伴转移的肿瘤,免于缺陷病及使用免疫抑制剂等;抗体为CD3、CD16和CD56。 自然杀伤性T细胞(CD3+/CD56+/CD16+):正常值2-13%,具有NK细胞和T细胞的标志,参与对细菌和寄生虫的反应,在控制病毒性感染中也发挥作用;抗体同6。 活化总T细胞(CD3+/HLA-DR+)和活化的单核细胞(CD14+/HLA-DR+):正常值1.2-5.8%;抗体为CD3、CD14和HLA-DR。 调节性T细胞(CD4+/CD25+/Foxp3+):正常值为占CD4+淋巴细胞的比例5-10%。Treg 细胞的数量减少或者功能异常具有可能导致自身免疫病的发生,可用于骨髓移植术前术后的跟踪;抗体为CD4、CD25和Foxp3。 细胞毒T细胞(CD8+/CD28+)和抑制性T细胞(CD8+/CD28-):正常值分别为8.6-15.5%和9.9-24.8%。可作为一些自身免疫性疾病、艾滋病及免疫缺陷的免疫检测指标,CD28+亚群随HIV病程发展时数量降低,急性乙肝患者外周血CD8+/CD28+细胞呈现明显的升高;抗体为CD8和CD28。 T辅助细胞诱导亚群(CD4+/CD45RO+):正常值9.8-26%;某些病毒感染性疾病处于进展期是它的数量增加,接收抗病毒治疗后数量会下降;抗体为CD4和CD45RO。 抑制细胞诱导亚群(CD4+/CD45RA+):正常值15-25% 凋亡亚群(CD95+):正常值为占CD4+淋巴细胞的比例20-50%;CD95是介导细胞凋亡的主要受体,凋亡亚群可评价细胞的凋亡情况。抗体为CD95。 血液标本要求

流式细胞术分析比较癌症患者新鲜和冻存复苏后外周血淋巴细胞亚群的实验研究

龙源期刊网 https://www.360docs.net/doc/7a2535761.html, 流式细胞术分析比较癌症患者新鲜和冻存复苏后外周血淋巴细胞亚群的实验研究 作者:魏天雪于鸿何春莹刘玉侠 来源:《中国现代医生》2015年第29期 [摘要] 目的建立标准化的实验和分析方法,采用流式细胞术比较分析癌症患者新鲜和冻 存复苏后的外周血淋巴细胞亚群的差异。方法于2014年6~12月收集肺恶性肿瘤患者静脉血样本(2 mL/样本),每个样本取300 μL全血用于淋巴细胞亚群分析;剩余全血经裂解红细胞后冻存(40%或90%胎牛血清)。30 d后复苏细胞,流式细胞术分析淋巴细胞亚群变化。结果复苏并培养24 h后,癌症患者PBMC的存活率分别为(67.70±2.80)%(90% FCS)和(80.47±3.32)% (40% FCS,P=0.0069)。新鲜和冻存的的外周血CD3+、CD3+CD4+、 CD3+CD8+、CD3-CD16+56+、CD3+CD16+56+和CD4+CD25+ T细胞的百分率之间无显著差异(P>0.05,n=8,40%FCS)。结论短期冻存癌症患者的PBMC可用于后续检测T淋巴细胞亚群,尤其对于晚期癌症患者而言,可避免多次采血造成的负担同时提高实验的一致性。此外,本实验建立的方法也可用于临床抗肿瘤免疫治疗和其他免疫监测。 [关键词] PBMC;细胞冻存和复苏;淋巴细胞亚群;流式细胞术 [中图分类号] R329.2;R697.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2015)29-0029-03 Comparative analysis of lymphocyte subsets between fresh and frozen cancer patients PBMC by flow cytometry WEI Tianxue YU Hong HE Chunying LIU Yuxia Jilin Tumor Institute, Changchun 130012,China [Abstract] Objective To develop a protocol to comparative analysis of lymphocyte subsets between fresh and cryopreserved cancer patients PBMC for immunological studies by flow cytometry. Methods Blood samples (2 mL/sample) from lung malignant tumor patients were collected by venipuncture from June to December 2014. For each sample,300 μL of fresh whole blood was immediately used for lymphocyte subsets analysis. While the remaining were lysed and the isolated PBMC were cryopreserved with 40% or 90% FCS. Following storage for 30 days, the samples were removed and quickly thawed in 37℃ water bath. After cultured for 24 h, the cells were stained with antibodys. The analysis was performed using an Epics XL/MCL flow cytometry(Beckman Coulter). Results After separating, the cell recovery of PBMC was(67.70±2.80)% of 90% FCS vs (80.47±3.32)% of 40% FCS(P=0.0069). There were no significant differences in the frequencies of CD3+,CD3+CD4+,CD3+CD8+,CD3-CD16+56+,CD3+CD16+56+,and CD4+CD25+ T cells between the fresh and frozen PBMC(P>0.05,n=8,40% FCS). Conclusion

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