微生物学专业-《微生物工程》课程考试试卷 - 副本

江西农业大学《微生物工程》课程考试试卷

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考试日期：2015.01.15

试卷所需时间：120分钟开卷试卷总分：100分

一、加强对生物质能的利用已经成为各国解决目前所面临的能源危机和环境污染问题的一项重要的解决办法。请你论述下发展生物质能源的战略地位，以及目前国内外生物能源技术的研究进展和利用现状，并进一步分析生物能源技术面临的挑战和未来的发展趋势。（25分）

掠夺性的资源开发利用，肆无忌惮的环境影响破坏，最终会导致资源能源的消耗殆尽，气候的变化无常。能源问题己经上升到了国家安全的角度，“能源危机”促使众多发达国家把目光转向可再生能源的开发和利用方面，海洋能、风能、太阳能、生物质能等可再生能源产业得到了更多的关注。但在可再生能源中，由于核能、太阳能、地热、风能，或因技术限制、或因区域性资源限制等原因发展缓慢；生物质能却以资源丰富、生态环境友好受到重视，其中又以生物柴油作为最直接替代化石能源的生物质能为代表。因此生物质能源的大力发展，对我球能源安全具有重要的战略意义。

自然界的生物质包括种类丰富的物质资源和基因资源，以及数量可观的可回收利用资源。各国根据本地区不同的生物质资源和技术优势，选择了不同的生物质资源研究重点，并处于不同的技术发展水平。

国外生物质资源研究情况：AngeloBressan和Elisiocontini对巴西甘蔗、食糖和乙醇的生产、出口和消费进行了探究。Keijiohga和TatsujiKoizumi选取中国的生物乙醇项目、马来西亚的生物柴油项目、日本的生物乙醇项目，建立经济学模型分析了中国燃料乙醇项目对世界玉米市场的影响、日本生物燃料乙醇进口对巴西和世界食糖市场的影响，阐述了“亚洲生物燃料政策对世界农业和生物燃料贸易的影响”。英国森林研究所的JimLynch从整体上分析了2005年世界生物质燃料生产情况，从环境成本和收益角度分析生物质能源政策。2007年6月，为了推进生物质能的研究与发展，美国能源部建立了三个新的生物质能研究中心，重点开展生物燃料的基础研究，包括专用能源植物白杨和柳枝翟等的研究，面向生物质改良和转化的基因组学基础研究，新型生物质降解酶或微生物的研究等。

国内生物质资源研究情况：1、生物质气化利用，我国从发展生物质气态利用一开始，就立足于我国资源的特色，发展“四位一体”模式、西北“五配套”、南方的“猪一沼一果”模式等,实现了以生物质能气化技术为核心的生物质能综

合利用；利用秸秆气化制沼气项目也取得突破进展；另外,随着沼气技术不断进步,沼气工程和零部件生产基本实现了标准化，沼气利用和开发也正在走向产业化和规模化，并进行了乡村沼气服务网点建设。2、生物质液体燃料，生物质液化应用主要产生用作汽油、柴油替代燃料，如燃料乙醇和生物柴油，是生物质能源开发利用的重要方向，我国生物质液化制燃料应用还处于初级阶段。3、生物质固体成型，直接燃烧、压缩成型燃料。综上可以发现，尽管我国在政策上采取了多种生物质能源的推进措施。在技术上掌握了多种生物质能源的利用方法，但无论是政策!技术还是产业的发展上，我国生物质能源与国外相比存在较大的差距。匡廷云(2005)等在《生物质能研发展望》中，强调基础研究的重要性，建议充分利用生物的多样性筛选优良能源植物树种、草种；重视生物质能源基地海洋的开发，发展水生微藻光合生物制氢等的研究。陈鹏,蒋卫东等(2007.4)在《三种植物油及其生物柴油中脂肪酸组成的比较研究》中,通过对麻疯树，青刺果及乌柏三种产于西南的油料植物油分的理化性质及它们的生物柴油进行GC/Ms分析，以麻疯树油为参照油分，对比青刺果油和乌柏油，找出适合作生物柴油油料植物油分的特点，为生物柴油油料一植物的选择提供了依据。王莉(2009.2)在《生物能源的发展现状及发展前景》中，阐述了燃料乙醇、沼气、生物柴油原材料的种类，来源及生产工艺。杨蓓兰(2009.5)在《替代燃料的现状与发展趋势》中，对诸如生物柴油!燃料乙醇等替代燃料的种类和特点进行分析。等国内外生物质能技术研究情况：1.生物质发电技术，利用现代化的锅炉技术将生物质直接燃烧发电,具有低成本、低风险、低污染、较高能效等优越性。2.生物质气化技术，目前气化技术已进入应用阶段，特别是生物质气化集中供气技术和中小型生物质气化发电技术，由于投资较少，比较适合农村地区分散利用，具有较好的经济性和社会效益。3.生物质液化技术，目前国外在燃料乙醇生产技术产业化方面进展较快的单位主要有fogen公司、BCI公司、Arkenol公司，国内有华东理工大学和河南天冠集团。4.生物质固化技术，是指在高压下通过生物质中木素的塑化粘合把疏松的生物质压成密度极高的成型材料，以便利用、运输、贮藏和高效率燃烧。5.生物质工程技术，在生物质工程领域，各国正在积极开展木质纤维素分子对生物转化的抗性一由多糖降解为可发酵糖，通过微生物代谢工程和基因工程研究利用可发酵糖生物转化、产物分离三大技术。

二、请你从过程工艺控制以及发酵设备的角度，论述下国内外有关“工业微生物发酵过程的优化与放大”的研究进展。（25分）

在发酵过程中，要补充的营养剂主要是碳源和氮源。氮源是通过控制发酵液的pH 值流加氨水补充，碳源则是采用流加基质糖的方法来控制。通过流加

氨水来控制pH 值的技术现在已比较成熟；然而由于发酵过程是动态的非线性、时变性、不确定性的生化过程，发酵过程中的重要生物参数（如菌体浓度、产物浓度、基质浓度）因缺乏可靠的生物传感器而无法在线测量，缺乏精确的发酵状态预估模型，导致实现流加基质糖的在线优化控制难度比较大。补料分配发酵过程补料流加率的优化控制广为人们关注，补料优化已成为很多发酵过程的优化控制的关键问题。最优控制理论是现代控制理论中的核心内容之一。其实质是：在满足一定约束条件下，寻求最优控制规律(或控制策略)，使系统在规定的性能指标(目标函数)下获得最优值，即寻找一个容许的控制规律使动态系统（受控对象）从初始状态转移到某种要求的终端状态，保证所规定的性能指标达到最小(大)值。一些学者基于发酵过程动力学原理、物料平衡原理和人工神经网络等方法建立模型，采用最大值或最小值原理、动态规划理论以及序列二次规划算法（Sequential Quadratic Programming, SQP）、模糊控制理论和遗传算法等方法进行优化控制，取得了一定的成绩。

近年来，优化算法得到了迅速的发展，许多性能优越的算法被广泛地应用于工业过程的在线优化。其中利用神经网络得到过程的模型，再通过优化算法对其进行优化求解，是解决那些工艺流程复杂，机理不甚清楚或者物性参数难以获得对象的过程系统在线优化问题的可行之路。发酵过程优化过程中，经常会出现多个相互之间具有竞争性的最优指标，此时，单目标优化无法实现发酵过程最优，为解决这一问题，多目标优化策略被引入发酵过程优化控制。

目前，智能优化算法的研究成果相当分散，国内外在相关方面的研究工作主要是根据进化的原理设计新算法，或者将现有算法进行部分改进，以期对特定的实际问题取得好的优化效果。微生物发酵过程是极其复杂的生化反应过程，由于涉及到细胞的生长繁殖和产物代谢，其机理十分复杂，所得的数学模型常常存在比较严重的非线性、时变性和不确定性，给辨识和参数估计带来了较大的困难。同时由于缺乏可靠的传感器用于发酵过程变量的在线检测，妨碍了数据的及时获得。因而影响和限制了发酵过程的优化控制，以至于现有的发酵过程控制系统大多只是采用常规的控制方法，如定值控制、伺服控制等，其目的只是稳定操作条件，远不能通过对过程变量如温度、pH、溶氧和补料速率等进行优化，以确定控制变量的最优时间序列，使目标函数最大。随着组学技术的发展, 将各组学和系统生物学理论整合应用并模型化, 将是获得菌株改造、过程优化控制和放大新策略的重要途径,对微生物工业化生产也具有重要意义。

三、甲醛（Formaldehyde）是重要的化工原材料，但常造成空气和水体污染，给人们的身体健康带来很大的威胁。因此，分离筛选出高效降解甲醛的菌株具有重要的应用价值，例如Saeed Mirdamadi [World Journal of Microbiology and

Biotechnology, 2005, 21: 1299-1301.]就成功地分离到19种能以甲醛为唯一碳源的菌株。有研究发现，甲醛降解菌利用甲醛的途径如下图。

如果你的导师要求你分离筛选具分解和代谢甲醛能力的菌株，并对甲醛利用过程中的代谢特征变化进行研究，请简要叙述下你硕士论文可能的实验思路？（25分）材料与方法

1. 1 试验材料

1. 1. 1 1）基本培养基（g/L）：KH2PO4 0.7，K2HPO4 0.85，(NH4)2SO4 1.2，MgSO4·7H2O 0.1，CaCl2 0.01，FeSO4·7H2O 0.001，微量元素母液

0.1 mL，pH 7.0，115℃灭菌30 min。

1. 1. 2 土壤样品试验材料取自海南儋州某家具厂废水排放口淤泥。

1. 2 试验方法

1. 2. 1将少量土壤样品置于100 mL 无菌生理盐水中，加入玻璃珠震荡15 min 后静置。取15 mL 的上清液用针筒加滤膜过滤，将滤膜取出后置于无菌基本培养基中，并加入终浓度约为0.1 g/L 的甲醛溶液。将锥形瓶置于180 rpm、30 ℃摇床中恒温震荡培养。

将 1 mL 菌液加入9 mL 无菌生理盐水中，摇匀，制成10-1梯度的稀释液，按梯度稀释至10-2～10-5，从10-2～10-5梯度稀释悬浮液中吸取0.1 mL 于以甲醛作为唯一碳源的基本培养基平板上均匀涂布，空白组加入无菌水为对照。将平板置于30 ℃下倒置培养，对单菌落进行纯化培养，观察平板上单菌落形态：菌落的大小、颜色、形状、边缘形状等。

1.4.2 降解溶液中甲醛性能的测试：参照国标GB/T13197-1991 的乙酰丙酮分光光度法测定，取适量待测样品加入25 mL 具塞刻度试管，加ddH2O稀释至刻度线，加入

2.5 mL 乙酰丙酮溶液，颠倒数次混匀，60 °C 水浴15 min，室温冷却1 h，测波长414 nm 处的吸光度。根据测量降解前后甲醛OD 值，考

察菌株降解溶液中甲醛的性能，以水为对照。降解率(%)=(1?OD1/OD0)×100式中：OD0与OD1分别为降解前后的OD 值。

1. 2. 2 菌株鉴定

1. 2. 2. 1 菌株初步鉴定采用平板观察和显微观察法对分离获得的菌株进行初步鉴定。挑取少量纯化后的耐受菌孢子点植于平板中央，置于30 ℃恒温培养箱中培养8 d，观察菌落特征；将灭菌盖玻片插于平板上，置于30 ℃恒温培养箱中培养4 d，待菌丝铺满并已蔓延到玻片上后，将玻片取出于显微镜下观察其菌丝和孢子特征。

1. 2. 2. 2 基因组DNA提取CTAB法提取基因组

DNA（吴发红等，2009），采用rDNA-ITS序列通用扩增引物ITS1、ITS4（张志华和洪葵，2006）：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3' 和5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。PCR反应体系25.0 μL，其中，10×Taq Plus Re-action Buffer 2.5 μL，dNTPs（10 μmol/L）0.5 μL，引物（25 μmol/L）1.0 μL，模板DNA 2.0 μL，Taq DNA聚合酶（2.5 U/μL）0.3 μL，纯水18.7 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃1 min，56 ℃1 min，72 ℃1 min，进行35个循环；72 ℃延伸10 min。

1. 2. 2. 3 DNA序列测定和系统发生学分析ITS序列扩增产物经PCR产物纯化试剂盒纯化后进行测序分析，测序结果与NCBI的GenBank进行BLAST比对，并利用Clustal X和MEGA 5.0软件构建系统发育进化树。

四、生物科技的发展正在以“结构基因组学→功能基因组学（蛋白质组学）→系统生物学(system biology)→合成生物学(synthetic biology)”路径模式快速演进。某实验室拟对产活性物质A的菌株进行发酵放大的研究，其总体技术路线如下，请你从生物技术和生物工程专业发展趋势的角度评价下该技术路线。（25分）

生物合成途径中的关键基因进行了研究并在此基础上利用基因工程的技术手段

对工程菌的屮产件状进行了改良，