细胞核分离方法
实验一 植物细胞的质壁分离及死活鉴定
实验一植物细胞的质壁分离及死活鉴定 细胞是植物结构与功能的基本单位,而原生质则是细胞中有生命的部位。死、活细胞原生质的理化性质有显著差别，如果细胞原生质的膜系统有半透性，可与外界溶液构成渗透系统；活细胞可以主动积累某些溶质等等，而死细胞的原生质则丧失了这些特性。在植物生理研究中，经常需要鉴定细胞的死活。本实验练习两种鉴定方法：质壁分离法及活体染色法，同时还可以通过对质壁分离及活体染色结果的观察，了解原生物的某些特性，如黏滞性、荷电性等，以加深对有关理论的理解。 一、植物细胞的活体染色与死活鉴定 ［原理］活体染色是利用某种对植物无害的染料稀溶液对活细胞进行染色技术。中性红是常用的染料之一，它是一种弱碱性pH6.4～8.0之间（由红变黄），在中性或微碱性环境中，植物的活细胞能大量吸收中性红并向液泡中排泌，由于液泡在一般情况下呈酸性反应，因此，进入液泡的中性红便解离出大量阳离子而呈现桃红色。在这种情况下，原生质和细胞壁一般不着色。死细胞由于原生质变性凝固，胞液不能维持在液泡内，因此，用中性红染色后，不产生液泡着色现象，相反，中性红的阳离子却与带有一定负电荷的原生质及细胞核结合，而使原生质与细胞核染色。 ［仪器与用具］显微镜1台；小培养皿一套；载玻片2片；盖玻片2片；单面刀片1片；尖头镊子1把；酒精灯1具；火柴1盒；擦镜纸、吸水纸适量。 ［试剂］ 0.03%中性红溶液；1mol/dm３硝酸钾溶液。 ［方法］ 1.选用洋葱鳞茎（或大葱假茎基部幼嫩部位）及小麦片作实验材料。 2．切下一片较幼嫩的洋葱鳞片，用单面刀片在鳞片内侧纵横割划成0.5cm2的小块，用尖头镊子将内表皮小块轻轻撕下，即可投入中性红溶液染色（注意应将表皮内側向下）。若用小麦片为材料，可将叶片背面朝上平放在载玻片放入盛有少量清水的培养皿内，用左手将叶片按平，右手用刀从一个方向轻轻刮去下表皮和叶肉部分，只留下透明的上表皮细胞。当刮到的只剩下少量叶肉细胞时要小心，用力太重容易损伤表皮细胞，甚至只剩下一层细胞壁，太轻又会留下过多的叶肉细胞，影响观察。除了小麦外，其他禾本科植物均可用此法制备表皮细胞纸片。将刮好的纸片切成约0.5cm2的小块。
实验3 细胞核的分离与核酸的鉴定
实验3 细胞核的分离与核酸的鉴定 【实验目的】 1.掌握细胞核及细胞质的分离和纯化的一般原理和操作方法。 2.了解DNA在细胞中的分布和核酸鉴定的原理。 3.进一步掌握离心机的工作原理及正确使用方法。 【实验原理】 1.DNA主要存在于细胞核， RNA主要存在于细胞质。 2.细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各组分分级分离出来。 肝组织破碎后，柠檬酸能抑制脱氧核糖核酸酶的活性，维持染色质的正常结构和活性。如将此种细胞核保存在等渗（0.25M）蔗糖溶液中（内含微量钙离子，防止核聚集和脆性），可以比较好地保存其完整的正常结构。 在此条件下离心分离得到的是细胞核的粗制品，如离心时通过0.88M蔗糖的高渗溶液。适当调整离心力，可得到纯化的细胞核沉淀。
3.脱氧核糖核酸的鉴定： 【操作步骤】 1、0.5g肝组织＋5ml的1.5%柠檬酸溶液，研磨 2、肝匀浆，倾入离心管，离心：3000r/min；15′ 3、离心结束后，上清液移入另外一个试管中备用（此为细胞质液） 4、沉淀中加入1ml的0.25mol/L 蔗糖-柠檬酸溶液，玻棒搅匀后， 为核悬液。 5、另外取离心管一只，加9ml 的0.88mol/L蔗糖-柠檬酸液。用滴 管吸取核悬液。沿管壁缓慢铺于液面上。 6、离心：2000r/min；10′.上层液，弃去；沉淀为初步纯化的细 胞核。 7、核洗液5ml洗涤沉淀，离心：2000r/min，10 ′白色沉淀为纯
化的细胞核。 8、加10ml 0.02mol/L NaOH溶解细胞核，即为待测的核液。 9、脱氧核糖核酸的鉴定 （1）水解：取离心管二支，编号，按下表操作 混合各管 沸水浴(10’) 离心 3000r/min;5′ 上清液 (2)鉴定：取试管三支，编号，按下表操作: 混合各管 沸水浴(15’) 冷却 比较各管颜色(595nm) 编号 1 2 细胞质（ml） 2.0 - 核液（ml）- 2.0 1M过氯酸(ml） 2.0 2.0
细胞质与细胞核测试题
第6讲细胞质与细胞核测试题 1．（2008广东理科基础）细胞内各细胞具有一定的结构和功能，对图8中结构①的叙述，正确的是A．在不同植物细胞内其数量基本相同 B．是植物合成蛋白质的主要细胞器 C．是植物进行光合作用产生有机物的细胞器 D．含有DNA和RNA，是决定植物遗传的基本单位 2、（06江苏）下列有关细胞结构和功能的叙述，错误 ．．的是 A、水稻主动吸收Si需要根细胞膜上的载体协助 B、甲状腺细胞能够接受促甲状腺激素的调节与其细胞膜上的糖蛋 白有关 C、核糖体是细胞内蛋白质的“装配机器”，由蛋白质和mRNA组 成 D、核孔是细胞核和细胞质之间进行物质交换的通道 3、（06江苏）（多选）右图为某高等植物叶肉细胞结构模式图，相关叙述正确的是 A、图中能产生ATP的结构有1、2、5 B、1中产生的一分子C02扩散出来进入2中被利用，穿过的磷脂双分子层的 层数为4层 C、2与4中都含有叶绿素和类胡萝卜素等色素 D、3是遗传物质储存和复制的主要场所，是细胞遗传特性和 细胞代谢活动的控制中心 4、（06广东）不．在内质网上合成或加工的生物分子是 A、抗体 B、胆固醇 C、维生素D D、核酸 5、下图表示真核生物细胞的结构与功能，下列与此相关的叙述，不正确的一项是 A、图中物质A表示蛋白质，物质B表示磷脂 B、E的结构特点是具有一定的流动性 C、图中①的场所是叶绿体，②的场所是线粒体 D、完成③、④、⑤、⑥功能的结构均具有单层膜结构 6. （2008高考广东生物）用高倍显微镜观察黑藻叶绿体时，可见叶绿体 A.具有双层膜 B.呈绿色带状 C.内部有许多基粒 D.呈绿色椭球形 7．（2008上海高考生物巻）（8分）下面是两类细胞的亚显微结构模式图，请据图回答：
细胞的质壁分离
观察植物细胞的质壁分离 一、实验目的： 1．学会观察植物细胞质壁分离与复原的方法。 2．了解植物细胞发生渗透作用的原理。 二．实验原理： 1．质壁分离的原理：当细胞液的浓度小于外界溶液的浓度时，细胞就会通过渗透作用而失水，细胞液中的水分就透过原生质层进入到溶液中，使细胞壁和原生质层都出现一定程度的收缩。由于原生质层比细胞壁的收缩性大，当细胞不断失水时，原生质层就会与细胞壁分离。 2．质壁分离复原的原理：当细胞液的浓度大于外界溶液的浓度时，细胞就会通过渗透作用而吸水，外界溶液中的水分就通过原生质层进入到细胞液中，整个原生质层就会慢慢地恢复成原来的状态，紧贴细胞壁，使植物细胞逐渐发生质壁分离复原。 三、实验材料： 紫色洋葱鳞片叶的外表皮。（因为液泡呈紫色，易于观察。） 0.3g/ml的蔗糖溶液。（用蔗糖溶液做质壁分离剂对细胞无毒害作用。） 三、实验步骤： 步骤注意问题分析 1．制作洋葱表皮的临时装片。在载玻片上滴一滴水，撕取洋葱鳞片叶外表皮放在水滴中展平（也可挑取几条水绵放入水滴中）。盖上盖玻片。盖盖玻片应让盖玻片的一侧先触及载玻片，然后轻轻放平。防止装片产生气泡。 2. 观察洋葱（或水绵）细胞可看到：液泡大，呈紫色，原生质层紧贴着细胞壁。（或水绵细胞中有带状叶绿体，原生质层呈绿色，紧贴着细胞壁。液泡含花青素，所以液泡呈紫色。先观察正常细胞与后面的“质壁分离”起对照作用。 3. 观察质壁分离现象。从盖玻片的一侧滴入0．3g/ml的蔗糖溶液，在另一侧用吸水纸吸引，重复几次。镜检。 观察到：液泡由大变小，颜色由浅变深，原生质层与细胞壁分离。原生质层与细胞壁之间充满蔗糖溶液。重复几次( 蔗糖溶液浓度大于细胞液浓度，细胞通过渗透作用失水，细胞壁伸缩性小原生质层的伸缩性大，液泡和原生质层不断收缩，所以发生质壁分离。) 为了使细胞完全浸入蔗糖溶液中。糖液浓度不能过高否则，细胞严重失水死亡，看不到质壁分离的复原。 4. 观察细胞质壁分离的复原现象。从盖玻片的一侧滴入清水，在另一侧用吸水纸吸引，重复几次。镜检。 观察到：液泡由小变大，颜色由深变浅，原生质层恢复原状。(细胞液的浓度高于外界溶液，细胞通过渗透作用吸水，所以发生质壁分离复原现象。) 发生质壁分离的装片，不能久置，要马上滴加清水，使其复原。重复几次。( 因为细胞失水过久，也会死亡。为了使细胞完全浸入清水中。) 四、实验讨论答案： 1．如果将上述表皮细胞浸润在与细胞液浓度相同的蔗糖溶液中，这些表皮细胞会出现什么现象？ 答：表皮细胞维持原状，因为细胞液的浓度与外界溶液浓度相等。 2．当红细胞细胞膜两侧的溶液具有浓度差时，红细胞会不会发生质壁分离？为什么？ 答：不会。因为红细胞不具细胞壁。
细胞生物学设计性实验：细胞核的分离鉴定
细胞生物学设计性实验：细胞核的分离鉴定 医学细胞生物学设计型实验设计报告 班级10级k-7班 评分 实验项目： 细胞核的分离与鉴定 实验原理：1、细胞内各种结构的比重和大小不同，在同一离心场内其沉降速度也不同。所以，用差速离心法可将细胞内各种细胞器及组分分级分离出来。差速离心法也是用来研究亚细胞成分的化学组成，理化特性及其功能的主要手段。 2、分离细胞核最常用的方法是将组织制成匀浆，在特定的条下进行离心分离，然后分析鉴定。 3、匀浆是指在低温条下，将组织放入匀浆器，加入等渗匀浆介质进行研磨，破碎细胞，使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆液。 实验步骤：1、处死：断头处死小白鼠，手提尾部使其学业尽量流出。 2、取材：迅速开腹取肝，在盛有生理盐水的小烧杯中反复洗涤，称取湿重约为1g的肝组织放在烧杯中。 3、匀浆：加油8ml预冷的0.25mol/L蔗糖0.003mol/L绿化高永夜于烧杯中，尽量剪碎肝组织，将剪碎的刚组织倒入玻璃匀
浆器，是匀浆器下端侵入盛有冰块的器皿（如冰盘）。左手握持匀浆器，右手将匀浆捣杆垂直插入管中匀浆，直至看不到明显的组织块。 4、过滤： 用8层纱布（先用少量生理盐水或蔗糖液润湿纱布）过滤匀浆液于离心管中。 5、离心：在天平上平衡每对离心管，2500r/min离心 15min，取上清液于另一离心管中。 6、涂片：取上清液制一张涂片（涂片1）。将原离心管中剩余上清液吹打成沉淀成悬液，另制一张涂片（涂片2），自然干燥。 7、染色：分别在涂片1和2上低价甲苯胺蓝染液 ，染色5到7分钟（即滴染）。 8、洗涤：冲去染液，晾干。 9、镜检：结合实验结果的描述，镜下观察分析。 注意事项：1.操作规范，防止试剂污染。 2.细胞悬液的涂片制作要轻柔。 3.使用离心机要注意平衡，转速从低到高。 预期结果：低倍镜下找到标本，再换高倍镜，可见肝细胞核已游离出来，被染成蓝紫色，圆形，中央有2到4个甚至更多个深蓝色的核仁。 实验用品：材料：小白鼠肝脏。
观察植物细胞的质壁分离和复原
实验九观察成熟植物细胞的质壁分离和复原 实验原理： 当外界溶液浓度大于细胞液浓度时，根据扩散作用原理，水分会由细胞液中渗出到外界溶液中，通过渗透作用失水； 由于细胞壁和原生质层的伸缩性不同，细胞壁伸缩性较小，而原生质层性较大，从而使二者分开； 反之，外界溶液浓度大于细胞液浓度，则细胞通过渗透作用吸水，分离后的质和壁又复原。 目的要求： 1．初步学会观察植物细胞质壁分离和复原的方法； 2．理解植物细胞发生质壁分离和复原的原理。 重点和难点： 1．初步掌握植物细胞质壁分离和复原的实验方法； 2．临时装片的制作； 3．高倍显微镜的使用。 实验器材： 紫色洋葱的鳞片叶、刀子、镊子、滴管、载玻片、盖玻片、吸水纸、显微镜； 质量浓度为0.3g/mL的蔗糖溶液、清水； 方法步骤： 一．临时装片制作： 1．选材： （1）选用紫色特别深的洋葱外表皮； 说明： A．在实验之前，最好将洋葱放在水中浸泡一下，可以使洋葱吸 水多一些，而且代谢也比较旺盛，实验效果明显。 B．将洋葱的外层剥去两层，因为处于最外的可能已经死亡； （2）取表皮： 在洋葱的外表皮上，用刀片划一些“井”字，用镊子轻轻撕取一小块； 关键： 最好撕取的是一层细胞，如果撕的太厚，则会使细胞重叠，严重影响 实验效果； 2．制片： 在载玻片中央滴上一滴清水，然后将取下的洋葱表皮放在水中，平展开来； 加上盖玻片。 二○○一年十月二十五日星期四第 1 页共4 页
二○○一年十月二十五日星期四 第 2 页 共 4 页 注意： A ． 洋葱表皮不能卷曲起来； B ． 不能带有气泡； C ． 加盖玻片时，要从一侧大约呈45°角放下，在载玻片和盖玻片之间 充满了清水，以便挤出空气。 二．观察： (一) 低倍镜观察： (二) 高倍镜观察： 在高倍镜下主要要注意以下几个结构： （1 ） 紫色的大液泡，几乎充满了整个细胞； （2） 注意观察原生质层和细胞壁紧紧地贴在一起。 （3） 找到细胞核，它是判断液泡膜还是细胞膜的关键。 (三) 质壁分离实验： 1．处理： 从载物台上取下装片，在盖玻片的一侧，滴入0.3g%mL 的蔗糖溶液，另一侧用吸水纸重复吸引几次。 实验成功关键之处： (1) 最好多重复几次，因为在洋葱表皮周围充满的是清水，如 果不多重复几次，洋葱表皮周围的蔗糖溶液浓度太低，质壁分离效果不明显。 (2) 所用的溶液特别要注意以下几点： A ． 不能是对植物细胞有伤害作用的物质，如强酸强 碱，因为它们会使细胞致死，而死亡的细胞内的膜便失去了选择透过性，而成了全透性； B ． 外界溶液中的物质必须是不可以被植物细胞吸收的物
细胞核的分离
实验四细胞核的分离 [实验目的] 1. 为了研究细胞核及其组分。 2. 定量分析细胞核的生化组分及其它一些特殊成分。 [实验原理] 1956年由chauveau等人提出，用高密度介质来分离细胞核。由于细胞核的密度较大，在高密度介质中，在高速离心条件下沉降下来，从而达到与细胞质其它成分分开来的目的。chauveau 的方法是将动物肝脏直接在2.2mol/l蔗糖溶液中匀浆，然后高速离心40 000g 1小时，细胞核沉淀到底部，线粒体和完整细胞，包括红血球漂浮在液面，通过一步操作即可分离得到细胞核。其后又有不少研究者对此方法进行了改进，例如加进氯化钙、氯化镁、氯化钾等改变分离介质的渗透压；选择介质的ph以及不同的高密度蔗糖溶液离心方法等。这样减少了细胞核的脆性，防止聚集，维持恒定的ph，就能保持细胞核的精细结构。虽然这一方法比较简单，能得到较高纯度的细胞核，也已被广泛采用，但实验需要高速离心机，这在一般实验室不能进行，此方法要用高浓度的蔗糖，如果要分离大量的细胞核，也很不经济。 目前在一般实验室中更多的是用柠檬酸分离细胞核，在柠檬酸介质中分离细胞核可以显著地除去附着在细胞核膜上的细胞质成分。由于柠檬酸降低了溶液的ph值，这样可以减少细胞核的破碎率，并能分离得到较高分子质量的核酸，可能是由于核糖核酸（一种酸溶性蛋白）被柠檬酸除去，以及二价阳离子被柠檬酸螯合所致。 柠檬酸的浓度对分离细胞核的质量有较大影响。通常在较低的ph值时，可以得到较高的细胞核。但在过酸条件下，可能引起细胞核成分的改变和酶的失活。为了研究细胞内核酸，一般常在ph值为4，甚至在ph值为2.5时分离细胞核。如为了分离细胞核的酶，则需要较温和的条件，此时可以在ph值为6～6.2的极稀柠檬酸溶液中分离细胞核。
植物细胞质壁分离与复原详细实验步骤
植物细胞质壁分离与复原详细实验步骤 （一）制作临时装片并观察 1、制片 ①、用拇指和食指夹住载玻片，然后取三层纱布沿一个方向擦拭载破片，直到对光看到载玻片光亮无污物为止。 ②、在载玻片上滴一滴水。（注意胶头滴管的正确使用方法：①握持方法是用中指和无名指夹住玻璃管部分以保持稳定，用拇指和食指挤压胶头以控制试剂的吸入或滴加量。 ②不能倒置，也不能平放于桌面上。③胶头滴管加液时，不能伸入容器） ③、 A 、洋葱：选用紫色特别深的洋葱外表皮，用刀片划“井”字，用镊子轻轻撕取中间的小正方形。（注意在洋葱未经过处理时一定要取外表皮）由于每种材料主要只在取材上有区别，其它步骤基本类似。下面老师演示一种洋葱鳞片叶外表皮装片。 ④、将撕取的洋葱鳞片叶外表皮借助解剖针放在水滴中展平，主要是为了细胞尽量无重叠。 ⑤、用镊子夹住盖玻片盖在载玻片上（同学们注意：盖盖玻片应让盖玻片的一侧以大约 45 ?先触及载玻片，然后轻轻放平，防止装片产生气泡）如果四周水过多可以用滤纸吸一下。 2、观察洋葱细胞 显微镜使用顺序：取镜—安放—对光（无载破片）打开光源—低倍镜对准通光孔—聚光器调到最高—调节反光镜—把宏光光圈打开（如果还不够亮可以稍微动一下粗准焦螺旋）—放装片—先用低倍镜调粗准焦螺旋至物像清晰，并调至中央，后扭转物镜转换器用高倍镜观察 可以看到洋葱鳞片叶表皮细胞中紫色的中央液泡，还可以看到原生质层紧贴着细胞壁。 （二）、观察质壁分离及复原 1、观察质壁分离现象 ①取下载玻片（如果不取下，在载物台上滴加蔗糖会一不小心滴漏在显微镜上，会损坏显微镜） ②从显微镜上取下装片，放在实验桌上。从盖玻片的一侧滴入0.3g /mL的蔗糖 溶液，在盖玻片的另一侧用吸水纸吸引，重复几次，为什么要重复呢？让盖玻片下面的洋葱鳞片叶完全侵润在蔗糖溶液中。 ③高倍镜观察表皮细胞发生的变化。中央液泡变小，原生质层脱离细胞壁 2、观察细胞质壁分离的复原现象 ①取下载玻片（如果不取下，在载物台上滴加清水会一不小心滴漏在显微镜上, 会损坏显微镜） ②从显微镜上取下装片，放在实验桌上。从盖玻片的一侧滴入清水，在盖玻片另一侧用吸水纸吸引，这样重复几次。洋葱鳞片叶表皮浸润在清水中。 ③用高倍显微镜观察，可以看到中央液泡逐渐胀大，原生质层又逐渐贴向细胞壁。实验
细胞核的分离与鉴定设计型实验设计报告_(2)
实验项目：细胞核的分离与鉴定 实验原理： 分离细胞核的可用方法有吸出法、原生质体破裂法、差速离心法排和排除法。差速离心法是根据细胞内各种细胞结构的比重和大小不同，因而在同一离心场内的沉降速率不同从而将细胞内的结构分级分离出来。本实验就采用差速离心法。 细胞核的鉴定，因为细胞核中主要含DNA，而DNA是碱性蛋白，可用甲苯胺蓝染液可使细胞核内碱性蛋白呈现出来。 实验器材：显微镜，普通离心机，离心管，滴管，玻璃漏斗，纱布，烧杯，解剖剪，镊子，玻璃匀浆器，载玻片/盖玻片，染色盘架，小白鼠肝脏。 实验试剂：甲苯胺蓝染液，蒸馏水，0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L的CaCl2溶液，生理盐水 实验步骤： （1）、用颈椎脱臼法处死小白鼠，迅速解开其腹腔取出肝脏，去出结缔组织，剪成小块，尽快置于盛有0.9%NaCl的烧杯中。反复洗涤尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。 （2）、将湿重为1g的肝组织放入烧杯中，用量筒取8ml预冷的0.25mol/L 蔗糖-0.003mol/L的CaCl2溶液，先加少量溶液于烧杯中，尽量剪碎肝组织后全部加入。 （3）、将剪碎的肝组织导入匀浆管中，使匀浆器下端侵入盛有冰块的器血
中，左手持，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨3-5次。用3层纱布过滤于匀浆管中，然后制备一张涂片①，自然干燥。 （4）、将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机以2500r/min离心15min,弃去上清液。 （5）、用6mol 0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L的CaCl2溶液悬浮沉淀物，以2500r/min离心15min 弃去上清液，将残留液体用气管吹成悬液，滴一滴于干净的载盖玻片上，制成涂片②，自然干燥。 （6）在①·②上滴加甲苯胺蓝染液，染色5-7min，洗涤干燥后镜检。 ⑺记录观察结果 注意事项： （1）尽可能充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。 （2）将匀浆液置于蔗糖溶液上层时要沿管壁小心加入，同时及时离心，以防止浆液中的颗粒自然下沉过快，影响后面的离心分层效果。 （3）涂片制作过程中把握好涂片的力度，不可太厚。 （4）染色后的洗涤要注意时间，不可过长，避免将染色洗去，观察不到细胞核。 （5）开腹取出肝后，用生理盐水反复冲洗，避免血细胞对食盐的影响。 预期结果： 在低、高倍镜下，可以观察到经.0.1%碱性固绿染色的小白鼠肝细胞的细胞核体被染成绿色。说明这是碱性蛋白，即细胞核已游离出来。 涂片在高倍镜下可见肝细胞核已游离出来，被染成蓝紫色、圆形、中央有
关于植物质壁分离与复原的实验报告单
观察植物细胞的质壁分离和复原 一、实验目的 1．学会观察植物细胞质壁分离与复原的方法； 2．了解植物细胞发生渗透作用的原理。 二．实验原理 成熟的植物细胞在一定浓度的溶液中，构成一个渗透系统。当水分通过原生质层出入细胞后，由于原生质层与细胞壁的伸缩性大小不同，将导致原生质层与细胞壁分离或复原。 三、实验材料、用具 实验材料：（原因？） g/ml的蔗糖溶液（可否适用0.5g/ml的蔗糖溶液？原因？） 显微镜，镊子、载玻片及盖玻片、滴管、水等 四、探究程序 1：制作临时装片与观察 制作临时装片：用刀片在洋葱鳞片叶的外表面划一个小方块，用镊子撕取这一小块洋葱表皮，将它平展地放在载玻片中央的清水滴中，并盖上盖玻片； 观察：先用低倍镜找到洋葱表皮细胞，并移到视野中央，然后移走低倍镜，换上高倍镜。这时可看到洋葱表皮细胞中紫色的大液泡，还可以看到______ __________________________________；2：细胞的质壁分离 滴蔗糖溶液：从载物台上取下装片，从盖玻片的一侧滴入0.3g／mL的蔗糖溶液，在盖玻片的另一侧用吸水纸吸引。这样重复几次，洋葱表皮细胞就浸润在蔗糖溶液中 观察：将装片放在载物台的中央，先用低倍镜观察，再用高倍镜观察。可以看到细胞中的液泡逐渐变小，_________________________________，最后完全分离 3：质壁分离的复原 滴清水：从载物台上取下装片，从盖玻片的一侧滴入清水，在盖玻片的另一侧用吸水纸吸引这样重复几次，洋葱表皮细胞又浸润在清水中 观察：将装片放在载物台的中央，先用低倍镜观察，再用高倍镜观察，可以看到中央液泡逐渐胀大，原生质层又逐渐贴着细胞壁 五、实验结果及结论的分析 1．实验现象： 在细胞液的浓度__________外界溶液的浓度时，洋葱鳞片叶表皮细胞就失水，液泡体积，细胞液浓度，颜色；发生质壁分离； 在细胞液的浓度__________外界溶液的浓度时，细胞就吸水，液泡体积，细胞液浓 度，颜色已出现了质壁分离的细胞，发生质壁分离复原。 2．实验结论 细胞能否从外界吸收水分取决于细胞液的浓度和外界溶液浓度的高低。当细胞液的浓度高于外界溶液的浓度时，细胞就吸水，否则就失水 习题 1．对图示的生物学实验的叙述正确的是（） A．图甲是用低倍显微镜观察某视野中的图像，如要看清洋葱根尖处于分裂期的细胞，应将装片适当向左移动 B．图乙是某同学在2m×2m样方范围内进行的双子叶草本植物苦荬菜种群密度的调查，圆圈表示个体，则这块地苦荬菜的种群密度为3.25株/m2 C．图丙是在高倍显微镜下观察到的黑藻叶细胞的细胞质处于不断流动的状态，实际上图中所标注的叶绿体位于右下角，细胞质按逆时针方向流动 D．图丁表示用高倍显微镜观察正在发生质壁分离的紫色洋葱表皮细胞，可见其液泡的颜色逐渐变浅 2．很多生物学实验都需要制作临时装片，在显微镜下观察，下列实验步骤不正确的是（） A．脂肪的鉴定：切取花生子叶薄片→染色→洗去浮色→制片→观察 B．观察细胞中叶绿体：取黑藻幼嫩小叶→染色→制片→观察 C．察观察细胞有丝分裂：解离洋葱根尖→漂洗→染色→制片→观察 D．观察细胞质壁分离：制作洋葱鳞片叶表皮装片→观察→滴入0．3g/mL蔗糖溶液→观察 3．（多选）用一个紫色洋葱的鳞片叶可做下列哪些实验的材料? （） A．观察植物细胞减数分裂B．观察植物细胞的质壁分离和复原 C．观察细胞中DNA和RNA的分布D．叶绿体中四种色素的提取和分离 ①
观察植物细胞质壁分离与复原
《实验七观察植物细胞质壁分离与复原》 作者：郭文娟 【教材分析】这是人教版生物高中第一册第三章第四节《植物对水分的吸收和利用》中的一节实验课是帮助学生理解细胞吸水原理的有力实例，但是这个实验的操作相对简单，因此在教学目标上， 1. 初步学会观察植物细胞质壁分离和复原的方法 2．理解植物细胞发生渗透作用的原理我在原有的基础上，添加了用课本实验的方法，让学生体验实验设计的几个重要基本原则的目标【教学重难点】 1. 观察植物细胞的质壁分离 2. 理解植物细胞发生质壁分离与复原的原理根据我对高二学生的了解，他们具备了以下四个特征，而且在以往的实验课中经常想尝试做一些自己的实验，也正是由于这点，使我在这节课中作了一个新设计实验的尝试 【教学方法】保证学生能在上完这节课后，要留下对学习过程的记录和今后作为复习的第一手资料，因此我使用了学案教学的方法， 【学案教学法】 学案的使用分为课前预习、课堂导学、课后巩固测试三部分 【教学过程】 一、导课用导学案的预习部分，以回忆知识的方式，讲解实验原理，了解实验用具和材料，同时将方法步骤中的难点和注意事项交代清楚。 用大约5-6 分钟的时间，学生已经对课本实验已经了解透彻，可这个实验操作很简单，那我们能不能完成这个实验的同时再多做一些观察呢？有些学生就想观察一些其他的植物。 导学案上就提出可不可以根据课本实验，用质壁分离的原理比较其他植物细胞与洋葱表皮细胞吸水能力的强弱吗？ 问题提出后教师就利用导学案上的“课堂导学”部分对学生进行引导，学生通过讨论完成导学案上实验设计。这里我在导学案的实验设计中把它分解为以下这三个问题，为什么这样设置呢？ 首先变量是实验的核心；设计实验的核心归根到底就是要确定实验变量的选择；学生只有抓住了这个核心，才能抓住这个实验设计的要诀。 而接着对照实验组的确定无非就是对实验变量的控制，保证实验中对照实验组之间只有一个变量不同，无关变量尽量控制在相同的条件下。 第三观察现象的确定，在这一步里学生必须找到一个能确定实验结果的可观测指标，使这个实验具有可操作性。 这样的设置看似简单，但其中却恰恰包含了新课标对学生思维培养的一种期待，这种期待是什么呢？ 通过这个简单的实验，学生掌握的不仅仅是专业知识，更是在这个过程中潜移默化地培养他们的思维，这种思维不仅仅可以用在今后的生物学习中，更可以用来解决人生道路上的各种问题。 就这个案例来说，从讨论实验设计的方法中，学生可以体会到单一变量原则、对照原则、可行性原则，事实上这些原则提炼出来就是实事求是、严谨全面、正视困难的精神，当学生在今后学习生活当中遇到问题的时候，遵循这样的精神，去寻找解决问题的方法。 当然，这节课中，学生对学案中提出的问题大感兴趣，他们找到了很多植物，除了课本上的洋葱，还有红花羊蹄甲、菠菜、香葱、美人蕉等等植物，确定实验变量为不同植物细胞。 在设计对照实验的过程中，同学们设计了各种各样的对照实验，我选了几个比较有特色的三组同学的
实验设计-细胞核的提取与鉴定
医学细胞生物学设计型实验设计报告 姓名：李飘班级：K—10班学号：1020151004 评分 【实验项目】：动物细胞细胞核的分离与鉴定 【实验原理】：核体的制备核体是指含有少量细胞质并由质膜包裹的 细胞核。因为在实际中我们不可能100%的得到细胞核，因此,我们只能制备含有少量细胞质的核体，核体的制备方法主要有吸出法和原生质体破裂法等。在本实验中我们采用排除法来制备核体。排除法制备核体是通过细胞松弛素和高速离心的作用使细胞核排出，然后从离心管底部沉淀中收集获得核体。 细胞核的鉴定因为细胞核中主要含DNA，是碱性蛋白。因此将分离出的核体经三氯醋酸处理,抽提掉核酸后，用碱性固绿溶液染色，可以使细胞核内的碱性蛋白显示出来。 【实验步骤】： 1．细胞培养：将欲分离微核体和细胞质的动物接种于脱核塑料圆板上，使适宜的培养基中于37 ℃的条件下培养，使细胞固定在脱核塑料圆板上，脱核塑料圆板的直径应稍小于离心管的直径，使用前先用水洗干净再经过乙醇杀菌处理。 2．秋水仙碱处理：细胞培养一段时间以后，加入0.1ug/ml的秋水仙碱，处理细胞48～60h 滤纸，使细胞形成多个大小不同的核体。 3．细胞松弛素处理：在离心管内加入5ml预热至37 ℃的细胞松弛素B溶液将固定有动物细胞的圆板面朝下放入离心管内，固定圆板位置后，再加入10ml37 ℃的CB溶液。 4．离心：在1000～15000r/min核体从细胞排出。 5．收集核体：由于核体的贴附力弱，可以从离心管底部的沉淀中收集。 6．固定：将收集的核体涂于玻片上制成涂片，滴加15%乙醇于涂片上，固定5min，室温晾干。 7．三氯醋酸处理：将已固定的血涂片浸在90 ℃的三氯醋酸溶液中处理20min，细流水反复冲洗玻片上的三氯醋酸直至冲尽。用滤纸吸于玻片上多余水分晾干。 8．染色：将制作好的涂片放入0.1%碱性固绿染液中染色10～15min，细流水冲去多余染液，晾干，镜检。 【注意事项】： 1．在离心管内加入的5ml细胞核松弛素B溶液要预热到37 ℃，因为只有这样才接近动物的最佳体温37 ℃。 2．涂片在用三氯醋酸处理时，时间不宜过长或过短，过长会使核膜裂解，过短使抽提的核酸不够。 3．在染色时，时间一定要足够，否则染色不完全，得不到理想的实验结果。 4．因去掉胞质的核体贴附能力弱，因注意在固定、三氯醋酸处理、染色时、尽量避免胞核的脱落。 【预期结果】：经碱性固绿染色的核体涂片被染成绿色，说明这是碱性 蛋白，即细胞核。
病毒的分离与鉴定
病毒的分离与鉴定 （一）病毒的分离病毒分离的一般程序是：检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状鸡胚→病变或死亡细胞培养→细胞病变→鉴定病毒种型(血清学方法)无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离… （一）病毒的分离 病毒分离的一般程序是： 检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状 鸡胚→病变或死亡 细胞培养→细胞病变 →鉴定病毒种型(血清学方法) 无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离心后，取上清接种；咽洗液、粪便、尿、感染组织或昆虫等污染标本在接种前先用抗生素处理，杀死杂菌。 1．细胞培养用分散的活细胞培养称细胞培养（Cell culture）。所用培养液是含血清（通常为胎牛血清）、葡萄糖、氨基酸、维生素的平衡溶液，pH7.2～7.4。细胞培养适于绝大多数病毒生长，是病毒实验室的常规技术。 原代细胞培养(Primary cell culture) 用胰蛋白酶将人胚（或动物）组织分散成单细胞，加一定培养液，37℃孵育1-2天后逐渐在培养瓶底部长成单层细胞，如人胚肾细胞、兔肾细胞。原代细胞均为二倍体细胞，可用于产生病毒疫苗，如兔肾细胞生产风疹疫苗，鸡成纤维细胞产生麻疹疫苗，猴肾细胞生产脊液灰质炎疫苗。因原代细胞不能持续传代培养，故不便用于诊断工作。 二倍体细胞培养(Diploid cell cultune) 原代细胞只能传2-3代细胞就退化，在多数细胞退化时，少数细胞能继续传下来，且保持染色体数为二倍体，称为二倍体细胞。二倍体细
探究植物细胞质壁分离的创新实验说课稿
探究植物细胞质壁分离的创新说课稿 武陟一中梁西周 一、理论背景及实验创新理念 目前高中生物教学中尽管改革不断深化，课堂的人文性有所加强，但生物课堂教学效率低下，低效教学甚至无效教学在传统的教学中仍然大量存在。因此当前亟待解决的问题就是如何实现有效教学，以尽可能少的时间、精力和物力投入，取得尽可能多的教学效果。对实验的创新是必要的，在改进中的和创新中使学生对实验的原理、现象、结论及其运用有更好的理解和掌握，相对传统的实验，创新实验的效果更明显，更易于激发学生的学习和探究热情，培养学生的发散思维和逆向思维，在教学过程中做到有效果、有效率、有效益。 二、教学内容分析 本案例出自必修1《分子与细胞》新课标内容的第四章第一节：物质跨膜运输的实例。本实验是在学习扩散和渗透、被动转运、主动转运知识的基础上，利用植物细胞质壁分离及质壁分离复原实验强化渗透作用原理，同时也是对物质出入细胞方式这块内容的升华。本实验也是在初中《科学》“根对水分的吸收”的基础上进一步学习植物的水分代谢过程。同时也与后面学习的细胞呼吸作用和光合作用存在一定程度的联系，是植物体新陈代谢的基础。 三、学情分析 学生除拥有初中自然科学相关水分吸收内容基础知识外，在学习物质出入细胞的方式内容后，他们对植物细胞在什么情况下吸水和失水等内容已经有所了解，并在日常生活经验中也有类似植物细胞吸水失水的实例，例如萝卜咸菜腌制等。但并没有系统学习植物细胞吸水和失水的基本原理及条件，缺乏感性认识。与平时理论课相比，学生对实验课有更高的积极性，对课本中没有的创新实验有更强的探究欲望。 四、教学目标 高中生物课程标准的基本理念中明确指出倡导探究性学习和注重与现实生活的联系。尝试从不同角度思考、分析和解释观察的现象，树立实事求是的科学态度；解释植物细胞质壁分离及质壁分离复原的现象。 1．知识目标：解释植物细胞渗透吸水的原理和过程；解释质壁分离与复原的实质；说明质壁分离能否自动复原的条件。 2．能力目标：初步学会观察植物细胞质壁分离和复原的方法；尝试对实验结果进行分析和解释并得出相应的结论；运用质壁分离与复原知识解决实际问题；复习并熟练光学显微镜的操作步骤。 3．情感目标：参与小组合作与交流，体验团队协作学习过程；通过实验结果和现象观察，养成实事求是的科学态度；培养不断探求新知的精神和合作精神。 五、教学重点与难点
实验二 细胞核与线粒体的分离与观察
实验二细胞核与线粒体的分离与观察 一、实验目的 1．了解差速离心法分离细胞核与线粒体的原理。 2．掌握差速离心法分离动物与植物细胞的细胞核与线粒体的方法。 二、实验原理 细胞核（nucleus）是细胞中重要的细胞器，细胞的控制中心，在细胞的代谢、生长、分化中起着重要作用，是遗传物质的主要存在部位。线粒体（mitochondria）是真核细胞特有的能量转换的重要细胞器，是细胞进行有氧呼吸的主要场所。细胞中的能源物质—脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动需要。对细胞核和线粒体结构与功能的研究通常是在离体进行的，因而分离细胞核和线粒体是必须的。 差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心分离细胞核和线粒体。在确定的离心场中，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。在一均匀悬浮介质中离心一定时间内，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。 缓冲的蔗糖溶液是常用的悬浮介质，它属于等渗溶液，比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。线粒体的鉴定用詹纳斯绿B（Janus green B）活染法，对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中染料被还原成无色。 从植物细胞分离线粒体除了作线粒体功能测定外，在植物细胞遗传工程中，常用于分离核外基因——线粒体DNA等目的。 分离线粒体的方法仍采用均匀介质中的差速离心。介质中0.25mol/L蔗糖也可以用0.3mol/L甘露醇代替。EDTA螯合二价阳离子，Ca2+除去后细胞间粘着解体，促使组织分散成单个细胞。牛血清白蛋白（BSA）能包在细胞外面，并作为
利用离心技术分离细胞核和叶绿体
密度梯度离心后的结果低倍镜下的叶绿体 高倍镜下的叶绿体 实验二利用离心技术分离细胞核和叶绿体 一、实验目的： 1. 了解常用的离心法； 2. 理解差速离?心法和速率区带离心法分离样品组分的原理； 3. 以分离细胞核和叶绿体为例,掌握离心的操作方法。 二、实验原理： ? 离心技术：是利用物体高速旋转时产生强大的离心力，使置于旋转体中的悬颗粒发生沉降或漂浮，从而使某些颗粒达到浓缩或与其他颗粒分离的实验技术。?离心技术类型: 1.差速离心法 2.密度梯度离心法 ?等密度梯度离心： ①对象：常用来分离提取核酸、亚细胞器和质粒。(此法一般应用于分离大小相 近，而密度差异较大的颗粒物质时) ②原理：当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力场下，在密度梯度介质中， 颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们各自的密度恰好相 等的位置，在这里颗粒没有重量，不管离心多长时间，它们再也不移 动了，形成一系列密度区。从而使不同浮力密度的物质得到分离。③等密度梯度离心一般常用CsCl、蔗糖、甘油等做介质。 ?速度梯度离心： ①对象: 纯化分离叶绿体和细胞核(主要用来分离密度相近，大小不同的物质) ②原理:根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带,达到彼此分离的目的。 ②要求：1、样品溶液的密度必须小于悬浮介质层的最小密度； 2、样品颗粒的密度必须高于悬浮介质的最大密度； 3、离心时间十分重要 三、实验结果分析： 实验结果：
实验结果： 如图所示，叶绿体在混合液的梯度层中，形成一条带，聚集在密度梯度交界处；沉降系数较大的细胞组份则沉到离心管底部。 如图所示，叶绿体镜检为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒为基粒。 实验分析： 此实验最难的一点就是蔗糖溶液梯度的制备。要想制得清晰，平整的界面，需要将离心管放置于稳定的水平界面上；最重要的是，向下层溶液中加入上层溶液时，需要极小心、熟练地控制滴加的力度，并使枪头贴着离心管管壁，让液滴缓慢的流入，防止梯度层被破坏；除此之外，将配置好梯度层的的EP管放入离心机时要用试管架移动，而且离心时一定要两两平衡，之前要称量两个离心管使其相等。 四、思考问答： 本实验使用了哪两种离心方法，它们在分离样品时有何不同？ 答：使用了等密度梯度离心和速率区带离心。速率区带离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起始离心速度较低，使较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍悬浮在上清液中。收集沉淀，再改用较高的离心速度离心悬浮液，使较小的颗粒沉降，多次重复此步骤，从而达到分离不同大小颗粒的目的；等密度梯度离心是用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。此种分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。
〖实验6〗观察植物细胞的质壁分离和复原
〖实验6〗观察植物细胞的质壁分离和复原（B1C4P61“探究”） 一、实验目的： 1．学会观察植物细胞质壁分离与复原的方法。2．了解植物细胞发生渗透作用的原理。 二．实验原理： 1．质壁分离的原理：当细胞液的浓度小于外界溶液的浓度时，细胞就会通过渗透作用而失水，细胞液中的水分就透过原生质层进入到溶液中，使细胞壁和原生质层都出现一定程度的收缩。由于原生质层比细胞壁的收缩性大，当细胞不断失水时，原生质层就会与细胞壁分离。 2．质壁分离复原的原理：当细胞液的浓度大于外界溶液的浓度时，细胞就会通过渗透作用而吸水，外界溶液中的水分就通过原生质层进入到细胞液中，整个原生质层就会慢慢地恢复成原来的状态，紧贴细胞壁，使植物细胞逐渐发生质壁分离复原。 六、实验结论：_____________________________________________________________。 实验4key： 三.实验假设：原生质层相当于一层半透膜 四、实验流程：液泡的大小蔗糖原生质层清水 五、注意事项：水平污染载物台太长太高复原 六、实验结论：原生质层相当于一层半透膜 （实验材料：紫色洋葱鳞片叶的外表皮。因为液泡呈紫色，易于观察。也可用水绵代替。0.3g/ml的蔗糖溶液。用蔗糖溶液做质壁分离剂对细胞无毒害作用。）
i 质、壁的概念 1.发生质壁分离复原的植物细胞中，水分经过的结构依次是（） A．细胞膜、液泡膜、细胞质、细胞壁B．细胞壁、细胞膜、细胞质、液泡膜 C．液泡膜、细胞质、细胞膜、细胞壁D．细胞壁、细胞膜、液泡膜、细胞质 2.某学生做“细胞的质壁分离和质壁分离复原”实验，所用材料为紫色洋葱，试剂是30%蔗糖溶 液，请据图回答下列问题： ⑴显微镜下观察到洋葱表皮细胞图B处于 ___________________状态；由A形成B的原因 是___________________________。 ⑵从结构上看，图A中的原生质层是由［］_____ _____、［］__________、［］_____________ 共同构成的，相当于 ⑶“⑦”处溶液是_____________________；“⑧”处溶液是_____________________。 ⑷实验过程中看到的是，当细胞浸泡在30%蔗糖溶液中后，液泡的颜色变_________，说明细胞 通过渗透作用而______________；当已发生质壁分离的细胞置于清水中后，液泡的颜色变_________，说明细胞通过渗透作用而_______________。 ⑸若将B细胞放入清水中它_______（填“会”或“不会”）无限吸水，理由是____ ________。ii 质壁分离、复原的原理：浓度差、半透膜、渗透吸水、活细胞 3.植物细胞发生质壁分离的内因是（） A．外界溶液浓度大，细胞液浓度小B．原生质层伸缩性小，细胞壁伸缩性大 C．外界溶液浓度小，细胞液浓度大D．原生质层伸缩性大，细胞壁伸缩性小 4.下列结构中会影响细胞渗透吸水，但基本不影响细胞渗透失水的是（） A．细胞膜B．液泡膜C．细胞液D．细胞壁 5.（06广东）2．以紫色洋葱鳞茎表皮为材料观察植物细胞质壁分离现象，下列叙述错误的是（） A．在发生质壁分离的细胞中能观察到紫色中央液泡逐渐缩小 B．滴加30％的蔗糖溶液比10％蔗糖溶液引起细胞质壁分离所需时间短 C．发生质壁分离的细胞放入清水中又复原，说明细胞保持活性 D．用高浓度的NaCl溶液代替蔗糖溶液不能引起细胞质壁分离 iii 质壁分离与否的判断 6.置于30%的蔗糖溶液中会发生质壁分离的一组细胞是（） A．用95％乙醇浸泡过的洋葱鳞片叶上表皮细胞（死）B．玉米根分生区细胞和伸长区细胞C．形成层细胞和胚芽细胞D．洋葱表皮细胞和根毛细胞 7.如果把一个膨胀到最大限度的植物细胞放在“它自己的细胞液”溶液（与膨胀前浓度相等的溶 液）中，则细胞（） A．没有变化B．水被释放，最后质壁分离C．细胞胀破D．细胞失水，但不会质壁分离8.具有液泡的成熟植物细胞放入蔗糖溶液中，经一段时间，这个细胞会发生的变化是（） A．液泡变大B．液泡变小C．液泡保持不变D．无法肯定 iv 质壁分离的结果 9.(08广东卷·3)观察在0.3g／mI．蔗糖溶液中的洋葱表皮细胞，发现中央液泡逐渐变小，说明 A．细胞壁相当于一层半透膜B．洋葱表皮细胞是活的 C．此时蔗糖溶液浓度小于细胞液浓度D．细胞壁收缩导致中央液泡失水
细胞核与线粒体的分级分离
细胞核与线粒体的分级分离 一、原理 细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不 同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。 分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括 组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的 主要手段。 匀浆(Homogenization)低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即 0.25mol／L 蔗糖一 0.003mol／L氯化钙)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。 分级分离(Fractionation)由低速到高速离心逐渐沉降。先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将 浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。由于样品中各种大 小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沈淀必然不是纯 的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。 分析 分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。 二、细胞核的分离提取 (一)操作步骤 1．用颈椎脱位的方法处死小白鼠后，迅速剖开腹部取出肝脏，剪成小块(去除结缔组织)尽快置于盛有 0.9％NaCl的烧杯中，反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。 2． 将湿重约1g的肝组织放在小平皿中，用量筒量取8ml预冷的0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙 溶液，先加少量该溶液于平皿中，尽量剪碎肝组织后，再全部加入。 3．剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂 直插入管中， 上下转动研磨3～5次， 用3层纱布过滤匀浆液于离心管中， 然后制备一张涂片①， 做好标记， 自然干燥。 4．将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机，以2500rpm，离心15分钟；(1)缓缓取上清液，移入 高速离心管中， 保存于有冰块的烧杯中， 待分离线粒体用； (2)同时涂一张上清液片②做好标记， 自然干燥； (3)余下的沉淀物进行下一步骤。 5．用6ml0.25mol/L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液悬浮沉淀物，以2500rpm离心15分钟弃上清，将残 留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴于干净的载玻片上，涂片③，自然干燥。 6．将①、②、③涂片用l％甲苯胺兰染色后盖片即可观察。 (二)结果 分别于高倍镜下观察三张涂片，描述镜下所见。 三、高速离心分离提取线粒体 (一)操作步骤 1．将装有上清液的高速离心管，从装有冰块的烧杯中取出，配平后，以 17000rpm 离心 20 分钟，弃上 清，留取沉淀物。 2．加入0．25mol／L蔗糖一0．003mol／L氯化钙液lml，用吸管吹打成悬液，以17000rpm离心20分 钟，将上清吸入另一试管中，留取沉淀物，加入0.1ml 0．25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液混匀成 悬液(可用牙签)。 3．取上清液和沉淀物悬液，分别滴一滴于干净载玻片上(分别标记④、⑤涂片)，各滴一滴0.02％詹纳斯 绿B染液盖上盖片染20分钟。 (二)结果 油镜下观察，颗粒状的线粒体被詹纳斯绿B染成蓝绿色。