藻类的实验室培养

微藻的实验室培养

学生：林晓生学号：2120180414导师：杨缜教授

一、藻类的概述

藻类是原生生物界一类真核生物(有些也为原核生物，如蓝藻门的藻类）。主要水生，无维管束，能进行光合作用。藻类植物共约为2100属,27000种。根据所含色素、细胞构造、生殖方法和生殖器官构造的不同，分为绿藻门、裸藻门、轮藻门、金藻门、黄藻门、硅藻门、甲藻门、蓝藻门、褐藻门和红藻门。色素的颜色划分，藻可分为3类：绿藻、褐藻和红藻。

由于单胞藻具有利用太阳光能效率高、营养丰富、生长繁殖迅速、对环境的适应性强和容易培养等重要特性，因而受到重视。微藻是一类在陆地、海洋分布广泛，营养丰富、光合利用度高的自养植物，细胞代谢产生的多糖、蛋白质、色素等，使其在食品、医药、基因工程、液体燃料等领域具有很好的开发前景。

二、微藻的营养模式和生长模式

（二）、微藻的生长模式

藻类在培养过程中，生长繁殖的速度，出现一定的起伏，这种生长模式可划分为五个时期（延缓期、指数生长期、相对生长下降期、静止期、死亡期）。

三、培养按培养的场所分室内培养和室外培养

1）按培养基的形态分固体培养和液体培养 2）按培养的纯度分纯种培养和单种培养3）按藻液的流动情况分静止培养和循环流动水培养 4）按气体交换情况分充气培养和不充气培养 5）按藻液与外界接触程度分封闭式培养和开放式培养6）按培养规模和目的分小型培养、中继培养和大量培养方式

简单介绍其中的四种方式：

（1）纯培养和单种培养

纯培养（axenic culture）：是无菌培养，指排除了包括细菌在内的一切生物的条件下进行的培养。纯培养操作要求十分严格，要求有无菌室、超净台等设备，容器、工具、培养液等均须彻底灭菌。培养成功率很高，是进行科学研究不可缺少的技术。

单种培养（single-species culture）：指区别于纯培养的不排除细菌存在的培养（可以是生产性的，也可以是非生产性的）

（2）封闭式培养和开放式培养

封闭式培养（closed culture）：指把培养液密封在透明的容器中，与外界空气隔离，暴露在阳光中，CO2完全采用人工供给的方法。各种反应器等

开放式培养：指把藻类培养在开敞容器中，如广口玻璃瓶、水族箱、玻璃钢水槽、水泥池等。

（3）小型培养、中继培养和大量培养封闭式塑料薄膜袋培养，方法简单，成本低、培养的藻细胞密度大，不易污染且生产周期短，效果很好。

小型培养：一级培养，目的是培养和供应藻种，用于科研等。一般采用封闭式不充气一次性培养方式，培养容器一般采用100～3000ml的三角烧瓶。

中继培养：又称二级培养，目的是藻种扩大培养，供应生产性大量培养的藻种。一般在室内大的玻璃容器或塑料大袋中进行。

大量培养：也叫三级培养，目的是为培养动物提供大量单胞藻饵料。

有室内和室外两种。

目前主要采取室内、开放式、通气、一次性或半连续培养法，培养容器有大型玻璃钢水槽、大型水泥池或塑料薄膜袋等（也有用土池）。

单胞藻生产性扩大培养常用流程

四、实验室培养过程

1.消毒

2.配制培养液

3.接种

4.培养管理

5.收获

1容器、工具和水消毒方法总结

一级培养（实验室的培养）：金属器具和试管口、瓶口：直接灼烧；玻璃器皿：洗液+烘箱；纸、棉花、纱布：烘箱；培养用水：砂滤水→脱脂棉→煮沸→冷却（洗液：15g重铬酸钾+200mg浓硫酸混匀）

2.培养液和培养基的配方

配方极多，每种配方主要适用于一定藻种，这里介绍比较常用的几种：

水生4号和克诺普（Knop）培养液，一般用于绿藻；蓝藻可用朱氏10号或水生105号无氮培养基（后者适于固氮蓝藻）；硅藻可用朱氏10号和水生硅1号培养基；另外还有海产绿藻、硅藻的培养基。常用培养基配方见表1。

以上用水量都是加至1000mL，海藻培养液用海水，如无海水可用淡水1000mL加30克食盐代替。土壤抽出液用菜园土1份和水2份比例混合搅匀，静置，取上清液；海泥抽出液也可用同样比例制备。如配制固体培养基，可在培养液内加入1.5％琼脂。从以上各种配方，可看到配制藻类培养液的几条原则：

（1）要有适量氮源（除固氮蓝藻外），如氨盐、硝酸盐、有机氮等。

（2）应包括主要元素钾、磷、镁、硫、钙等。

（3）要考虑各种盐类总浓度和pH是否适合藻类需要，可用碳酸氢钠调节pH。

（4）要加入各种藻类需要的微量元素，如铁、锰、铜、锌等（后几种包括在土壤抽出液中）。

（5）要满足某些藻类特殊需要，如蓝藻需钼，硅藻需硅。

（6）要添加适量生长物质如维生索B1、B2等（包括在土壤抽出液中）。

3.藻种分离方法：常用下列四种。

1）微吸管（毛细管）分离选直径较细（约5毫米）玻管，在火焰上加热，待快熔时，快速拉成口径极细的微吸管。将稀释适度藻液水样，置浅凹载玻片上，镜检。用微吸管挑选要分离的藻体，认真仔细地吸出，放入另一浅凹载片上，镜检这一滴水中是否达到纯分离的目的。如不成功，应反复几次，直至达到分离目的为止。然后移入经灭菌的培养液中培养，一般在每个培养皿中接20～30个个体。从分离出少量细胞扩大培养到200毫升的培养量，如硅藻一般需20天以上。为了较长时期保存藻种，可将分离到的藻种用青霉素（1000～5000单位或链霉素（20ppm）处理后，获得较纯藻种。此法操作技术要求高，要细心。往往吸取一个细胞，要反复几次才能成功，且适于分离个体较大藻类。

2）水滴分离法用微吸管吸取稀释适度藻液，滴到消毒过载片上，水滴尽可能滴小些，要求在低倍镜视野中能看到水滴全部或大部分。一个载片上滴2～4滴，间隔一定距离，作直线排列。如一滴水中只有几个所需同种藻类个体，无其他生物混杂，即用吸管吸取培养液，把这滴水冲入装有培养液并经灭菌试管或小三角瓶中去。如未成功，需反复重做，直到达到目的。此法简便易行，尤其适宜于分离已在培养液中占优势种类。分离受少量生物污染培养液中的藻类多用此法。操作时同样要求细致、认真，使用工具及培养液经严格消毒。

3）稀释分离法把含有需要分离的藻类而又混杂有其他生物的水样，取其一定量，用培养液稀释。通过稀释到适宜程度的方法，达到把原混杂生物单个分离培养的目的。首先把水样稀释到每一滴含有一个左右的生物细胞（也可能一个都没有，也可能有两个），在稀释过程中配合显微镜检查，调节稀释度，然后准备装有

1/4容量培养液的试管20支，每一试管加入稀释适宜水样一滴，摇匀，进行培养。待藻类生长繁殖达一定浓度时，再检查是否达到分离目的，若未达到，再重复做。此法操作简单易行，但有一定程度盲目性，比不上水滴分离法效果好。

4）平板分离法这个方法的培养基制备和分离方法，与菌类的平板分离法基本相同，只是培养基配方不同。也可将稀释藻液装入消毒过的小型喷雾器中（可使用医用喉头喷雾器），打开培养皿盖，把藻液喷射在培养基平面上，形成分布均匀的薄层水珠。接种后，盖上盖，放在适宜的光、温条件下培养。一般经过十余天，就可在培养基上发生互相隔离的藻类群落，通过显微镜检查，寻找需要的纯藻群落，然后用消毒过的接种环移植到另一平板培养基培养，也可直接移植到装有培养液并经过灭菌的试管或小三角烧瓶中，加消毒棉花塞子，进行培养。此法较繁，但难度不大，而且可看到是否污染杂菌，对于分离已污染杂菌培养液的藻类更合适。

5）底栖藻的分离在显微镜或放大镜下挑取个体，一般可接种在固体培养基平板上，反复挑选、培养。

6）分离浮游蓝藻可利用其浮力大，易浮起在水面的特性；分离硅藻则可利用其易沉淀的特性。

用以上各种方法分离到藻种，需放在适宜光照条件下（靠南或北窗口附近光线充足处，但严防阳光直射）培养，有条件的可控制温度和利用人工光源。培养时，每天轻轻摇动1～2次，但需注意勿把培养液沾湿棉塞，避免杂菌污染。经一段时间后，培养物颜色逐渐变深。再经一次显微镜检查，如无其他混杂生物，才达到单种培养目的。

4．藻种的选择：

特征：⑴生长迅速；⑵对极端的温度和辐射条件的耐性范围大；⑶蛋白质，脂类和糖类含量高，或有选择地积累一种特殊的代谢产物（如甘油）；⑷无毒性，且易于收获。根据系统的要求和特殊的方法，还可有其他要求。

5.接种：

在分离到单纯藻群后，就可接种到培养液中进行培养，进而移养扩大培养。

液体接种：是将藻液直接加入培养液中进行搅拌，水温较低（10℃以内）时，多加；约占培养液总量的30～40％左右，水温适宜时（25～30℃左右），可加5～8％左右。按种后瓶口用灭菌纸包扎，放在适宜光、温条件下培养，每天轻轻摇动二次。大约二周后进行一次移植。藻种在培养过程中必须定期用显微镜检查，保持不受其他生物污染。

6．藻种的保藏

可接在固体培养基上，在常温、弱光下保藏半年到一年；也可在低温下（冰箱内）保藏，每天接受短时间（几个小时）弱光，可保藏2～3年；如不照光，只能保藏几个月。保藏藻种所用培养基的营养成分浓度应比正常培养基高一些，一般可增加一倍，琼脂量为1～1.5％。也可在固体培养基上，再加培养液，然后接种到培养液中，可以避免固体培养基干涸，保藏效果比单用固体好。

7.培养管理：主要是使已接种培养物在相对稳定适宜环境中大量繁殖生长。要注意以下因素：

1）二氧化碳浓度在开放式不通气方法培养中，搅拌是十分必要的，可以增加水和空气的接触面，使空气中二氧化碳溶解到培养液中，而且帮助沉淀藻类细胞上浮获得光照。在通气培养中，培养液内应维持二氧化碳浓度在0.1～5％之间。

2）光照强度利用太阳光源培养时，一般在室内培养可放在近窗口地方，防止强直射光照射。或利用人工光源（60～100瓦电灯或日光灯），需1500～3000勒克斯/厘米2。

3）温度适温一般在10～30℃之间，最适温常为20～25℃。若在室外培养，夏季中午高温，冬季早晚低温，常造成不利影响，需设法调节。在夏季，不要把藻类培养物放在直射太阳光下，而要放在凉爽的场所，例如向北窗台上。在秋、冬季节，如希望藻类保持积极生活活动状态，就要把培养物移到有人工光照处。

4）无机营养应不断添加新鲜培养液，及时补充被藻吸收后减少了的某些元素。

5）注意pH变化如变动过大，可用酸、碱调节。

6）适当控制培养物中藻细胞浓度过高会引起光照和无机营养不足，并导致pH 上升。一般控制在0.3g（干重）/L范围内。

7）及时观察和检查藻类生长情况可以通过培养物呈现的颜色、藻类细胞运动情况、是否有沉淀附壁、菌膜及敌害生物污染迹象等观察而了解一般的生长情况。藻种和中继培养每半月进行一次全面显微镜检查。大量培养中发现有不正常现象，应立即镜检，目的有两个：了解藻细胞生长情况，并检查有无敌害生物污染。

8采收：

培养液中藻体的适时采收，既是培养的目的，也是继续培养的手段。因为通过采收一部分藻体，可使藻细胞浓度保持恒定。通常在培养物细胞浓度达到干重0.4～0.5克/升时，即可采收培养总量1/3的藻体。

采收时，先搅拌培养物，取出1/3量藻液，置于沉淀缸中，加入2％～3％明矾或6％饱和石灰水。约1～2小时，藻细胞即可完全沉淀，取出沉淀，离心、浓缩、烘干。在大型培养池中采收藻体，可另外设计适当的工艺流程。根据水色的由浅变深.例如绿藻类：由嫩绿色变为深绿色；硅藻类：由浅褐色变为深褐色；金藻类：金黄色