菌种报告-铜绿假单胞菌

菌种报告—铜绿假单胞菌

一、铜绿假单胞菌简介

①、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）原称绿脓杆菌，为土壤中存在的最常见的细菌之一，属假单胞菌属，革兰氏染色阴性，无荚膜、无芽胞，菌体的一端有单鞭毛，能运动。

②、本菌为专性需氧菌，代时35min，生长温度范围25~42℃，最适生长温度为25~30℃，特别是该菌在4℃不生长而在42℃可以生长的特点，据此可与荧光假单胞菌等进行鉴别。用营养肉汤培养基进行增菌培养。

二、使用注意事项

①、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种常见的条件致病菌，是医院内感染的主要病原菌之一。根据《病原微生物生物实验室生物安全管理条例》中的有关规定，铜绿假单胞菌属于三类，BSL-2。

②、经常引起术后伤口感染，也可引起褥疮、脓肿、化脓性中耳炎等。本菌引起的感染病灶可导致血行散播，而发生菌血症和败血症。烧伤后感染了铜绿色假单胞菌可造成死亡。

③、所有的操作过程应在阳性室生物安全柜中进行，避免产生和溅出气溶胶。所有的培养物、储存物及其它的废物在释放前，均应121℃，30min湿热蒸汽灭菌。实验结束后，用0.1%的新洁尔灭擦拭台面，照紫外消毒。

菌种保存方案—铜绿假单胞菌（P.Aeruginosa）

1、实验材料：

器具：-80℃冰箱，2～8℃冰箱，试管，电动助吸器，锥形瓶，恒温培养摇床，1ml移液管，10ml移液管，冷冻管，振荡器，棉塞

试剂：冻干菌种，营养肉汤液体培养基，无菌甘油，生理盐水，营养琼脂平板

2、实验步骤：

2.1 菌种复苏和复壮（营养肉汤培养基）

2.1.1 将干菌种（0代）按上述步骤转移到装有100ml营养肉汤液体培养基的锥形瓶中复苏（第1代），35℃摇床恒温培养18小时。

2.1.2 取上述18小时后培养物1ml，接种到装有100ml营养肉汤液体培养基的锥形瓶中复壮（第2代），35℃恒温摇床培养18小时。

2.2 稀释倍数探索

2.2.1 取1ml新鲜培养物加入9ml生理盐水中，混匀得10-1管，依次稀释至

10-9。

2.2.2 取10-5～10-9梯度稀释菌液，1ml涂布营养琼脂平板，各做3个平行。涂布结束后置于32℃恒温培养箱中培养1天。同时锥形瓶中第2代菌悬液置于2～8℃冰箱保存。

2.2.3 培养结束后计数，计算菌液初始浓度。

2.3 菌种保存

2.3.1 从冰箱中取出菌悬液，根据菌液初始浓度，用生理盐水稀释至400CFU/ml。

2.3.2 取稀释后菌液加无菌甘油使终浓度为15%，菌液浓度为200CFU/ml。分装至冷冻保存管1ml/管。

2.3.3 分装好的冷冻管，置于-80℃冰箱冻存。同时取3支分别涂布营养琼脂平板，置于32℃培养3天计数，以验证冻存效果。

2.3.4 使用时取出冻存管，室温自然解冻，接种至培养基培养（第3代）。

2.3.5 每季度取3支菌悬液解冻涂布营养琼脂平板，培养计数以验证冻存效果。