生物分离工程总结最新版本

1，生物分离工程：是指从发酵液，酶反应液或动植物细胞培养液中分离，纯化生物产品的过程。它描述了生物产品的分离，纯化过程的原理，方法和设备，因为它处于整个生物产品生产过程的后端，所以也称为生物工程下游技术。 2，凝集：通过加入无机盐，在无机盐作用下，发酵液中的胶体脱稳并使粒子相互凝集成块状絮凝体的过程。 3，絮凝：指某些高分子絮凝剂能在悬浮粒子之间产生桥梁作用，使胶粒形成粗大絮凝团的过程。 4，离心分离：是指在离心场的作用下，将悬浮液中的固相和液相加以分离的方法。 5，过滤：发酵液通过一种多孔介质，固体颗粒被截留的过程。 6，滤饼过滤：固体颗粒沉积于过滤介质表面形成滤渣层。 7，深层过滤：固体颗粒进入并沉积于多孔孔道内，溶液经孔道缝隙流过滤渣。 8，细胞破碎：是采用一定的方法，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术，是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质的基础。 9，机械破碎法：通过机械运动产生的剪切力使组织细胞破碎。 10，物理破碎法：通过各种物理因素作用，使组织细胞的外层结构破坏，使细胞破碎。生物分离工程（下游加工过程）11，化学破碎法：通过各种化学试剂对细胞膜的作用，使组织细胞的外层结构破坏，使细胞破碎。 12，通过细胞本身酶系或外加酶催化剂的催化作用，使外层结构破坏。 13，超声破碎法：在超声波作用下，液体发生空化作用，空穴的形成，增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。 14，空化作用：指存在于液体中的微气核空化泡在声波作用下发生变化，声压达到一定值，在声波纵向传插负压区，空泡化增大，在声波传播的正压区，空泡闭合，在反复增大，闭合中，空泡化崩溃，崩溃的瞬间，产生巨大的剪切力。 15，酶解法：利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜。 16，酶解—自溶作用：利用生物体自身产生的酶来溶胞，而不需要外加其他酶。17，自溶作用：改变其生长环境，可诱发产生过剩的这种酶或激发产生其他的自溶酶，以达到自溶作用。 18，包含体：一种蛋白质不溶性聚集体，包括目标蛋白，菌体蛋白等。目标蛋白的一级结构是正确的但立体结构是错误的，所以没有生物活性。 19，沉淀：是指溶液中加入沉淀剂使溶质溶解度降低，生成无定形固体从溶液中析出的过程。 20，盐析法：蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低，以至于从溶液中沉淀出来的方法。 21，等电点沉淀法：利用蛋白质在pH等于其等电点的溶液中溶解度下降的原理进行沉淀。 22，萃取：利用溶质在互不相溶的溶解度不同，用一种溶剂把溶质从它与另一种溶剂所组成的溶液中提取出来的方法。 23，分配定律：在恒温恒压下，溶质在互不相溶的；两相中分配，达到分配平衡后，如果其在两相中的相对分子质量相等，则其在两相中的平衡浓度之比为一常数，称为分配系数k。k=a/c2=萃取相中的浓度/翠余相的浓度。 24，超临界流体：是指物质处于其临界温度和临界压力以上而形成的一种特殊状态的流体。 25，超临界流体萃取：也叫气体萃取，流体萃取，稠密气体萃取或蒸馏萃取。作为一种分离过程的开发和应用，是基于一种溶剂对固体和液体的萃取能力和选择性在超临界状态下较之在常温常压下可获得极大的提高。它是利用超临界流体，即温度和压力略超过或靠近临界温度和临界压力，介于气体和液体之间的流体，作为萃取剂，从固体或液体中萃取出某种高沸点或热敏性成分，以达到分离和纯化的目的。 26，膜分离过程：是具有选择透过性的天然或合成薄膜为分离介质，在膜两侧的推动力作用下，原料液体混合物或气体混合物中的某个或某些组分选择性地透过膜，使混合物达到分离，分级，提纯，富集和浓缩的过程。 27，水通量：指纯水在一定温度，压力下（0.35MPa,25℃），单位时间，单位膜面积透过的水的量。

28微滤：以压力差为推动力，截留水中粒径在0.02~ 10m之间的颗粒物的膜分离技术。 29，超滤：在压力差的驱动下，用可以阻挡不同大小分子的滤板或滤膜将液体过滤的方法。30，纳滤：以压力差为推动力，介于反渗透和超滤之间的截留水中粒径为纳米级颗粒物的一种膜分离技术。

31，反渗透：在压力驱动下使溶液中的溶剂(如水)以与自然渗透相反的方向通过半透膜进入膜的低压侧，从而达到有效分离的过程。 32，浓差极化：由于水透过膜而使膜表面的溶质浓度增加，在浓度梯度作用下，溶质与水以相反方向向本体溶液扩散，在达到平衡状态时，膜表面形成一溶质浓度分布边界层，它对水的透过起着阻碍作用。 33，吸附：是指溶质从液相或气相转移到固相的现象。 34，离子交换吸附：简称离子交换，是利用离子交换树脂作为吸附剂，将溶液中的待分离组分，依据其电荷差异，依靠库仑力吸附在树脂上然后利用合适的洗脱剂将吸附质从树脂上洗脱下来，从而达到分离的目的。 35，吸附平衡等温线：当温度一定时，吸附量与溶液中溶质的浓度的函数关系称为吸附平衡等温线。 36，色谱：能用于混合物分离的方法称为色谱。 37，色谱法：是一种基于被分离物质的物理化学及生物学特性的不同，使他们在某种基质中移动速度不同而进行分离和分析的方法。38，液膜（液体膜）：是从生物膜奇妙的选择性输送功能上得到启发而模仿的一种人工膜。 39，膜膨胀：是一个传递外水相溶液进入内相的过程。 40，反胶团：若将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，并使其浓度超过临界胶束浓度，便会在有机溶剂内形成聚集体，这种聚集体称为反胶团（或反胶束）41，膜分离技术：用人工合成的某种材料作为两相之间的不连接区间实现不同物质分离的技术。 42，配基：在亲和层析中起可逆结合的特异性物质。 43，“Ks”分级盐析法：在一定pH和温度下以改变离子强度进行盐析，常用于提取液的处理。 44，硫酸铵饱和度：指饱和硫酸铵溶液的体积占混合后溶液总体积的百分比。 45，提取：利用一种溶剂对不同物质溶解度的差异，从混合物中分离出一种或几种组分的过程。 46，柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达分离目的的方法。 47，“β”盐析法：在一定离子强度下仅改变pH和温度进行盐析。常用于初步纯化。 48，分配系数K：当萃取体系达到平衡时，溶质在两相中的总浓度之比。 49：有机溶剂沉淀法：在含有溶质的水溶液中，加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质溶解度时沉淀析出。 50离心机：是在高速旋转的转子中，借离心力作用过滤和澄清悬浮液，分离，分析生物大分子或一种相对密度不同而又互不相溶的液体分开的设备。

生物化工产品通过生物发酵过程、酶反应过程或动植物细胞大量培养获得，从上述发酵液、反应液或培养液中分离精制有关产品的过程称为下游加工过程。

2. 传统生化产品和基因工程产品的区别

①传统生化产品都为小分子(工业用酶除外，但它们对纯度要求不高、提取方法较简单)．其理化性能(如平衡关系等)数据都为已知，因此放大比较有根据；基因工程产品大多为大分子，必要数据缺乏，放大多凭经验。

②由于第一代基因工程产品都以E.coli作为宿主，表达产品处于胞内，提取前需将细胞破碎，细胞内物质释放出来，给提取增加了很多困难；而发酵液中的产物，浓度较低，杂质又多，且一般大分子较小分子不稳定(易失活，如对剪切力)，故提取较困难。

③大分子(蛋白质)的分离主要困难在于杂蛋白的分离，由于蛋白质都内氨基酸所构成，所以性质相似，分离主要依靠高分辨力的精制方法，如色谱分离等。

3.选择依据

依据目标蛋白和杂蛋白在物理、化学和生物学方面性质的差异，尤其重要的是表面性质的差异。例如，表面电荷密度（滴定曲线）、对一些配基的生物学特异性、表面金属离子、糖含量、自由巯基数目、分子大小和形状（相对分子质量）、PH值和稳定性等。

4.下游加工工艺过程的一般流程图

1.发酵液预处理概念、方法

概念：以细胞培养液或发酵液为出发点，设法使目标产物转移到液相中，同时除去其它悬浮颗粒以及改善滤液性状，利于后续操作，该过程称为预处理。

方法：（1）凝聚和絮凝技术（2）杂蛋白的去除方法①等电点沉淀法②加热③吸附作用④蛋白质沉淀剂（3）高价无机离子的去除方法

2.凝聚和絮凝技术概念（混凝）

(1)凝聚作用是在某些电解质作用下，如中性盐作用下，使扩散双电层的排斥电位降低，破坏胶体系统的分散状态，而使胶体粒子聚集的过程。

(2)絮凝作用：指在某些高分子絮凝剂存在下，在悬浮粒子之间产生架桥作用，而使粒胶形成粗大的絮凝团的过程，它是一种以物理的集合为主的过程。

(3)混凝：在料液中，先加入无机电解质，使悬浮粒子间的相互排斥能降低，脱稳而凝聚成微粒，而后再加入絮凝剂,凝聚作用为絮凝剂的架桥创造了良好的条件，从而提高了絮凝效果。这种包括凝聚和絮凝机理的过程，常称为混凝。3.滤饼质量比阻概念

衡量过滤特性的主要指标是滤饼的质量比阻rB (或α).它表示单位滤饼厚度的阻力系数，与滤饼的结构特性有关，rB(或α)越小，则发酵液越易过滤。单位：(m/kg)

4.影响rB的因素

影响滤饼比阻的主要因素有形成滤饼的颗粒物性（颗粒尺寸，形状等），过滤压力差，料浆的浓度，溶液的PH，过滤速率和过滤时间等。

①形成滤饼的颗粒直径越大，其比表面积越小，比阻越小。

②颗粒在堆积过程中所形成的颗粒与颗粒的孔隙也就越大，过滤阻力越小；

③对于可压缩性滤饼， rB是操作压力差的函数，滤饼的比阻值是随操作压力差的提高而增大的。

④料浆浓度对比阻的影响存在一个临界浓度，当料浆浓度小于临界浓度时，比阻随着浓度的增加而增大，当料浆浓度大于临界浓度时，比阻随浓度的增加而减小；

⑤过滤速度的增加会导致滤饼阻力系数的增加和空隙率的减少。由于滤饼的孔隙率随时间而增大，因而滤饼比阻有随过滤时间减小的趋势。

5.草酸调节发酵液PH的作用

1、由于大多数蛋白质的pI在酸性范围，所以把pH调到等电点附近，杂蛋白质的溶解度降低而被除去。提高滤液质量。

2、发酵液酸化后目标产物容易转入到液相。

3、加入草酸钠调pH值，草酸根离子还可以跟钙离子、镁离子结合，形成不溶物，而去除钙离子和镁离子。

4、酸化后的发酵液粘度降低，有助于提高过滤速度。

6.板框过滤的应用条件

优点：1）过滤面积大，过滤推动力(压力差)能较大幅度地进行调整，并能耐受较高的压力差，2）适应性强，3) 设备结构简单、价格低、动力消耗少等。

适用范围较广，一般用于滤饼较干的场合，不用于含挥发性有毒物质或有生物危害的场合。

1.高压匀浆，高速珠磨概念与比较

比较：①细胞所受到的作用力高压匀浆：液相剪切力高速珠磨：剪切力层之间的碰撞和磨料的滚动

高压匀浆：从高压室压出的细胞悬浮液经过阀座的中心孔道从阀座和阀杆之间的小环隙高速喷出，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出，细胞在高速造成的剪切力、碰撞力和高压到常压的变化等作用下，造成细胞破碎。

高速珠磨：细胞悬浮液与极细的研磨剂在搅拌浆作用下充分混合，珠子之间，珠子与细胞之间互相剪切、碰撞，促使细胞壁破裂，释出内含物。

②动力学方程：

高压匀浆破碎的动力学方程: Ln S =kP a N b

S:细胞破碎率K:破碎速度常数(破碎的阻力) P:操作压力N:循环操作次数

a、b指数因细胞种类和培养条件而异

高速珠磨法：

k 为破碎速率常数，主要与微球粒径、密度、填充率以及细胞浓度、搅拌速度、进料速度、搅拌浆的形状有关。（影响因素）

③温控与能耗：

高压匀浆：活性物失活与产生热有关系，一般需多级操作，每次循环前要进行级间冷却。能耗：提供动力（ρ）+低温维持的耗费；高速珠磨：珠磨机采用夹套冷却的方式实现温度控制的。能耗与细胞破碎率成正比

④适用范围：高压匀浆适用于酵母和大多细菌细胞的破碎,不适用于易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性菌，含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）高速珠磨珠磨法适用于细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理。

⑤破碎率R的影响因素高压匀浆：温度、压力、循环次数、微生物种类；高速珠磨：搅拌速度、细胞悬浮液浓度、温度、玻璃小珠的装量和直径、循环速度

2.细胞破碎的条件

3.包涵体变性与复性，提高收率的方法

包含体是无定形的蛋白质的聚集，不被任何膜所包围。细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密，低速离心就可以沉淀。包含体难溶于水中，在变性剂溶液（如盐酸胍、脲）中才能溶解。在这些溶液中，溶解的蛋白质呈变性状态，即所有的氢键、疏水键全被破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结构和共价键不被破坏。因此当除去变性剂时，一部分蛋白质可以自动折叠成具有活性的正确构型，这一折叠过程称为蛋白质的复性。

提高复性效率的方法：降低变性剂浓度，但如果太低，复兴率会降低；增加蛋白浓度、PH 偏碱；温度、离子强度、氧化还原条件。

1.盐析法概念、规律、方程式

概念：蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低、发生沉淀的现象称为盐析。

机理：（1）高浓度盐离子使蛋白质表面双电层厚度降低，静电排斥作用减弱.在布朗运动的互相碰撞下容易发生凝聚，进而沉淀析出。

（2）中性盐比蛋白质具更强的亲水性，因此将与蛋白质争夺水分子，使蛋白质水化膜破坏。

方程式：

S:蛋白质的溶解度,g/L I:离子强度

Ks：盐析常数，斜率，与温度和pH无关，与盐和蛋白质的种类有关。

β : 常数,截距,与盐的种类无关,与温度、pH和蛋白质种类有关

2. Ks β

Ks：盐析常数，与溶液的pH及温度无关，只依赖于蛋白质及盐的种类；

β值为蛋白质在纯水中即离子强度为零时的假想溶解度对数值。

用盐析法分离蛋白质时可以有两种步骤：

① Ks分级盐析法: （粗提蛋白质时常用）②β分级盐析法: （进一步纯化用）

Ks盐析法：在一定pH和温度下，改变体系离子强度进行盐析的方法；

β盐析法：在一定离子强度下，改变pH和温度进行盐析的方法；

Ks盐析法由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，因此常用于提取液的前处理；β盐析法由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，常用于初步的纯化。

2. Ks盐析法：受蛋白质种类和盐的种类的影响，盐析效果：高价阴离子大于低价阴离子低价阳离子大于低价阳离子β盐析法：受PH、温度、蛋白质种类的影响，PH值接近PI，β最小；在高浓度盐中，β值随温度升高而减小。

3盐饱和度范围的确定：不使目标蛋白质沉淀的最大饱和度和使目标蛋白质沉淀的最低饱和度1.过滤方法比较五种

纳滤孔径2nm滤膜压力差能截留分子量在200~1000之间的有机物质，能将高价离子和低价离子分离。这类膜对荷相同电荷的分子有较高的截留率。

2.RO分离机理是一种以压力差为推动力，从溶液中分离出溶剂的膜分离操作，孔径范围在0.0001-0.001 μm之间；

3.浓差极化和膜污染

浓差极化:当溶剂透性膜而溶质留在膜上，因而使膜面浓度增大，并高于主体溶液中的浓度， 这种浓度差导致溶质自膜面反扩散至主体溶液中，这种现象称为浓差极化.它对 通量的影响很大。要减少浓差极化，通常采用错流过滤操作。

膜污染：在使用中，尽管操作条件保持不变，但通量仍逐渐降低的现象，称为污染。一般认 为是膜与料液中的某一溶质的相互作用，或吸附在膜上的溶质与其他溶质相互作 用而引起的。在反渗透中一般不严重，在超滤和微滤中比较严重。

浓差极化会加重污染。但两者是有区别的；浓差极化是可逆的，变更操作条件可使之消除，而污染不可逆，必须通过清洗的办法，才能消除。

4.截留率和截留分子量

截留率：指超滤膜对溶质的截留能力,用σ（R ）表示,并定义为

式中CP 和Cb 分别表示在某一瞬间，透过液和截留液的浓度。σ

截留分子量：定义为相当于一定截留率（通常为90%或95%）时的溶质的分子量。

1.溶剂萃取的分配原理

分配定律：一定T 、P 下，溶质在两个互不相溶的溶剂中分配，达到平衡后溶质在两相中浓度之比为常数（K ）。

在常温常压下Ｋ为常数:（1）稀溶液（2）溶质对溶剂互溶没有影响（3）必须是同一分子类型，不发生缔合或离解.

由上图可知，溶质在两相的分配决定于选择何种溶剂和水相的pH 。

1.双水相萃取的概念，分离原理、影响因素、应用

概念：是利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法。

原理：不同物质分配系数的差异，构成了双水相萃取分离物质的基础。

溶质在两水相间的分配主要由其表面性质所决定，通过在两相间的选择性分配而得到分

离，分配能力的大小可用分配系数K 表示：

影响因素：1）成相聚合物的相对分子质量：当聚合物的相对分子量降低时，会使蛋白质易分配于富含该PEG 的相中，使分配系数增大，而葡聚糖的分子量减小，会使分配系数降低。

2）成相系统的总浓度:当接近临界点时，蛋白质均匀的分配于两相，分配系数接近于 1.如成相聚合物或聚合物/盐混合物的总浓度增加时，系统远离临界点，系线的长度增加，此时两相性质的差别增大，蛋白质趋向于向一侧分配，即分配系数或增大超过1，或减少低于1.

3）盐类的影响：在双水相聚合物系统中，加入电解质，首先阴阳离子会有不同的分配.加入适当的盐类，会大大促进带相反电荷的两种蛋白质的分离。但当[盐]继续增加时，影响逐渐减弱，分配系数基本上无变化。当[盐]很大时，由于盐析作用，pro 易分配于上相。

4）pH 值：①由于pH 值影响protein 的离解度，故调节pH 可改变蛋白质的表面电荷数，因萃余相的浓度萃取相的浓度==21C C K