【CN110004109A】一种肝癌类器官模型的体外构建方法【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910255261.0
(22)申请日 2019.04.01
(71)申请人 南通大学附属医院
地址 226001 江苏省南通市西寺路20号
(72)发明人 郑文杰 姚登福 张捷 金云峰
倪温恺 徐育青
(74)专利代理机构 南通市永通专利事务所(普
通合伙) 32100
代理人 葛雷
(51)Int.Cl.
C12N 5/071(2010.01)
C12N 5/09(2010.01)
(54)发明名称
一种肝癌类器官模型的体外构建方法
(57)摘要
本发明公开了一种肝癌类器官模型的体外
构建方法，将肝癌细胞、肝星状细胞及肝窦内皮
细胞，按特定比例混悬于培养基A；培养至第4天，
半量换液维持培养；第7天开始，换为培养基B，连
续培养7天；第14天传代扩增培养。本发明基于肿
瘤微环境中复杂的细胞构成，快速构建大小均
一、结构稳定、可检测抗癌药物有效性，并可扩增
培养的3D肝癌类器官体外模型。本发明构建的肝
癌类器官模型方法简易，构建迅速，可操作性强，
适用于研究肝癌发生发展机制、以及肝癌药物高
通量筛选等，
具有产业化意义。权利要求书1页 说明书4页 附图3页CN 110004109 A 2019.07.12
C N 110004109
A
1.一种肝癌类器官模型的体外构建方法，其特征是：包括下列步骤：
（1）将肝癌细胞、肝星状细胞及肝窦内皮细胞，混悬于培养基A，静置培养；（2）第4天使用培养基A半量换液，维持培养；（3）第7天换为培养基B培养7天；（4）第14天取肝癌类器官消化传代，消化后的细胞按步骤（1）~（3）的培养方法继续培养；所述培养基A包括：青霉素、链霉素、I型鼠尾胶原蛋白、维生素C、牛胰岛素、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、氢化可的松、谷氨酰胺、胎牛血清、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和DMEM/F12培养基；
所述培养基B包括：青霉素、链霉素、转铁蛋白、维生素C、牛胰岛素、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、氢化可的松、谷氨酰胺、胎牛血清、Wnt3a、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子和DMEM/F12培养基。
2.根据权利要求1所述的一种肝癌类器官模型的体外构建方法，其特征是：将肝癌细胞、肝星状细胞及肝窦内皮细胞，使用计数仪计数，按7:2:1的特定比例，混悬于培养基A。
3.根据权利要求书2所述的一种肝癌类器官模型的体外构建方法，其特征是：将肝癌细胞、肝星状细胞及肝窦内皮细胞，按特定比例混匀于培养基A后，计数并按每孔2000个细胞使用排枪均匀地接种于96孔-超低吸附圆底细胞板，每孔接种细胞混悬液体积为100μL。
4.根据权利要求书3的一种肝癌类器官模型的体外构建方法，其特征是：肝癌细胞、肝星状细胞及肝窦内皮细胞，按比例混悬于培养基A，接种于96孔-超低吸附圆底细胞板，然后放入37℃二氧化碳培养箱，静置培养，尽量避免移动。
5.根据权利要求书4所述的一种肝癌类器官模型的体外构建方法，其特征是：第4天半量换液一次，使用微量移液枪紧贴培养基液面，吸弃孔中50μL培养基，并加入等量培养基A。
6.根据权利要求书5所述的一种肝癌类器官模型的体外构建方法，其特征是：培养至第7天，使用微量移液枪，紧贴培养基液面，吸出旧培养基；再沿孔壁缓慢加入100μL培养基B，隔日吸弃50μL培养基，加入等量培养基B，持续培养7天。
7. 根据权利要求书6所述的一种肝癌类器官模型的体外构建方法，其特征是：培养至第14天，使用1000μL移液枪，吸出96孔板中所有类器官置离心管，吸弃上清，加入500μL Accutase放入37℃二氧化碳培养箱孵育30min，离心去上清后使用培养基A计数、重悬并稀释，按步骤（1）~（3）的培养方法继续培养。8. 根据权利要求书1、2、3或4所述的一种肝纤维化类器官模型的体外构建方法，其特征是：培养基A包括：100U/mL青霉素、100μg/mL 链霉素、2~10μg/mL I型鼠尾胶原蛋白，1μg/mL维生素C、10μg/mL牛胰岛素、2μmol/mL 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、10ng/mL氢化可的松、2~10μmol/mL谷氨酰胺、4~8%胎牛血清、10~50ng/mL表皮生长因子、10~50ng/mL碱性成纤维细胞生长因子和DMEM/F12培养基；培养基B包括：100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、2~10μg/mL转铁蛋白、1μg/mL维生素C、10μg/mL牛胰岛素、2μmol/mL 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、10ng/mL氢化可的松、2~10μmol /mL谷氨酰胺、8-12% 胎牛血清、2~50ng/mL Wnt3a、10~50 ng/mL表皮生长因子、10~50 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、10~100 ng/mL肝细胞生长因子和DMEM/F12培养基。
权 利 要 求 书1/1页2CN 110004109 A