植物遗传转化研究进展

植物遗传转化研究进展

重庆师范大学生命科学学院生物科学（师范）专业 2009级

指导教师

摘要：植物遗传转化是一项农业生物技术，它通过某种途径或技术将外源基因导入受体细胞的全基因组中，并使之在受体细胞中得以充分表达。目前一些重要农作物转基因品种已经或即将投入到实际应用，随着研究的不断深入,本文对植物遗传转化的技术作出了新的展望。

关键词：植物遗传转化；植物遗传转化方法；应用；进展

Abstract：Plant genetic transformation is a kind of agricultural biotechnology.It delivers to the whole-genome of receptor cells through a certain approach or technique to make the exogenous genes fully expressed in receptor cells. At present, genetically modified varieties of some important crops have been or are about to put into the practical use. with the deepening of the research,this paper makes a new outlook of the plant genetic transformation technology.

Key words: Plant genetic transformation; the approaches of plant genetic transformation; application; progress

植物遗传转化是指以植物的器官、组织、细胞或原生质体作为受体，通过某种技术或途径转入外源基因，获得使外源基因稳定表达的可育植株。遗传转化也称为转基因技术。转基因植物的研究始于20世纪70年代。到了20世纪80年代，由于基因操作技术的提高和目的基因构建模式等内容的基本完成，植物转基因技术便应运而生。1983年获得了第一例转基因烟草，使植物基因工程发生了质的飞跃，植物转基因技术也已经得到了广泛的应用和发展，人们开始对外源基因导入植物细胞的方法进行大量的探索，建立了多种方法用于植物的基因转化。目前应用最普遍的植物基因的遗传转化方法主要有农杆菌介导法和DNA直接转入法[1,2]。

1 植物遗传转化的方法

植物遗传转化方法是实现植物遗传转化的重要环节之一。在短短的几十年中植物遗传转化技术发展非常迅速，植物遗传转化技术可分为利用载体系统转化和直接遗传转化技术两大类：利用载体系统转化有：农杆菌法、脂质体法；直接遗传转化有：基因枪法、PEG法、电击法、电注射法、显微注射法、花粉管通道法、超声波法等。在众多转化方法中，根癌农杆菌介导的遗传转化是研究最清楚和应用最成功的[3]。下面就简单介绍几种比较常用的转化的方法。

1.1 农杆菌介导法

农杆菌介导法主要是以植物的分生组织和生殖器官作为外源基因导入受体，通过真空渗透法、浸蘸法以及注射法等方法使农杆菌与受体材料接触，从而完成可遗传细胞的转化，然后利用组织培养的方法培育出转基因植株，并通过抗生素筛选和分子检测鉴定转基因植株的后代。农杆菌介导法包括两种:根癌农杆菌介导法、发根农杆菌介导法[4]。

1.1.1 根癌农杆菌介导法

最常用的根癌菌介导转化植物的方法是共培养法。共培养法为Marton等(1979)首次报道，1985 年Horsch等建立农杆菌与叶盘共培养转化法, 以后这一共培养系统又广泛用于愈伤组织细胞、悬浮培养细胞、茎切段、子叶切片、下胚轴切段等离体材料的转化[5]。

1.1.2 发根农杆菌介导法

发根农杆菌是根瘤菌科农杆菌属的革兰氏阴性菌，能入侵染绝大多数双子叶和少数单子叶植物，并诱发被感染植物的损伤部位长出毛状的根[6]。发根农杆菌具有这种特性，是因为它有能诱导产生毛状根的Ｒi质粒。因受体不同，发根农杆菌感染植物的方法可归纳为直接注射法、接种感染法、共培养法三种[7]。

１.2 脂质体法

脂质体是根据生物膜的结构和功能特性，人工用脂类化合物合成的双层膜囊。用它包装外源DNA分子或RNA分子，导入原生质体或细胞，以实现遗传转化的目的[8]。有两

种具体方法：其一是脂质体融合法，先将脂质体与原生质体共培养，使脂质体与原生质体膜融合，然后通过细胞的内吞作用把脂质体内的外源DNA或RNA分子高效地导入植物的原生质体；其二是脂质体注射法，通过显微注射把含有遗传物质的脂质体注射到植物细胞以获得转化。脂质体介导法具有多方面优点，包括：可保护DNA在导入细胞之前免受核酸酶的降解作用，降低了对细胞的毒性效应；适用的植物种类广泛，重复性高。脂质体转化法不足之处是转化率低，并且需要有完善的原生质培养及植株再生技术体系支持。

1.3 DNA直接转入法

DNA的直接转入是指利用植物细胞的生物学特性，通过物理化学的方法将外源基因转入受体植物细胞的技术。为了克服载体法寄主的局限性，如今已发展了基因枪法、电击法、花粉管通道法、显微注射法和PEG法等多种基因的直接转移技术[3]，它们是单子叶植物及部分双子叶植物转化中常采用的基因转化法。

1.3.1 基因枪法

基因枪法是继农杆菌介导法的第二大植物遗传转化方法，是借用火药爆炸、高压气体或高压放电为动力，用微粒对植物进行轰击而将其上的外源基因带入到植物细胞内，该方法可以不受基因型和轰击靶组织的限制[9]。它的基本原理是：将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后微粒在高压的作用下被高速射入受体细胞或组织中。微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到植物的染色体上，然后得到表达，从而实现基因的转化[10]。基因枪法具有受体类型广泛；无物种限制，操作简便快速；可控度高等优点。基因枪法的缺点主要有：转化频率低、价格昂贵、整合过程中易发生重排和高拷贝插入现象及后代遗传不稳定等。基因枪可以分为火药式、放电式和气动式三种类型[9]。

1.3.2 电击法

电击法又称电穿孔法。是一种利用高压电脉冲的电击穿孔作用将质粒DNA导入植物原生质体的方法。此法最初是应用于动物细胞，而现在已广泛应用于各种单子叶植物和双子叶植物。由于这种方法可以适用于单子叶植物和双子叶植物原生质体的转化，并且具有操作简便、对细胞毒性低以及转化率高等优点[11]，因而具有很大的应用潜力。但也

有缺点，电击法过程太长，因而不是大规模研究的最好方法，而且如果目的基因沉默引起胚胎和发育早期过程中死亡，这种方法将不会凑效。

1.3.3 显微注射法

显微注射法是利用管尖极细（0.1至0.5μm）的玻璃微量注射针，将外源基因片段直接注射到原核期胚或培养的细胞中，然后藉由宿主基因组序列可能发生的重组、缺失、复制或易位等现象而使外源基因嵌入宿主的染色体内的一种转化方法。这种技术的优点是任何DNA在原则上均可传入任何种类的细胞内；缺点是对设备的要求较高。

1.3.4 花粉管通道法

该方法的基本原理为：利用花粉管通道，将外源DNA或外源基因在自花授粉前后的适当时期导入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞[12]。与其它方法相比，花粉管通道法有许多优点：(1)直接得到转化种子，无须经过组培，减少了基因型的影响；(2)操作简便经济，无需昂贵的仪器和化学药品；(3)大量快捷，性状稳定快，转化频率高。因此，花粉管通道法在我国的应用十分广泛[13]。

1.3.5 超声波法

超声波作为一种物理手段可以介导外源DNA分子进入带壁的植物细胞和组织。通常用超声波基因转移仪进行。贾士荣等（1991）发展了这种转化方法[3]，其转化率可达22.3%。由于该方法的转化机制尚不清楚，且声强和处理时间对转化率影响很大。所以，目前这一方法还处在进一步的探索和发展之中。

2 植物遗传转化的应用

转基因技术可以针对现有植物或品种中存在的不足进行遗传改良，使之更符合人类的需要。因此，该技术在近几年内发展迅速[14]。

2.1 玉米的遗传转化

玉米是我国重要的粮食、饲料和工业原料作物，因此它的遗传转化研究备受各国科学家的重视。自从1988年Rhode s等首次获得了玉米转基因完整植株以来，玉米的遗传转

化技术得到了不断的发展[15]。

目前，利用农杆菌介导法、基因枪法、PEG法以及电激法等转化方法都能获得可育的转基因植株。其中，基因枪转化技术不断成熟和完善，在玉米品种改良中得到了广泛的应用。迄今，利用基因枪转化技术获得的抗虫、抗除草剂的转基因玉米率先应用于玉米的商品化生产。植物转化技术也将逐步应用与玉米品种改良的其他方面。

2.2 大豆的遗传转化

大豆是蛋白质含量极为丰富的豆科植物，原产于我国。不仅是我们人类主要的植物性蛋白质来源之一，而且是重要的家畜饲料和许多工业的原料。是一种非常重要的农作物。因此对大豆的遗传转化研究具有十分重要的意义。

目前应用于大豆遗传转化的方法主要有根癌农杆菌介导法、基因枪法、超声辅助农杆菌法、真空抽滤法和花粉管导入法(Trick等1997)等，但其中获得较为广泛应用的只有根癌农杆菌介导法和基因枪法[10]。

大豆的遗传转化近些年来已取得了较大的进展，实验的可操作性对大豆功能基因组研究的限制正在逐渐缩小，有望实现从分子水平上有针对性的改良大豆的品质。

2.3果树的遗传转化

果树是可供食用的果实、种子的多年生植物及其砧木的总称。果树遗传转化的研究开始于80年代末，Mcgranahan等首先在核桃上转移外源基因，得到了转基因植株[16]。

早期的研究多以根癌农杆菌介导进行转化，直到今天这一方法仍为许多人所采用。对于原生质体再生体系已建立的树种，也有采用电激方法进行转化的。

到目前为止，果树的遗传转化研究绝大多数是处于建立转化体系阶段，转化植株都还未开花挂果，但从转化体系建立来讲是成功的。要转化得到理想的品系品种或砧木类型还需一段时间。

2.4马铃薯的遗传转化

马铃薯是现今人类社会的四大粮食作物之一，仅次于水稻、玉米和小麦，因此，对马铃薯遗传转化的研究有着非常重要的意义。马铃薯为同源四倍体无性繁殖作物，利用常规杂交育种很难在较短时间内育成优良品种。随着生物技术的兴起和发展，许多技术

和方法己逐步应用到了马铃薯品种改良等研究之中，如马铃薯脱毒苗的繁殖、原生质体的再生以及转基因马铃薯的育种等。

1983 年首次通过农杆菌转化获得马铃薯再生植株。以叶片、茎段、块茎和试管薯为受体的Ti质粒转化均获得了成功。近年来，经过研究人员的努力，根癌农杆菌介导的马铃薯遗传转化体系有了长足的发展[17]。

2.5棉花的遗传转化

棉花，是锦葵科棉属植物的种子纤维，是世界上最主要的农作物之一。棉花的遗传转化技术是随着棉花组织培养技术不断完善而发展起来的。目前已广泛应用于棉花抗虫、抗病和品质改良育种实践，并获得了抗虫、抗病等优良性状的转基因植株，有些已经进入商品化生产，取得了显著的经济效益和社会效益[18]。

目前应用于棉花的转基因技术有：农杆菌介导法、基因枪法和花粉管通道法。

3 遗传转化的展望

我们都知道，所有生物的DNA上都携带着能传递遗传信息的基因。植物遗传转化技术正是通过修改基因，对有机体的部分或全部特征进行改变。不过，到目前为止，这种技术仍然处在起步阶段，还未实现大规模的经济培植。同时，人们对于这种技术培育出来的食物的安全性存在一定的担忧。因为转基因作物在实验室阶段需使用抗生素标记进行筛选，而抗生素标记基因是否会发生基因水平转移，例如是否水平转移至肠道微生物或上皮细胞而降低抗生素在临床治疗中的有效性，贾士荣1997年曾认为这种可能性非常小。随着技术的发展，现在已经可以将转基因植物中的标记基因通过定位重组技术删除，或使用更安全的标记基因如甘露糖_6_P_异构酶；也可以不用标记基因，如花粉管通道法，便避免了使用抗生素来进行筛选。

据资料显示，第一代转基因作物的遗传背景较为简单，转移一个基因（比如：抗虫、抗旱基因）就能起到相应的作用。而下一步的发展目标就是加入改变质量的基因，比如金色稻，含有更多的维生素Ａ，从而解决人体维生素Ａ缺乏的情况；含有乳铁蛋白转基

因的稻米可以防止腹泻；含有高钙素转基因的油菜可以防止老年骨质疏松症状等[13]。

我国农业部于1996年7月颁布了《农业生物基因工程安全管理实施办法》， 1997年3月底受理了国内外26项安全性评估申请，其中以转基因植物居绝大多数，26项中批准了22 项可进行中间试验或环境释放或商品化生产，转基因延熟番茄已被批准进入商业化。由此可见, 转基因植物在我国的商业化前景光明[19]。

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