实验二 细菌的形态观察(简单染色法和革兰氏染色法)
实验二细菌的形态观察（简单染色法和革兰氏染色法）
一目的要求
1．了解简单染色法和革兰氏染色法的基本原理，熟练掌握细菌的涂片与革兰氏染色技术。
2．初步学习细菌细胞特殊结构的染色方法，并观察细菌的特殊结构。
3．观察细菌的菌落平板，学会识别大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落特征，学会初步鉴别微生物的种类的方法。
二实验内容与原理
1．简单染色法原理
简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法，一般用于观察个体形态与细菌排列。
由于细菌在中性、碱性或弱酸性环境中带负电荷，所以通常采用一种碱性染料如美蓝、碱性复红、结晶紫对细菌进行染色。美蓝是美蓝的盐酸盐，可解离为带正电荷的美蓝，很容易与细菌结合使菌体着色。染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。
简单染色过程：涂片→固定→染色→水洗→干燥→镜检
涂片→固定→干燥→水洗、吸干→镜检→染色 1mim
2．革兰氏染色法原理
革兰氏染色法是由丹麦医生 Hans Christian Gram于 1884 年创立。它是细菌学中很重要的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G + ）和革兰氏阴性菌（G －）两大类。
革兰氏染色过程：涂片→固定→结晶紫初染（1min）→碘液媒染（1min）→乙醇脱色（95% 酒精,30s）→番红复染（30 秒）→干燥→镜检
阳性菌：紫色阴性菌：红色
革兰氏染色要点：
（1）初染：用结晶紫，染色 1 分钟，水洗。
（2）媒染：加碘液覆盖 1 分钟后水洗。
（3）脱色：连续滴加 95％乙醇，约 30 秒，直到滴下的乙醇无色为止，水洗。
（4）复染：加番红染色 1 分钟，水洗。
（5）干燥。
（6）镜检：先低倍镜，后油镜观察。
注意：涂片要薄而均匀，脱色程度要控制得当。
学生做大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草杆菌的革兰氏染色。观察细菌个体形态与排列，绘图。
3．芽孢染色原理
细菌的芽孢壁比营养细胞壁厚，致密，透性差，着色和脱色都比营养细胞困难，故一般采用一种碱性染料并在微火上加热，或延长染色时间，使菌体和芽孢都染上颜色以后水洗或稀酸冲去菌体的染料，芽孢仍保留颜色，再用另一种对比鲜明的染料使菌体着色，如此可明显区分芽孢和营养体结构。
操作方法：
（1）用枯草杆菌涂片、干燥、固定。
（2）在涂菌处滴加 5％的孔雀绿染液，用木夹夹住玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但不沸腾 5－6 分钟。加热时应添加染料，以免蒸干。水洗。
（3）0.5％番红复染 1 分钟，水洗，烘干，镜检（芽孢绿色，菌体红色）。
4．荚膜染色原理
荚膜与染料亲和力低。在用简单染色法时，可以辨认出来。而通过荚膜染色也可以把它和细胞区别开来。
操作方法：
（1）涂片，晾干。
（2）用 Tyier 氏醋酸结晶紫溶液染色 2 分钟，再用 20%硫酸铜溶液洗涤，水洗，用滤纸吸干、干燥。
（3）镜检：荚膜染成浅红色，细胞呈紫红色。
5．鞭毛染色法原理
细菌鞭毛直径为 10-12nm，超过了光学显微镜的分辨能力。所以染色时，不仅要使鞭毛染色，还要使一部分染料堆积在鞭毛上，加粗鞭毛的直径以便能观察。鞭毛染色的方法很多，但染色成功的关键一是必须使用新鲜培养、活动活泼的菌体进行染色；二是使用绝对无油的干净玻片，以便菌液流过玻片时能保持自然形态。细菌的运动性，可通过悬滴法制片观察。注意区分布朗运动
和细菌本身的运动。
操作方法：
（1）载片的制备：经过严格清洗后，置于95%乙醇中浸泡，用时才取出，用火焰烧去酒精，立即使用。
（2）菌种的制备：取已活化 3-5 代的变形杆菌（或枯草杆菌）接种于新制备的肉汤琼脂斜面，斜面下部最好有冷凝水，培养 8-9h 即可使用。
（3）制片：在载玻片的一端滴一滴蒸馏水，挑取少许菌苔底部有水部分的菌体，将接种环悬放在水滴中片刻，再将载片稍倾斜，使菌液随水滴缓慢流到另一端，放平，晾干。
（4）染色：滴加鞭毛染色液 A，3-5分钟，小心水洗干净，然后滴加鞭毛染色液B，30-60 秒，水洗，晾干。
（5）镜检：菌体、鞭毛均为褐色。
悬滴法：
（1）在盖玻片上滴小半滴无菌水。
（2）以无菌操作挑菌，接种环在水上轻点几下。
（3）将盖玻片迅速翻转置于凹玻片上即可观察。
6．菌落特征的观察
注意细菌落形状、大小、颜色、光泽、透明度、干燥或湿润、粘稠度、隆起情况、边缘状况等等。
三实验材料
1．显微镜 1 台，载玻片数片，盖玻片数片。
2．枯草芽孢杆菌和大肠杆菌。
3．香柏油、二甲苯、察镜纸等。
四实验报告
1．绘出枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的个体形态图，并注明两菌的革兰氏染色的反应性。五思考题
1.革兰氏染色法涂片要薄而均匀，脱色程度要控制得当，为什么？
实验二+细菌的简单染色和革兰氏染色及其形态观察
实验二细菌的简单染色和革兰氏染色及其形态观察 1. 目的要求 （1）学习细菌涂片、染色的基本技术及无菌操作技术。 （2）掌握细菌的简单染色法，初步认识细菌的形态特征。 （3）了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。 2. 基本原理 （1）简单染色法 用单一染料进行细菌染色，操作简便，适于菌体一般形状和细菌排列的观 察。 常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱碱性溶液中，细 菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色，经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下易于识别。常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。 （2）革兰氏染色法 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为 两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类
物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现 红色。 革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料初染液；媒染剂；脱色剂和复染液。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革 兰氏染色的初染液一般是结晶紫。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或 附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘是常用的媒染剂。 脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱 色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精。复染液也是一种碱性染料，其颜色不 同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色 的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。 3. 材料及器材 (1) 大肠杆菌，枯草芽孢杆菌 (2) 革兰氏染色液，载玻片，显微镜等 4. 方法与步骤 Ⅰ涂片取两块载玻片，各滴一小滴蒸馏水于玻片中央，用接种环以无菌 操作分别从培养14～16h的枯草芽孢杆菌和培养24h的大肠杆菌的斜面上挑取少量菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。 载玻片要洁净无油迹；滴蒸馏水和取菌不宜过多；涂片要均匀，不宜过厚。 Ⅱ干燥室温自然干燥。 Ⅲ固定固定时通过火焰2～3次即可。此过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。
革兰氏染色的实验原理
革兰氏染色的实验原理 ●G＋细胞壁的网状结构致密，交联度高，用乙醇处理后，发生脱水作用，肽聚糖层孔径缩小，透性降低，故细菌仍保留初染时的紫色。 ●G－肽聚糖层较薄，交联度低，含较多类脂质，故用乙醇处理后，类脂质被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，细胞被脱色，经沙黄复染呈红色。 涂片固定→结晶紫初染（碱性）→碘液媒染→乙醇（丙酮）脱色→番红复染（碱性）
◆◆◆原理： 当用结晶紫初染后，所有细菌都被染成初染剂的兰紫色，碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫-碘复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要有舦聚糖形成的网状结构组成，壁厚，类脂含量低，用酒精脱色时细胞壁脱水，使舦聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫碘复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的兰紫色。革兰氏阴性细菌则不同，由于其细胞壁舦聚糖层较薄，类脂含量较高，，所以当脱色处理时，类脂质被酒精溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。 ◆◆实验步骤： 1、制片 涂片——干燥——固定 2、初染 滴加结晶紫染色1——2分钟，水洗； 3、媒染 用碘液冲去残水，并用碘液覆盖1分钟； 4、脱色 滴加95%酒精脱色，25-30秒，立即水洗； 5、复染 用番红液复染约2分钟，水洗； 6、镜检 干燥后，用油镜观察。 细菌：细菌是一种具有细胞壁的单细胞微生物，在适宜条件下，能进行无性二分裂繁殖，其形态和结构相对稳定。一般体积微小，通常需要借助光学显微镜才能看到，其测量单位用微米表示。
细菌简单染色法.
简单染色 微生物染色原理 简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。 常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷(酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷)，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着。染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。 常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。 使用草酸铵结晶紫染色液，染色迅速，着色深，菌体呈紫色。 步骤 1、涂片 1.取一块干净的载玻片，平放，在载玻片中央滴一小滴生理盐水； 2.用接种环无菌操作从琼脂斜面上挑取适量菌苔； 3.将挑取的菌苔沾入载玻片中央生理盐水中混匀并涂成薄膜。 注意：载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌不宜过多；涂片要涂抹均匀，不宜过厚。 2、干燥 将涂好菌膜的载玻片平放在室温下自然干燥。也可用电吹风低温吹干。 3、固定 手持(木夹夹住)已干燥的涂有菌膜的载玻片，涂面朝上，在酒精灯火焰上通过2~3次。 原理：加热使细菌细胞的蛋白质凝固，从而固定细菌细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。 注意：热固定温度不宜过高，否则会改变甚至破坏细胞形态。 4、染色 将热固定的细菌涂片平放于在载玻片架上，滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。 染色时间：吕氏碱性美蓝染色1~2min；石炭酸复红染色约1min；草酸铵结晶紫染色约1min。 5、水洗 将细菌涂片上染液倒入废液缸中；手持细菌染色涂片，置于废液缸上方，用洗瓶中自来水冲洗涂片，直至流下的水无色为止。 注意：水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下。水流不宜过急，过大，以免涂片薄膜脱落。 6、干燥 自然干燥：平放于室温，自然干燥； 吹干：用电吹风冷风或低温热风吹干； 吸干：平放在一张吸水纸上，上面覆盖一张吸水纸，将细菌涂片两面水分吸干。 配方 1、吕氏碱性美蓝染液 溶液A 美蓝0.6克；95%乙醇30毫升 溶液B 氢氧化钾0.01克；蒸馏水100毫升 分别配制溶液A和B 配好后混合即可。
微生物的革兰氏染色实验报告
微生物的革兰氏染色 一、实验目的： 1、学习并初步掌握革兰氏染色法； 2、了解革兰氏染色的原理； 3、巩固显微镜的使用。 二、实验原理： 革兰氏染色是细菌学中最重要的鉴别染色法。染色步骤分为四个部分： 1、初染：加入碱性染料结晶紫固定细菌图片； 2、媒染：加入碘液，碘与结晶紫形成一种不溶于水的复合物； 3、脱色：利用有机溶剂乙醇或丙酮进行脱色； 4、复染：复红配成碳酸复红作为复染剂。 成分占细胞壁干重的% 革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌肽聚糖含量很高（50~90）含量很低（~10） 磷壁酸含量较高（<50）无 类脂质一般无（<2）含量较高（~20） 蛋白质无含量较高G-和G+细胞壁的比较： 1、阳性（G+）菌细胞壁特点：细胞壁厚，只有一层，主要由肽聚糖构成，肽聚糖含量高，结构紧密，脂类含量低。当乙醇脱色时，细胞壁肽聚糖层孔径变小，通透性降低，结晶紫和碘的复合物被保留在细胞壁内，复染后仍显紫色（如芽孢杆菌）。 2、阴性（G-）菌细胞壁特点：细胞壁薄，由两层构成，内壁层和外壁层，细胞壁中脂类中脂类物质含量较高，肽聚糖含量较低，网状结构交联程度低，乙醇脱色时溶解了脂类物质，通透性增强，结晶紫与碘的复合物易被乙醇抽提出来，因此，革兰氏阴性菌细胞被脱色，当复染时，脱掉紫色的细胞的细胞壁又着上红色（例如大肠杆菌）。 三、实验步骤： 1、取一个载玻片，将其洗净并沿一个方向擦拭干净，直至液体不再其上收缩为止；将接种环整平，用灼烧过的接种环在混匀的菌种中取菌，按常规方法图片，应涂大，不宜过厚。 2、将涂片用火焰固定，不宜烤得太狠，否则菌种呈假阳性。 3、滴加1滴结晶紫染液，染色1min，水洗。 4、滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗 5、滴加脱色乙醇，脱色30~40s，不宜脱色太狠，否则菌种呈假阴性。 6、水洗，滴加番红复染液，复染1min，水洗，晾干 7、镜检并拍照。 四、注意事项： 1、选用活跃生长期菌种染色，老龄的革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性。 2、涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。 3、脱色是革兰氏染色是否成功的关键，脱色不够造成假阳性，脱色过度造成假阴性。实验结果与讨论： 1、结果： 高倍镜下观察的菌体图像：
细菌放线菌的观察与革兰氏染色实验报告
实验一：细菌、放线菌的形态 观察与革兰氏染色 姓名:陈虹邑 学号：200911233012 系别：生物科学与生物技术 班级：周二第一组 试验日期：2011年9月13日 同组成员：邢悦婷呼波
一、实验目的及意义 1、巩固油镜的使用; 2、掌握细菌形态观察的基本方法； 3、了解细菌的基本形态和结构。 4、了解革兰氏染色的原理； 5、初步掌握细菌涂片的方法； 6、掌握革兰氏染色的方法； 7、掌握放线菌的涂片方法； 8、观察基内菌丝、气生菌丝和孢子丝。 二、实验材料与方法 【实验材料】 菌种：溶血链球菌(Strptococcus haemolyticus),螺菌(Spirillum sp.) ,巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium), 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis), 普通变形菌(Proteus vulgaris), 丙酮丁酸梭菌(Clostridium acetotylicum), 褐球固氮菌(Azotobacter chroococcum)等细菌永久装片，放线菌5406，金黄色葡萄球菌 （staphulococcus aureus），大肠杆菌（E. coli） 试剂：香柏油、无菌水、结晶紫、番红或沙黄、95%酒精、碘液 仪器及用具：显微镜、擦镜纸、吸水纸、小滴管，接种环、载玻片、盖玻片、酒精灯 【实验方法】 细菌的观察 1、在载玻片上滴一小滴水，用接种环，采用无菌操作，将细菌挑起，涂到载玻片 上，盖上盖玻片。 2、用显微镜对细菌进行活体观察。观察时先用低倍镜，再用高倍镜，有必要的话， 再用油镜观察。 3、观察细菌的永久装片，观察时先用低倍镜，再用高倍镜，有必要的话，再用油 镜观察，找到细菌的各种结构。
微生实验报告 2012.10.10 实验一 细菌的简单染色和革兰氏染色
微生实验报告 姓名： xx 专业年级：2011级生物技术 学号：1032 实验二细菌的简单染色和革兰氏染色 一、实验目的 学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法的实验原理和实验操作。 二、实验原理 用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电何，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红、或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物，又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。 简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法，简单染色一般难于辨别细菌细胞的构造。 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法之所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多的易被乙醇溶解的类脂质，增加了细胞壁的通透性，使处染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔
径缩小，通透性降低，草酸铵结晶紫与碘的复合物不易被脱掉，因此细菌仍保留处染时的紫色。 三、实验器材 1、菌种： 金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌。 2、染色剂和试剂： 草酸铵结晶紫染液，卢哥氏碘液，95%酒精，番红复染液，复红染液，吕氏美蓝染液，显微镜擦拭液（乙醚： 乙醇=7:3），xx柏油。 3、器材： 废液缸，洗瓶，载玻片，接种环，酒精灯，擦镜纸，双层瓶，显微镜。 四、实验方法 （一）简单染色 1．涂片： 取干净载玻片一片，在载玻片的左右各加一滴生理盐水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂金黄色葡萄球菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌悬液。再取干净载玻片一块将刚制成的金黄色葡萄球菌浓菌悬液挑1~2环涂在左边制成薄的涂片，将大肠杆菌的浓菌悬液取1~2环涂在右边制成薄涂片。亦可直接在载玻片上制薄的涂片，注意取菌不要太多。 2．晾干： 让涂片自然晾干。 3．固定：
油镜的使用与简单染色法
实验一油镜的使用、简单染色法 一、实验目的 1、复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术，了解油浸系物镜的基本原理，掌握油浸系物镜的使用方法。 2、掌握细菌简单染色及无菌操作技术。 二、实验原理 （一）普通光学显微镜的构造 普通光学显微镜包括机械部分和光学部分两部分。机械部分包括镜座、 镜臂、镜筒、载物台、物镜转换器、粗调节螺旋、细调节螺旋、标本夹等。 光学部分包括接目镜、接物镜、反光镜、光圈（虹采）、聚光镜（集光器）等。 （二）油浸系的原理 浸系是在油浸镜与标本之间加1滴香柏油，调整光源检查细菌标本的方法。油浸镜是一种高倍放大的物镜，一般都刻有放大倍数，如95x、100x等。其镜头标记国产镜多用“油”字表示，国外产品则用“Oil”（Oil Immersion）或HI （homogeneous Immersion）表示。而且油镜的镜身较高倍镜和低倍镜为长，镜片最小，这也是识别的另一种标志。其使用原理是：由于香柏油与玻璃的折光率相似（香柏油为1.515，玻璃为1.52）。镜检时，滴加香柏油的作用是使光源尽
可能多的进入物镜中，避免光线通过折光率低的空气（折光率为1.0）而散失，因而能提高物镜的分辨率，使物像明亮清晰（见下图）。 图介质为空气（A）与介质为香柏油（B）时光线通过的比较 （三）细菌简单染色 细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。 常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。 三、实验用品 香柏油、二甲苯、擦镜纸、吕氏碱性美蓝染色液、石炭酸复红染色液、生理盐水、显微镜、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸、大肠杆菌（E.coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylocosccus aureus）的斜面菌种、滴管、烧杯、试管架。四、实验内容与方法 （一）光学显微镜的使用 调节光源→低倍镜观察→高倍镜观察→油镜观察 1、观察前的准备 ①将显微镜置于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约为4cm。坐正，练习用左眼观察。
试验二普通光学显微镜的使用及细菌的简单染色和革兰氏染色
实验二普通光学显微镜的使用及细菌的简单染色和革兰氏染色普通光学显微镜的使用 一、实验目的 以染色玻片及活菌为例，熟练掌握显微镜油镜的使用方法。 二、显微镜油镜使用的原理 1 普通光学显微镜的基本构造 （1）光学部分: 接目镜、接物镜、照明装置(聚光镜、虹彩光圈、反光镜等)。它使检视物放大, 造成物象。（2）机械部分: 镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件。它起着支持、调节、固定等作用。2 显微镜的放大倍数和分辨率（1）放大倍数=接物镜放大倍数×接目镜放大倍数 （2）显微镜的分辨率：表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力，可用公式表示为： D=λ/2n·sin(α/2 ) 式中D：物镜分辨出物体两点间的最短距离。 λ：可见光的波长（平均0.55μm） n: 物镜和被检标本间介质的折射率。 a：镜口角（即入射角）。3 油镜使用的原理 油镜，即油浸接物镜。当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。 三、实验材料 1 显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、盖玻片、接种环、酒精灯等。 2 细菌三种形态的玻片染色标本。 3 培养12-18h的枯草芽孢杆菌。四、实验方法与步骤 1 染色细菌玻片的油镜观查 （1）用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。 （2）调节光亮度。 （3）低倍镜观察：先粗调再微调至物象清晰。
（4）转入中倍、高倍观察，每一不只需调微调旋纽即可看到清晰的物象。 （5）油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，旋转转换器，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。 （6）绘出所观察到的细菌形态图像。 （7）、换片：另换新片观察，必须从（3）步开始操作。 （8）、用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去油镜头上的香柏油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。 2 活菌制片观察 取一张干净的载玻片，在其中央滴上一滴干净的蒸馏水，取培养12-18h的枯草芽孢杆菌一小环，在水滴上反复涂抹至菌体充分分散，盖上盖玻片，用吸水纸吸去多余的水分，按照油镜的使用步骤，观察草芽孢杆菌形态，边观察边绘图。 五、实验报告 油镜使用的原理 六、思考题 1 油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？ 2 使用油镜时，为什么必须用镜头油？ 3 镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？ 七、实验注意事项 1 不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。 2 镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度。 3 观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。 4 观察时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观察的习惯，以免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察时，右眼注视绘图。 5 拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。 6 显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。 细菌的简单染色和革兰氏染色 一、实验目的 1 学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色方法及革兰氏染色。 2 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 二、实验原理 1 简单染色的原理
实验二 革兰氏染色法
实验二革兰氏染色法 【实验目的】 1.学习并初步掌握革兰氏染色法。 2.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 3.巩固显微镜油镜的使用方法。 【实验仪器、材料】 1.菌种：大肠杆菌，金黄色葡萄球菌菌液。 2.染色剂：革兰氏染色试剂盒（结晶紫染色液、碘液、脱色液（95%乙醇）、复红染液）。 3.仪器及其他物品： 显微镜、香柏油、无水乙醇、载玻片、擦镜纸、滤纸、酒精灯、试管架、废液缸、记号笔、接种环、镊子、打火机等。 【实验内容】 革兰氏染色法 一、染色标本制备 1.涂片取一张洁净的载玻片，滴加少许生理盐水，用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环，与生理盐水研磨均匀，做一薄而均匀、直径约1cm的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌。（事先在载玻片的反面滴加菌液的相应位置做好标记） 2.干燥于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥。(温度不宜过高) 3.固定目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常
用加热法，即将细菌涂片膜向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。此制片可用于染色。 二、染色 l.初染滴加结晶紫覆盖菌膜，染lmin，自来水缓缓冲洗，甩去积水。 2.媒染滴加卢氏碘液，染lmin，水洗，甩去积水。 3.脱色滴加95%乙醇数滴，20s~30s，见紫色脱下立即用水冲洗，甩去积水。 4.复染滴加石炭酸复红液，染lmin，水洗，甩去积水，标本片用滤纸吸干。 三、镜检 待染色片充分干燥后，用油镜观察。 【实验结果】 葡萄球菌呈葡萄状排列，呈紫色，为革兰氏阳性菌； 大肠杆菌为散在的短小杆菌，呈红色，为革兰氏阴性菌。 注：绘图展示染色结果 【结果分析、讨论（结论与评价）】 注：分析你的染色结果是否正确？如果不正确，请分析原因。
细菌的简单染色
实验二细菌的简单染色、革兰氏染色 虽然各种类型的显微镜能够观察到微生物的各种形态结构，但一般实验室常用的是普通光学显微镜。由于细菌体积小且透明，在活体细胞内又含有大量的水分，因此，对光线的吸收和反射与水溶液相差不大。当把细菌悬浮在水滴内，放在显微镜下观察时，由于与周围背景没有显著的明暗差，难于看清它们的形状，更谈不上识别其细微结构。而经过染色，就可借助颜色的反衬作用比较清楚地看到菌体形态，亦即菌体表面及内部结构着色与背景形成鲜明对比，这样便可在普通光学显微镜下清晰地观察到微生物的形状和结构，而且还可以通过不同的染色反应来鉴别微生物的类型和区分死、活细菌等，因此，微生物染色技术是观察微生物形态结构的重要手段。 本实验通过对细菌的染色观察，使同学们在掌握细菌染色技术的基础上，了解各种其他的染色制片技术；观察微生物的各种形态结构，以巩固课堂知识，增强感性认识。 一、目的要求 1．学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的单染色方法及无菌操作技术。 2．巩固显微镜的使用方法。 二、基本原理 1.简单染色法：所谓单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。 在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以常用碱性染料进行染色。碱性染料并不是碱，和其他染料一样是一种盐，电离时染料离子带正电，易与带负电荷的细菌结合而使细菌着色。例如，美蓝（亚甲蓝）实际上是氯化亚甲蓝盐，它可被电离成正、负离子： 带正电荷的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。常用的碱性染料除美蓝外，还有结晶紫（crystal violet）、碱性复红（basicfu-chsin）、番红（又称沙黄，safranine）等。 细菌体积小，较透明，如未经染色常不易识别，而经着色后，与背景形成鲜明的对比，使易于在显微镜下进行观察。 2.革兰氏染色法：是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。 G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经复红复染后就成红色。 G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。 革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal violet）。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精（ethanol）。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染
实验四 细菌的革兰氏染色与芽孢染色
实验四细菌的革兰氏染色与芽孢染色 一、目的要求 1.学习并初步掌握细菌的革兰氏染色法。 2.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 二、实验材料 1.菌种：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）大肠杆菌（E.coli） 2.试剂：草酸铵结晶紫、路哥氏碘液、95%乙醇、番红液 3.其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、无菌水、香柏油、二甲苯等。 三、实验原理 革染氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。是1884年由丹麦病理学家Christain Gram创立的。通过革兰氏染色可把细菌区分为两大类。 革染氏染色的基本步骤：先用结晶紫初染、次经碘液媒染、再用95%乙醇脱色、最后用蕃红复染。经过此法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革染氏阳性菌；如果细胞染上复染的红色的细菌为革染氏阴性菌。大肠杆菌是标准的革染氏阴性菌，金黄色葡萄球菌是标准的革染氏阳性菌。 革染氏染色的机理，与细菌细胞壁的化学组成和结构有关。经结晶紫初染以后，所用的细菌都被染成蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合形成复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用乙醇脱色时，两类细菌的脱色效果是不同的，革染氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色处理时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内；革染氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖层在内层且较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂被乙醇溶解、细胞壁透性增加，使结晶紫-碘的复合物被洗脱出来。用蕃红复染时染上红色。 四、操作步骤 1.细菌的活化：将细菌接种营养琼脂斜面，培养约24h。 2.制片：取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。 3.初染：于制片上滴加结晶紫染液，染色1min后，用水洗去剩余染料。 4.媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。 5.脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，直接用95%乙醇从载 玻片上端冲洗脱色，直到流下的酒精无明显的紫色时，立即水洗。酒精的浓度、用量及涂片厚度都会影响脱色速度。脱色是革兰氏染色中最关键的一步。 6.复染：滴加番红液，染色2min，水洗。 7.用滤纸吸干，油镜镜检。 五、注意事项 为了保证革染氏染色结果的正确性，制片过程中要注意：要选用活跃生长的幼培养物作革染氏染色，涂片不宜过厚，火焰固定不已过热，脱色时间的控制。另外，可选用标准的革染氏阳性菌和革染氏阴性菌和未知菌一起混合涂片和染色。 六、实验内容 1.分别对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌进行革兰氏染色 2.对上述两种菌进行混合涂片，再进行革兰氏染色。 七、实验报告
7细菌的革兰氏染色 (1)
微生物实验报告 细菌的革兰氏染色及形态观察 一、目的要求： 1、熟悉光学显微镜的使用方法。 2、掌握革兰氏染色法。 3、掌握大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的染色结果和形态特征 二、器材和器皿： 1、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌 2、革兰氏染色液、香柏油、二甲苯 3、显微镜、擦镜纸、酒精灯、载玻片、盖玻片、接种环等 三、实验原理： 革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，1884年由丹麦医师Gram 创立。未经染色的细菌，由于其与周围环境折光率差别很小，在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。革兰氏染色属复染法。 该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。 G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。 G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色，呈现蓝紫色。 四、实验步骤： 1、取载玻片用纱布擦干，涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。 2、涂片： 液体培养基：左手持菌液试管，在酒精灯火焰附近5cm左右打开管盖；右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从试管中沾取菌液一环，在洁净无脂的载玻片上涂直径2mm左右的涂膜，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。 固体培养基：先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀。 3、晾干：让涂片在空气中自然干燥。 4、固定：让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。 5、染色：在菌膜上滴加草酸铵结晶紫液，染1min。 6、水洗：用蒸馏水轻轻冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。简单染色结束可观察细胞形态。 7、媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。 8、脱色：吸去残留水，连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无紫色，立即水洗。 9、复染：滴加蕃红复染约2min，水洗。至此，革兰氏染色结束。
微生实验报告 2012.10.10 实验一 细菌的简单染色和革兰氏染色
微生实验报告 姓名：王晶晖 专业年级：2011级生物技术 学号：040312011032 实验二细菌的简单染色和革兰氏染色 一、实验目的 学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法的实验原理和实验操作。 二、实验原理 用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电何，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红、或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物，又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。 简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法，简单染色一般难于辨别细菌细胞的构造。 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法之所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多的易被乙醇溶解的类脂质，增加了细胞壁的通透性，使处染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，草酸铵结晶紫与碘的复合物不易被脱掉，因此细菌仍保留处染时的紫色。 三、实验器材 1、菌种：金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌。 2、染色剂和试剂：草酸铵结晶紫染液，卢哥氏碘液，95%酒精，番红复染液，复红染液，吕氏美蓝染液，显微镜擦拭液（乙醚：乙醇=7:3），香柏油。 3、器材：废液缸，洗瓶，载玻片，接种环，酒精灯，擦镜纸，双层瓶，显微镜。 四、实验方法 （一）简单染色 1．涂片：取干净载玻片一片，在载玻片的左右各加一滴生理盐水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂金黄色葡萄球菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌悬液。再取干净载玻片一块将刚制成的金黄色葡萄球菌浓菌悬液挑1~2环涂在左边制成薄的涂片，将大肠杆菌的浓菌悬液取1~2环涂在右边制成薄涂片。亦可直接在载玻片上制薄的涂片，注意取菌不要太多。 2．晾干：让涂片自然晾干。 3．固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰（通常2~3次）固定（具体温度以不烫手为宜）。 4．染色：将固定过的涂片加复红染色1~2min 5．水洗：用水洗去涂片上的染色液。 6．干燥：将吸过地涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。 7．镜检：先用低倍镜观察，再用高倍镜观察，找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上滴加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌形态。 （二）革兰氏染色
简单染色法与革兰氏染色法
简单染色法与革兰氏染色法 （一）细菌的简单染色法 1 目的 1.1 学习微生物涂片、染色的基本技术。 1.2 掌握细菌的简单染色法。 1.3 初步认识细菌的形态特征，巩固学习油镜的使用方法和无菌操作技术。 2 原理 细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。 常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。 当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。 染色前必须固定细菌。其目的有二：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形态。 3 材料 3.1 菌种 枯草芽孢杆菌12～18h营养琼脂斜面培养物，藤黄微球菌(Micrococcus luteus)约24h营养琼脂斜面培养物，大肠杆菌（Escherichia coli）24h营养琼脂斜面培养物。 3.2 染色剂 吕氏碱性美蓝染液(或草酸铵结晶紫染液)，石炭酸复红染液。 3.3 仪器或其他用具 显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，玻片搁架、双层瓶(内装香柏油和二甲苯)，擦镜纸，生理盐水或蒸馏水等。 4 流程
实验6 细菌的革兰氏染色
实验6 细菌的革兰氏染色 一、实验目的和内容 目的：初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色法步骤。 内容：1．制作细菌染色装片。 2．进行革兰氏染色法操作。 二、实验材料和用具 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽胞杆菌菌液，待测菌菌液1～2种。 革兰氏染色液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液等)、香柏油、二甲苯；显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯。 三、操作步骤 (一)制片 1．涂菌用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环，用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而均匀、直径约lcm的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌。 2．干燥于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥(温度不宜过高)。 3．固定目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常用加热法，即将细菌涂片膜向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。此制片可用于染色。 (二)染色 l．初染于制片上滴加结晶紫染液，染lmin后，用水洗去剩余染料。 2．媒染滴加卢戈氏碘液，lmin后水洗。 3．脱色滴加95%乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止(根据涂片之厚薄需时30s至lmin)，水洗。 4．复染滴加石炭酸复红液复染lmin，水洗。 5．滤纸吸干，油镜镜检。 (三)结果 革兰氏阳性菌染成蓝紫色，革兰氏阴性菌染成淡红色。 (四)检测未知菌 用以上方法对未知菌进行革兰氏染色，并绘图、记录染色结果。 四、注意事项 1. 涂片务求均匀，切忌过厚。 2．在染色过程中，不可使染液干涸。 3．脱色时间十分重要，过长，则脱色过度，会使阳性菌被染成阴性菌；脱色不够，则会使阴性菌被染成阳性菌。 4．老龄菌因体内核酸减少，会便阳性菌被染成阴性菌，故不能选用。 五、实验报告 (一)绘图 1．大肠杆菌革兰氏染色视野图。 2．金黄色葡萄球菌或苏云金杆菌革兰氏染色视野图。 (二)记录革兰氏染色法法步骤，并进行结果分析。 (三)未知菌的检测结果。 六、问题和思考 1．涂片后为什么要进行固定?固定时应注意什么? 2．什么是革兰氏染色法?染色过程应注意什么? 3．试分析革兰氏染色法在细菌分类中的意义。
细菌的简单染色和革兰氏染色
实验细菌的简单染色和革兰氏染色一、目的要求 1、学习制染色片技术，学习简单染色的原理和方法。 2、初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色法步骤。 二、实验原理 细菌的菌体很小，活细胞的含水量在80％～90％，因此对光的吸收和反射与水溶液相差不大，所有观察其细胞结构必须染色。根据实验目的不同，可分为简单染色法、鉴别染色法和特殊染色法等。本实验只学习前两种。 简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的，是细菌学上最常用的 鉴别染色法。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。 三、实验器材 菌种：培养24小时的大肠杆菌 染色剂和试剂：石炭酸复红染色液，革兰氏染色液(草酸铵结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液等)，香柏油、二甲苯 器材和器皿：显微镜，酒精灯，载玻片，盖玻片，接种环，擦镜纸，吸水纸，火柴，小烧杯，玻片架、试管、小滴管等 四、操作方法 1、简单染色： （1）涂片：取干净的载玻片一块，滴一小滴生理盐水于载玻片中央，严格按无菌操作程序，挑取大肠杆菌于载玻片的水滴中，调匀并涂成薄膜。注意滴生理盐水时不宜过多；涂片必须均匀；涂布面积直径约1.5cm为宜；挑取菌种时切勿将培养基挑破。 （2）晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。 （3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）（4）染色：将固定过的涂片放在搁架上，加复红染色1-2min。 （5）水洗：染色时间到后，用自来水冲洗，直至冲下之水无色时为止。注意冲洗水流不宜过急，过大，水由玻片上端流下，避免直接冲在涂片处。 （6）干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。 （7）镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。 2、革兰氏染色： （1）涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。
革兰染色实验报告
实验原理： 1）G+菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入；同时乙醇使细胞壁脱水形成一道屏障，阻止结晶紫—碘复合物从胞内渗出。G-菌的细胞壁结构疏松，肽聚糖层很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖又均含大量脂质，易被乙醇溶解，导致细胞壁通透性增加，胞内结晶紫-碘复合物被乙醇溶解析出而脱色。 2）G+菌等电点（PI2~3）比G-菌（PI4~5）低，在相同PH条件下，G+菌所带负电荷比G-菌多，故与带电的结晶紫染料结合牢固，不易脱色。 实验步骤： 一、标本的制备： 1、涂片： 取玻片在火焰上稍微加温，以清洁纱布擦净，放置桌上，左手握菌种管，有搜持接种环，用无菌接种环取生理盐水一滴，置于载玻片的中央，再用接种环在火焰上灭菌，待冷却后，取斜面培养的葡萄球菌或大肠杆菌少许与盐水混匀，直接取1~2环菌液作涂片即可，涂片应厚薄均匀。接种环采菌后，要通过火焰灭菌才能放下。 2、干燥： 目的是是菌体水分慢慢蒸发，固定菌形。涂片最好在室温中自然干燥，必要是将标本面向上，小心断续在弱火高处略烘，以助水分蒸发；但切勿紧靠火焰，以致标本烤枯，不堪检视。 3、固定：
手执玻片一端，标本面向上，在火焰外层快速地来回通过三次，共2-3秒，以玻片反面触及皮肤不觉过烫为度。冷却后，染色。目的是杀死细菌，是菌体与玻片粘附较牢以及改变对染料的通透性，因活的细菌一般不能使许多染料进入细胞。 二、染色 1、初染： 将涂片标本夹持于左手，滴加结晶紫溶液盖满涂抹面，染色1~3分钟，用流水缓缓冲洗（即将龙头打开使水缓慢流出，将玻片倾斜使水在玻片面上端沿玻片流下冲洗染液）直至无颜色流下为止。 2、媒染： 加卢戈氏染液4~5滴作用30秒到一分钟，再按上法冲洗，并将片上积水轻轻洒净。 3、脱色： 在95%酒精缸中脱色约3~5秒，拿出玻片使酒精由玻片流下，如此反复2~3次，直至流下酒精略呈淡紫色为止，现按上法以流水冲洗，并将玻片轻轻洒净。 4、复染： 用稀释石炭酸-复红（或沙黄液）复染半分钟后按上法冲洗。 5、镜检。 实验结果：G+葡萄球菌被染成紫色；G-大肠杆菌被染成红色。实验分析：实验中有些组的大肠杆菌被染成了紫色，而实际却应该为红色，这有可能与脱色的时间过少有关，因而将其染成紫色，
实验四、普通显微镜的使用及细菌的简单染色法
实验四普通显微镜的使用及细菌的简单染色法 一、实验目的 1.学习并掌握油镜的原理和实使用方法。 2.复习普通台式显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。 二、实验原理 （一）.普通显微镜普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜。它们由机械装置和光学系统两大部分组成。在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。而在普通光学显微镜通常配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大。使用油镜时，需在载玻片与镜头之间加滴油，原因：1.增加照明亮度。2.增加显微镜的分辨率。（二）.简单染色法简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。它适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。 常用碱性染料进行简单染色，因为：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带有负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更容易于识别。常用做染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。 三、实验器材 1.菌种枯草芽孢杆菌12~18营养琼脂斜面培养物及其装片。 2.染色剂吕氏美蓝染液、石炭酸复红染液。 3.仪器或其他用具显微镜，酒精灯，接种环，擦镜纸，生理盐水等。 四、操作步骤 1.涂片取两块载玻片，各滴一滴生理盐水于玻片中央，用接环以无菌操作从枯草芽孢杆菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。 2.干燥室温自然干燥。 3.固定涂面朝上，通过火焰2~3次。 此操作过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。 4.染色将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液于涂片上。 5.水洗倒去染液，用自来水冲洗，直至图片上流下的水无色为止。 6.干燥自然干燥，或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。 7.镜检涂片干燥后镜检。 （1）在低倍镜下观察。 （2）在高倍镜下观察。 （3）在油镜下观察：在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高，然后将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域加香柏油，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接。将聚光器升至最高位置并开足光圈，若所用聚光器的数值孔径超过1.0，还应在聚光镜与载玻片之间也加滴香柏油，保证器达到最大的