人工酶

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• 维生素 B6 通常以磷酸化的形式参与转氨酶的催化反应
• 维生素 B6 自身即能实现转氨基作用,但缺乏底物结合位点, 高效的转氨酶模型必须具有合适的底物结合部位,环糊精的空 腔能够为底物提供良好的结合位点 • 1980 年报道了第一个人工转氨酶模型,它具有良好的底物选 择性,可以使反应加速 200 倍
1.设计催化retro-aldol反应的酶:
http://www.bakerlab.org/system/files/jiang08A.pdf
2.设计催化Kemp elimination的酶:
http://www.bakerlab.org/system/files/r%C3%B6thlisberger08A.pdf
环糊精酶模型 —— 酰基水解酶(acyl-hydrolase)
• 1970 年,Breslow 设计出第一个环糊精酶模型,能催化对硝 基乙酰苯酯的水解,反应速率比无催化剂时快 103 倍
环糊精酶模型 —— 转氨酶(transaminase)
• 转氨酶以维生素 B6(吡哆醛 / 吡哆胺)为辅酶,催化氨基在 氨基酸和酮酸之间转移
分子印迹酶
分子印迹技术(molecular imprinting technology,MIT) 是指制备对某一特定的目标分子具有特异选择性的聚合物的过程, 形象地说,就是“锁-钥匙”的识别和制造过程 (a) 模板 (template, T) 和功能单体 (monomer, M) 发生互 补识别 (b) 在印迹分子周围,单体发生聚合反应 (c) 从聚合物中溶解或分解去除印迹模板 (d) 模板分子和印迹位点的重新结合,这是(c)的逆过程
分子印迹酶
印迹底物及其类似物
• 将 4(5)-乙烯基咪唑聚合可以得到一种模
拟氨基酸酯水解酶的印迹聚合物,可选
择性水解与印迹分子结构相关的氨基酸 酯底物 [N-Boc-氨基酸对硝基苯酯]
• 由于底物在单体聚合时可能发生水解,
因此用其结构类似物 [N-Boc-氨基酸-2吡啶甲酰胺] 为印迹分子 • 聚合后抽提除去模板,在聚合物孔穴内 的特定距离位置留下咪唑基(聚合物骨 架),能起到催化基团的作用
来是提高酶活力的关键
O O HO HO
O
P
OH O
CH3
CH3
O O N H N H O N H O CH3 O C N H O H O N H CH3 N H3C CH3 N N H
分子印迹酶的应用
1. 色谱分离
最广泛的应用之一是利用其特异的识别功能去分离混合 物。其适用的印迹分子范围广,无论是小分子(如氨基酸、药品和碳氢化
分子印迹酶
什么是“分子印迹酶(molecular imprinting enzyme)”?
• 通过分子印迹技术可以产生类似于酶的活性中心的空腔,对底
物产生有效的结合作用,并可以在结合部位的空腔内诱导产生 催化基团,并与底物定向排列
• 分子印迹酶面临的最大挑战之一是如何利用分子印迹技术来模
拟复杂的酶活性中心部位,使其最大限度地与天然酶相似,即 选择合适的印迹分子是关键的一环 – 底物 – 底物类似物 – 酶抑制剂 – 反应过渡态类似物
上的化学物通过分子间力(静电作用、氢键、范德华力等非共价
键)相互作用缔结而成的具有特定结构和功能的超分子体系的科 学
四、人工酶的分类
– 人工酶的分类 —— Kirby 分类法
• 单纯酶模型(enzyme-based mimics):以化学方法通过天然 酶活性的模拟来重建和改造酶活性 • 机理酶模型(mechanism-based mimics):通过对酶作用机 制诸如识别、结合和过渡态稳定化的认识,来指导酶模型的设 计和合成 • 单纯合成的酶样化合物(Synzyme):化学合成的具有类似于 酶催化活性的简单分子
杯芳烃
•1942年金克(Zinke,奥地利)首次合成得到,因其结构像一个酒杯而被 古奇(C.D.Gutscht,美国)称为杯芳烃
•绝大多数的杯芳烃熔点较高,在250℃以上。在常用的有机溶剂中的溶 解度很小,几乎不溶于水。杯芳烃具有大小可调节的“空腔”,能够形 成主-客复合物,与环糊精、冠醚相比,是一类更具广泛适应性的模拟酶, 被称为继冠醚和环糊精之后的第三代主体化合物
• 反胶束:在非极性有机相中形成的,表面活性分子的
非极性基团在外与有机溶剂接触,而极性基团则排列 在内形成一个极性核
胶束酶模型的基本原理
•胶束在水溶液中提供了疏水微环境(胶束内核),类似于酶的 结合位点,底物可以结合在此疏水位点上
•如果将催化基团(羟基、巯基、氨基、咪唑基等)或一些辅酶 共价连接或吸附在胶束上,就有可能提供“活性中心”部位,使 胶束成为具有酶活力的模拟酶 •X 射线晶体衍射表明,胶束的结构与球蛋白类似,胶束对非极 性化合物的增溶作用所需的能量与球蛋白也很接近 •胶束模拟酶一方面利用增溶、增稳的增效作用,使酶活性呈现 “超级活性” 。另一方面,利用胶束介质(尤其是反相胶束介 质)模拟天然酶在生物体内活体细胞中的微环境
– 人工酶的分类 —— 按属性分类
• 主-客体酶和酶模型 (由大环及带空穴的化合物构成的超分子主-
客体结构)
• 胶束酶模型 (将催化基团连接在胶束上,提供“活性中心”)
• 肽酶
• 半合成酶 • 分子印迹酶 (以某一分子为模板,周边聚合交联后,除去模板留下
特定形状空穴)
• 抗体酶 具有催化作用的人工构建的抗体
人工模拟酶
artificial enzyme
目录
一、人工酶的概念
二、人工酶的发展简史
三、人工酶的理论基础 四、人工酶的分类与介绍
一、人工酶的概念
• 人工(模拟)酶(artificial enzyme):根据酶
的催化原理,模拟酶的生物催化功能,用有机化
学和生物学的方法合成具有专一催化功能的物质
二、人工酶的发展简史
作为第三代主体超分子化合物,杯芳烃具有独特的空穴结构,与冠醚 和环糊精相比具有如下特点:
① 它是一类合成的低聚物,它的空穴结构大小的调节具有较大的自 由度
② 通过控制不同反应条件及引入适当的取代基,可固定所有需要的 构象 ③ 杯芳烃的衍生化反应,不仅在杯芳烃下缘的酚羟基、上缘的苯环 对位,而且连接苯环单元的亚甲基都能进行各种选择性功能化,这不 仅能改善杯芳烃自身水溶性差的不足,而且还可以改善其分子络合能 力和模拟酶活力
肽酶
模拟天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的多肽。
1977年Dhar等人报道,人工合成的Glu—Phe—Ala— Glu—Glu—Ala—Ser—Phe八肽具有溶菌酶的活性。其活 性为天然溶菌酶的50%
http://www.bakerlab.org
西雅图华盛顿大学(University of Washington)的David Baker团队 David Baker所开发的蛋白“全新”设计(De Novo Design)采用了一 个算法,叫做RosettaMatch。和很多Rosetta的算法一样, RosettaMatch是一个基于“已有知识”的搜素算法。而这里的“已有知 识”是已经解析出来的蛋白质结构。
• 常见的环糊精主要有 -、- 和 -CD
OH HO O O HO OH OH O HO OH O OH O HO OH OH OH O O O HO OH O OH O HO OH O HO HO OH OOH OH OH O O OH HO O O OH HO HO OH HO O OH O HO O OH O OH OH O HO O OH HO O OH O HO O OH O HO O OH O OH OH OH O OH OH O OH O O OH OH OH O O OH
• 1970年,第一个以环糊精为基本结构的模拟酶诞生 • 从 1970s 开始, Breslow 课题组对模拟酶进行了大量研究,
取得丰硕的成果,为人工酶的设计和应用作出了巨大贡献
Ronald Breslow (1931-)
• 1967 年,Pedersen 报道了冠醚与碱金属离子的配 合物 • 1973 年,Cram 提出“主-客体化学”的概念 • 1978 年,Lehn 引入术语“超分子化学”来定义 “分子间组装体和分子间作用力的化学” —— 1987 年,上述三人共同获得诺贝尔化学奖
主-客体酶模型
大环及穴状配合物酶模型
人工合成的宿主分子,具有酶模型的特性。如冠醚、穴醚、环
番、杯芳烃等大环多齿配体。具有底物识别能力和催化基团。
• 冠醚最大的特点就是能与正离子,尤其是与碱金属离子络合,并且随 环的大小不同而与不同的金属离子络合。 • 例如,安息香在水溶液中的缩合反应产率极低,如果在该水溶液中 加入7%的冠醚,则可得到产率为78%的安息香;若上一反应在苯 (或乙腈)中进行。如果加入18-冠-6,产率可高达95%。
– 分子印迹技术与人工酶
• 1972 年,Wulff 研究组制备出第一个分子印迹聚合物
• 1987 年,Mosbach 研究组制备出第一个分子印迹酶,用于 对硝基苯基酯类的水解
• 目前对人工酶的研究已经涵盖了六大类酶,已设计并制备出的
人工酶多达数千种
三、人工酶的理论基础
• 酶学基础:酶的结构和酶学性质。 • “主-客体”化学(Host—Guest Chemistry):主体有选择地识别 客体并与之通过弱相互作用力形成稳定复合物的化学领域 • 超分子化学(supra molecular chemistry):研究两种或两种以
O HO HO
来自百度文库
OH O HO
O OH O OH O OH O
OH O OH O
HO
-cyclodextrin
-cyclodextrin
-cyclodextrin
主-客体酶模型
环糊精酶模型 • 环糊精的分子呈截锥形
• 所有的羟基 —OH 构成环糊精的亲水表面
• 碳链骨架构成了环糊精的疏水内空腔
分子印迹酶
印迹过渡态类似物
• 利用分子印迹技术印迹磷酸单酯(充当
酯水解过渡态类似物),通过与含脒基 (催化部位)的功能单体结合,形成稳 定的复合物。此印迹酶表现出很强的酯 水解活性 • 适当地设计模板分子和催化基团,将稳
N H O N H O CH3 N H O P N H O O CH3
定过渡态和催化基团的准确定位结合起
④ 杯芳烃的热稳定性及化学稳定性好,可溶性虽较差,但通过衍生 化后,某些衍生物具有很好的溶解性 ⑤ 杯芳烃能与离子和中性分子形成主一客体包结物,这是集冠醚和 环糊精两者之长 ⑥ 杯芳烃的合成较为简单,可望获得较为廉价的产品,事实上现在 已有多种杯芳烃商品化
胶束人工酶
胶束(micelle)的结构
胶束由表面活性物质聚集而成,分子中通常包含亲水基和 亲油基两部分 • 亲水基:带电基团或极性基团 • 亲油基:含有 8 个碳原子以上的碳链 胶束(micelle)和反胶束(reverse micelle) • 胶束 / 正胶束:在水相中形成的亲油基向内,亲水基 向外,在水中稳定分散的表面活性分子聚集体
人工酶的介绍
– 基于主-客体结构的酶模型
• 环糊精酶模型
• 大环及穴状配合物酶模型
– 胶束人工酶
– 分子印迹酶 – 肽酶
主-客体酶模型
环糊精(cyclodextrin,CD)酶模型
• 环糊精:是直链淀粉在由芽孢杆菌产生的环糊精葡萄糖基转移
酶作用下生成的一系列环状低聚糖的总称 • 相邻葡萄糖基之间通过 -1,4-糖苷键连接
印迹分子的强度与选择性在一定程度上可以和抗原与抗体之间的 作用相媲美,因而可用于抗体模拟,这种模拟抗体制备简单、成本低, 在高温、酸碱及有机溶剂中具有较好的稳定性,此外还可以重复使用。
分子印记酶的局限性
• 缺乏酶的柔性,催化效率不高 • 单体与模板之间形成的次级作用力小,影响聚合物对反应底
物的识别能力
合物等)还是大分子(如蛋白质等)已被应用于各种印迹技术中
2. 固相萃取
通常样品的制备都包括溶剂萃取,由于分子印迹技术的 出现,这可以用固相萃取代替,并且可利用分子印迹聚合物选择性富集
目标分析物。由于印迹聚合物即可在有机溶剂中使用,又可在水溶液中
使用,故与其他萃取过程相比,具有独特的优点。
3.天然抗体模拟
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