无内毒素质粒小量提取试剂盒(离心柱型)

无内毒素质粒小量提取试剂盒(离心柱型)

一、试剂盒组成、储存、稳定性

试剂盒在室温(15-25℃)干燥密闭条件下,可保存12个月,若在4℃条件下,则可保存更长时间;溶液Ⅰ在加入RnaseA 后,应置于4℃保存;RnaseA 在-20℃可稳定保存一年以上;若在4℃条件保存,溶液Ⅱ可能会产生沉淀,请在使用前于42℃加热溶解后使用。

二、原理简介

Sunbiotech 无内毒素质粒小量提取试剂盒采用碱裂解法裂解细胞,粗提物通过独特的内毒素清除剂选择性结合离心除去内毒素,然后离心吸附柱内的硅基质膜在高盐,低PH 值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA,再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除,最后低盐,高PH 值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA 从硅基质膜上洗脱。

三、实验准备

1.溶液Ⅰ已加入RnaseA,4℃密闭贮存。

2.第一次使用时,在漂洗液W2中按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇,混合均匀,室温密闭贮

存。

3.使用前注意观察溶液Ⅱ中是否有白色沉淀析出,如有沉淀,请于42℃左右温育溶解并冷却至

室温后再使用。

四、注意事项(实验前必须首先阅读这部分!)

1.所有的离心步骤如未加说明均在室温完成,使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机,

如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。

2.溶液Ⅲ和去蛋白液PE 中含有刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤,眼睛和衣服。试剂盒组成

保存SP03250次溶液Ⅰ

4℃15ml 溶液Ⅱ

常温15ml 溶液Ⅲ

常温20ml 漂洗液W1

常温30ml 去蛋白液PE

常温27ml 漂洗液W2常温35ml

第一次使用前按说明加指定量乙醇

内毒素清除剂4℃(1个月)

-20℃(长期)

5ml 洗脱液EB 常温

5ml RnaseA -20℃

150μl (10mg/ml )离心套柱常温

50套产品说明书

常温一份

若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗。

3.提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。一般高拷贝质粒建议接种单菌落于2-5

毫升加合适抗生素的LB培养基,过夜培养14-16个小时,可提取出多达20μg的纯净质粒。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒,应适当加大菌体使用量,使用5-10ml过夜培养物,同时按比例增加溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的用量,其它步骤相同。

4.要知道质粒DNA确切分子大小,必须酶切线性化后,对比DNA分子量Marker才可以知道,处于

环状或者超螺旋状态的的质粒泳动位置不确定,是无法通过电泳知道确切大小的。

5.无内毒素清除剂清除内毒素后质粒产量会有损失,根据不同的宿主菌株会损失10%-40%不等的质

粒产量。

五、操作步骤

1.用2ml离心管收集2-5ml在LB培养基中培养过夜的菌液,12000rpm离心30秒,弃尽上请。

*根据菌的浓度来决定沉菌的量,浓度高取2ml菌液离心收集即可以,浓度低在原管子里再加2ml菌液离心收集,提取低拷贝的质粒时,应增加收集菌体的量到10ml;

*细菌过量会影响裂解、中和效率及质粒DNA的率。

2.加入250μl溶液Ⅰ用振荡器充分悬浮细菌。

*确认溶液Ⅰ中已加入RnaseA。

*悬浮需充分,不应留有小的菌块,否则会影响菌体的裂解。

3.加入250μl溶液Ⅱ,温和充分地上下翻转混合4-6次,至溶液变澄清,此步骤不宜超过5分钟。

*避免剧烈混合,否则将导致基因组DNA的污染。若加入溶液Ⅱ后,溶液未

变澄清,请适当按比例增加溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的用量;

*溶液Ⅱ使用后应立即盖紧瓶盖,以免空气中的CO2中和溶液Ⅱ中的NaOH,

降低溶菌效率。

4.加入350μ1溶液Ⅲ,温和地上下翻转8-10次,室温静置2分钟。14000rp离心5分钟,或12000rpm离心10分钟。

*避免剧烈混合,否则将导致基因组DNA的污染。

*若离心后凝结块未沉到离心管底部,应再上下翻转混合数次,12000rpm离心3分钟。

5.小心取上清至一个1.5毫升的离心管,冰上预冷,取部分内毒素清除剂均匀预冷(上下翻转)

15分钟备用。

6.加入0.1体积冰预冷的内毒素清除剂到上一步所得上清,颠倒旋转混匀7-10次,冰浴或者冰上

放置20分钟,中间偶尔颠倒混匀几次。

*内毒素清除剂加入上清后,上清可能会变得浑浊,但是冰浴后应恢复清亮。

7.37℃水浴,溶液又会变为浑浊,颠倒混匀后37℃温育20-30分钟或直到溶液明显分为两相。

8.12,000rpm离心5分钟,30°C。离心温度必须至少大于25°C以上。

9.溶液必须分为两相,否则应重复步骤6-7。上层水相含DNA下层油状相含内毒素。

10.将含DNA的上层水相转移到新管(注意不要吸到油状层,含大量内毒素),弃油状层相。

11.将上一步所得上层水相中加入0.5体积漂洗液W1后充分混匀后分两批转入吸附柱AC中(吸附

柱放入收集管中),13,000rpm离心30-60秒,倒掉收集管中的废液。

12.可选步骤:加入500μl去蛋白液PE,13,000rpm离心30-60秒,弃废液。

*此步骤为了去除痕量核酸酶等杂质,如所用菌株为JM系列、HB101等endA菌株或野生型菌株,

核酸酶含量丰富,应加此步骤;如所用菌株为XL-1Blue和DH5α等缺陷型菌株,核酸酶含量

低,则可略过此步骤。

13.弃滤液后将内柱重新置于2ml外柱中,加入600μ1漂洗液W2,12000rpm离心1分钟,再用600μ1漂洗液W2洗涤一次。

*确认在漂洗液W2中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。

14.将吸附柱重新放回到2ml外柱中,12000rpm空离1分钟。

15.取出吸附柱,放入干净的离心管中,在膜中央加30-60μl洗脱液EB或去离子超纯水,室

温静置1分钟,12000rpm离心1分钟,管底溶液即为质粒DNA,将其置于-20℃保存。

*为了增加洗脱效率可在50-60℃预热洗脱液。

*测序时用超纯水代替洗脱液EB更好。

六、疑难解答(Trouble shooting)

常见问题可能的原因建议

得率低由于抗生素失效、培养基pH过低、

氧气供应不充分等原因导致质粒

在宿主菌中未得到有效的增殖。

改进细菌培养条件。

细菌过量,导致菌体未被有效裂

解。

按手册提供的参数操作。

细菌悬浮不充分,存留小菌块,导

致菌体未被有效裂解。

充分悬浮细菌。

溶液Ⅱ长时间暴露于空气中,被

CO2中和,导致菌体未被有效裂解。

溶液Ⅱ使用后立即盖紧瓶盖,以

免空气中的CO2中和其中的

NaOH。

洗脱不完全。按说明书提供的洗脱体积操作。洗脱液W2未加无水乙醇。按指定的体积加入无水乙醇。

基因组DNA污染可能是菌体太多或步骤3、4震荡

过于剧烈,染色体DNA断裂。

严格遵循说明书操作。

质量差的细菌(反复冻融的细菌、

陈旧的细菌、培养条件不合适的细

菌)中有许多断裂、降解而游离的

基因组DNA。

使用生长良好的新鲜细菌。

质粒DNA 出现切口、断裂、降解宿主菌富含核酸内切酶,未及时提

取质粒DNA。

从新鲜培养的细菌中提取质粒

DNA;增加一步洗脱液W1洗涤。质粒DNA在溶液Ⅱ中暴露过久,易

造成质粒DNA的切口断裂。

裂解步骤控制在5分钟内完成。

蛋白污染在步骤5转移上清的过程中,可能

混杂入白色的沉淀物。

请将上清转移至离心管中重新

离心。

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