基因敲除小鼠的PCR鉴定

基因敲除小鼠的PCR鉴定

一、实验目的：

通过PCR扩增程序及琼脂糖凝胶电泳方法鉴定凝血因子IX基因敲除小鼠的基因型。

二、实验原理：

真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来制备基因DNA。真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。

1.PCR原理：

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：

1) 模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

2) 模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

3) 引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍

2.琼脂糖凝胶电泳原理：

在pH8.0~8.3的缓冲液中，核酸分子带负电荷，向正极移动。由于不同大小和构象的核酸分子电荷密度大致相同，因此在自由泳动时，各种核酸分子的迁移率相似，无法分开。然而，在浓度适当的凝胶中，由于分子筛效应，使大小和构象不同的核酸迁移率出现差异，从而把它们分开。核酸在凝胶中的迁移率取决于其分子大小、高级结构、胶浓度和电场强度，与分子的碱基组成及电泳温度（4~30℃之间）无明显关系。一般说，同样构象的分子迁移率与分子量对数及胶浓度成反比，与电场强度（小于5V/cm）成正比。

三、实验操作

1.获取鼠尾组织

剪鼠尾0.5cm置于试管中，加入500ul裂解液和10ul蛋白酶K(20mg/ml)，55℃水浴过夜，至鼠尾溶解

2.提取基因组DNA

1) 试管中加入300ul饱和NaCl，充分混匀，12500rpm 离心20min

2) 取上清700ul至新的离心管中，加入预冷的异丙醇700ul，上下颠倒混匀，动作轻柔，直至看到絮状DNA析出为止

3) 500rpm 离心20min，小心吸去上清

4) 加入800ul 75%乙醇于离心管中，洗沉淀，12500rpm离心10min

5)晾干沉淀，加入100ul的PCR级的水

3.PCR扩增

1) PCR反应体系的建立：

按顺序在0.5ml塑料小试管中加入以下试剂：

2) PCR参数的设定:

95℃℃ 3min

95℃℃ 30sec

60℃℃ 30sec35个循环

72℃℃ 30sec

72℃℃ 5min

4.琼脂糖凝胶电泳

1) 制作电泳胶

2) 待凝固后即可上样，注意混匀时枪头不要吸进空气，防止产生气泡，上样时枪头应垂直插入上样孔。

3) 电泳（一般160V约30min,注意胶的位置，不要正负极倒置，电源接通后观察铁丝是否有气泡）

5.成像分析

电泳完后在紫外灯下观察电泳结果并摄像。

四、实验结果

1 2 5 3 4

1、小鼠1为敲除型（KO型）小鼠，其染色体双链均为敲除相关基因后的DNA链

2、小鼠2为杂合型小鼠，其染色体DNA中一条链为敲除了相关基因的DNA链

3、小鼠3为野生型（WT型）小鼠，其染色体双链均为未敲除相关基因的DNA链

4、Maker.分别显示一定长度的bp碱基电泳后应到的长度

五、实验讨论

PCR法因其具有快速、灵敏、费用低等特点,逐渐取代了传统的Southern杂交,被广泛应用于对基因敲除小鼠基因型的鉴定实验中。但在PCR扩增中,如果实验条件不合适,如引物设计不合理、模板DNA质量不高或被污染、反应体系中各成分因子比例失衡、PCR仪温控不准确、人为操作失误等,都容易导致不可靠或无可重复性的PCR扩增结果。

由于酶量过多或酶的质量差等原因，结果会引起涂状带或片状带，如实验结果中的5。

临床116 2011212015

林森