第六章-微生物的生长繁殖及其控制讲课教案

第六章微生物的生长繁殖及其控制

计划学时：5

重点：细菌生长曲线的定义、各时期的特点、应用及生产指导意义。控制微生物生长繁殖及控制微生物生长的条件及原理。

第一节细菌纯培养的群体生长规律

一、细菌纯培养的群体生长规律

以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速度为纵坐标作图，可以得到如图6-6的曲线，称为繁殖曲线根据细菌生长繁殖速率的不同，可将生长曲线大致分为延迟期、对数期、调整期或滞留适应期。

（一）延迟期

处于延迟期细菌细胞的特点可概括为8个字：分裂迟缓、代谢活跃。

延迟期出现的原因，可能是为了调整代谢。

延迟期的长短与菌种的遗传性、菌龄以及移种前后所处的环境条件等因素有关。在生产实践中，通常采取的措施有增加接种量，在种子培养中加入发酵培养基的某些营养成分，采用最适种龄(即处于对数期的菌种)的健壮菌种接种以及选用繁殖快的菌种等措施，以缩短延迟期，加速发酵周期，提高设备利用率。

(二) 对数期(log phase)

对数期又称指数期(exponential phase)。

在此期中，细胞代谢活性最强，组成新细胞物质最快，所有分裂形成的新细胞都生活旺盛。这一阶段的突出特点是细菌数以几何级数增加，代时稳定，细菌数目的增加与原生质总量的增加，与菌液混浊度的增加均呈正相关性。

处于对数期的微生物，其个体形态、化学组成和生理特性等均较一致，代谢旺盛，生长迅速，代时稳定，所以是研究基本代谢的良好材料，也是发酵生产的良好种子，如果用作菌种，往往延迟期很短以至检查不出，这样可在短时间内得到大量微生物，以缩短发酵周期。

(三) 稳定期(stationary phase)

又称恒定期或最高生长期。处于稳定期的微生物，新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，整个培养物中二者处于动态平衡，此时生长速度，又逐渐趋向零。

稳定期的细胞内开始积累贮藏物，如肝糖、异染颗粒、脂肪粒等，大多数芽孢细菌也在此阶段形成芽孢。

生产上常常通过补料、调节pH、调整温度等措施，延长稳定期，以积累更多的代谢产物。

(四) 衰亡期(decline hpase)

稳定期后如再继续培养，细菌死亡率逐渐增加，以致死亡数大大超过新生数，群体中活菌数目急剧下降，出现了"负生长"，此阶段叫衰亡期。

二、微生物生长的测定

测定生长量的方法很多，概括起来有以下几种。

(一) 直接计数法(又称全数法)

1. 涂片染色法

2.计数器测定法

用特制的细菌计数器或血球计数器进行计数。取一定容积稀释的单细胞微生物悬液置于计数器载玻片与盖玻片之间的计数室内。由于计数室的容积是己知的(总面积为1平方毫米，高0.1毫米)，并有一定刻度。因此，可根据计数器刻度内的细菌数，计算出样品中的含菌数。

3.比例计数法

将待测的细菌悬液与等体积血液混合后涂片，在显微镜下可以测得细菌数与红细胞数的比例。

4.电子自动计数器计数法

电子计数器的工作原理，就是测定一个小孔中液体的电阻变化。

5.比浊法

是测定悬液中细胞数的快速方法。其原理是悬液中细胞浓度与混浊度成正比，与透光度成反比。菌体是不透光的，光速通过菌悬液时则会引起光的散射或吸收，从而降低透光量。细菌越多，透光量越低。因此，测定菌悬液的光密度或透光度可以反映细胞的浓度。

(二) 间接计数法(又叫活菌计数法)

1.平皿菌落计数法

像稀释平皿分离法一样，先将待测菌液作一系列10倍稀释，使平皿上长出的菌落数在30-300个之间。

平皿菌落计数法是教学、生产、科研中最常见的一种活菌计数法。

2.稀释法

待测样品作一系列稀释，一直稀释到该稀释液的少量(如1毫升)接种到新鲜培养基中没有或极少出现生长繁殖。根据没有生长的最低稀释度与出现生长的最高稀释度(即临界级数)，再用"或然率"理论，可以计算出样品单位体积中细菌数的近似值。

(三) 测定细胞物质量

1.测定细胞总含氮量来确定细菌浓度

其方法要点：从一定量培养物中分离出细菌，洗涤，以除去培养基带入的含氮物质。再用凯氏定氮法法测定总含氮量，以表示原生质含量的多少。一般细菌的含氮量约为原生质干重的14%。

2.DNA含量测定法

利用DNA与DABA-2HCl(即新配制的20%W/W，3，5-二氨基苯甲酸-盐酸溶液)能显示特殊荧光反应的原理而设计的。

3.测定细胞干重法

单位体积培养物中，细胞的干重可用来表示菌体的生长量。

4.基他生理指标测定法

三、连续培养

最简单的连续发酵装置包括：培养室、无菌培养基容器以及可自动调节流速(培养基流入，培养物流出)的控制系统，必要时还装有通气、搅拌设备。控制连续培养的方法主要有两种：

(一)恒浊连续培养

不断调节流速而使细菌培养液浊度保持恒定的连续培养方法叫恒浊连续培养，如图6-7，A。在恒浊连续培养中装中浊度计，借光电池检测培养室中的浊度(即菌液浓度)，并由光电效应产生的电信号强弱变化，来自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的流速。

(二)恒化连续培养

控制恒定的流速，使由于细菌生长而耗去的营养物及时得到补充，培养室中营养物浓度基本恒定，从而保持细菌的恒定生长速率，故称恒化连续培养，又叫恒组成连续培养。

恒化连续培养的培养基成分中，必须将某种必需的营养物质控制在较低的浓度，以作为限制性因子。

能作为恒化连续培养的限制因子的物质很多。这些物质必须是机体生长所必需的，在一定浓度范围内能决定该机体生长速率的。常用的限制性营养物质有作为氮源的氨、氨基酸；作为碳源的葡萄糖、麦芽糖、乳酸；以及生长因子、无机盐等。

恒化连续培养方法，多用于微生物学的研究工作中。

连续培养法用于工业发酵就称为连续发酵(continuous fermentation)。我国已用于丙酮-西醇的发醇生产中，缩短了发酵周期，效果良好。

四、同步生长

能使培养的微生物处于比较一致的，生长发育在同一阶段上的培养方法叫同步培养法；利用上述实验室技术控制细胞的生长，使它们处于同一生长阶段，所有的细胞都能同时分裂，这种生长方式叫同步生长；用同步培养法所得到的培养物叫同步培养或同步培养物。

获得同步培养的方法很多，最常用的有以下几种：

(一)机械法 (又称选择法)

1.离心沉降分离法

2.过滤分离法

3.硝酸纤维素薄膜法

A.将菌液通过硝酸纤维素薄膜，由于细菌与滤膜带有不同电荷，所以不同生长阶段拓细菌均能附着于膜上；

B.翻转薄膜，再用新鲜培养液滤过培养；

C.附着于膜上的细菌进行分裂，分裂后的子细胞不与薄膜直接接触，由于菌体本身的重量，加之它所附着的培养液的重量，便下落到收集器内；

D.收集器在短时间内收集的细菌处于同一分裂阶段，用这种细菌接种培养，便能得到同步培养物。

(二)调整生理条件的同步法

1.温度调整法

将微生物的培养温度控制在亚适温度条件下一段时间，它们将缓慢地进行新陈代谢，但又不进行分裂。

2.营养条件调整法

即控制营养物的浓度或培养基的组成以达到同步生长。。

(三)抑制DNA合成法

DNA的合成是一切生物细胞进行分裂的前提。利用代谢抑制剂阻碍DNA合成相当一段时间，然后再解除其抑制，也可达到同步化的目的。

第二节物理、化学因素对微生物生长与死亡的影响

消毒是指杀死或消除所有病原微生物的措施，可达到防止传染病传播的目的。

灭菌是指用物理或化学因子，使非于物体中的所有生活微生物，永久性地丧失其生活力，包括最耐热的细菌芽孢。这是一种彻底的杀菌措施。

化疗是指利用某些具有选择毒性的化学药物(如磺胺)或抗生素，对生物体的深部感染进行治疗，可以有效地消除宿主体内的病原体，但对宿主却没有或基本上没有损害。

一、温度

温度是影响有机体生长与存活的最重要的因素之一。

它对生活机体的影响表现在两方面：一方面随着温度的上升，细胞中的生物化学反应速率和生长速率加快。在一般情况下，温度每升高10℃，生化反应速率增加一倍；另一方面，机体的重要组成如蛋白质、核酸等对温度都较敏感，随着温度的增高而可能遭受不可逆的破坏。

就总体而言，微生物生长的温度范围较广，已知的微生在零下12-100℃均可生长。而每一种微生物只能在一定的温度范围内生长。各种微生物都有其生长繁殖的最低温度、最适温度、最高温度和致死温度。

最低生长温度是指微生物能进行繁殖的最低温度界限。处于这种温度条件下的微生物生长速率很低，如果低于此温度则生长完全停止。不同微生物的最低生长温度不一样，这与它们的原生质的物理状态和化学组成有关系，也可随环境条件而改变。

最适生长温度使微生物迅速生长繁殖的温度叫最适生长温度。不同微生物的最适合生长温度不一样。应该着重指出：最适合生长温度不一定是一切代谢活动的最好温度。其他微生物的试验也得到了类似的结果。

微生物按其生长温度范围可分为低温微生物、中温微生物和高温微生物三类。

(一)低温型微生物

又称嗜冷微生物，可在较低的温度下生长。它们常分布在地球两极地区的水域和土壤中，这里大部分地区几乎终年冰冻，即使在其微小的液态水间隙中也有微生物的存在；它们或者分布在平均温度为5℃左右的海洋中，或分布在只有1-2℃的海洋深处；有的分布于冷泉。冷藏食物的腐败往往由这类微生物引起。

低温微生物可分为专性嗜冷和兼性嗜冷两种。专性嗜冷微生物的最适生长温度是15℃或更低，最高生长温度约为20℃，可在零度以下甚至零下12℃的环境中生长。它们分布在常冷的环境中，即使短时受热以至室温条件，都会很快被杀死。

由于低温对微生物具有抑制或杀死作用，故低温保藏食品已是最常用的方法。

(二) 中温型微生物

绝大多数微生物属于这一类。最适生长温度在20-40℃之间，最低生长温度10-20℃，最高生长温度40-50℃。它们又可分为室温性微生物和体温性微生物。

(三)高温型微生物

它们适于在45-50℃以上的温度中生长，在自然界中的分布仅局限制于某些地区，如温朱、日照充足的土壤面、堆肥堆、发酵饲料等腐烂有机物中，比如堆肥在发酵过程中温度常高达60-70℃。

高温型微生物能在如此高的温度下生存和生长，可能是由于菌体内的酶和蛋白质比起中温型微生物更能抗热，尤其蛋白质对热更稳定；同时高温型微生物的蛋白质合成机构--核糖体和其他成分对高温也具较大的抗性；更明显的是，细胞膜中饱和脂肪酸含量高，它比不饱和脂肪酸可以形成更强的疏水键，从而使膜在高温下能保持其稳定性并具正常的功能。

如果超过了最高生长温度则导致微生物死亡。不同微生物的致死温度不同。但以细菌芽孢抗热性最强，100℃以下处理相当时间才能致死。各种芽孢的抗热能力不同。

高温致死微生物主要是引起蛋白质和核酸不可逆的变性，或者破坏了细胞的其他组成，或者可能因为脂肪膜被热溶解而形成了极小的孔，使细胞内含物泄漏而引起死亡。

高温致死微生物的作用，现已广泛用于消毒灭菌，高温灭菌的方法分为干热与温热两大类。在一温度下，湿热灭菌比干热法好。例如肉毒梭状芽孢杆菌，采用湿热灭菌法121℃经10分钟即可杀芽孢。如果在干燥状态下，用热空气杀菌，则需180℃10分钟才能杀死。所以干热灭菌常采用160-180℃经1-2小时才能达到完全灭菌的目的。

1.干热灭菌

(1)焚烧灭菌法

(2)干热灭菌法

2.湿热灭菌

(1)煮沸消毒法

(2)高压蒸汽灭菌法

(3)间歇灭菌法

(4)巴斯德消毒法

二、氢离子浓度(pH)

每种微生物都有其最适pH值和一定的pH范围。在最适范围内酶活性最高，如果其他条

件适合，微生物的生长速率也最高。大多数细菌、藻类和原生动物的最适pH为6.5-7.5，在pH5-6的酸性环境，但生存范围在pH1.5-10之间。有些细菌甚至可在强酸性或强碱性环境中生活，例如氧化硫杆菌能在pH1-2的环境中生活，有些硝化细菌能在pH11的环境下活动。

随着环境pH值的不断变化，使得微生物继续生长受阻，当超过最低或最高pH值时，将引起培养物的死亡。为了维持微生物生长过程中pH值的稳定，不仅配制培养基时要注意调节pH值，而且往往还要加入缓冲物。最常用的是弱酸或弱碱的盐类。

同一种微生物由于液的pH值不同，可能积累不同的代谢产物。在不同的发酵阶段，微生物对pH的要求也有差异。

三、氧化还原电位

微生物生长过程中可能改变周围环境中的氧化还原电位。

氧化还原电位影响微生物细胞内许多酶的活性，也影响细胞的呼吸作用。

影响培养基中氧化还原电位的因素很多，分子态氧的影响(空气的影响)尤为重要。

四、辐射

辐射是指通过空气或外层空间以波动方式从一个地方传播或传递到另一地方的能源。它们或是离子或是电磁波。电磁辐射包括可见光、红外线、紫外线、X射线和γ射线等。光量子所含能量随不同波长而改变，一般波长愈长，则所含能量愈低，反之则高。图6-4示不同波长辐射与杀菌作用的关系。

(一)紫外辐射

紫外线是非电离辐射，以波长265-266纳米的杀菌力最强。

紫外辐射的杀菌效果，因菌种及生理状态而异，照射时间和剂量的大小也有影响。干细胞比湿细胞对紫外辐射抗性强，孢子比营养细胞更具抗性，带色的细胞能更好地抵抗紫外辐射。

(二)电离辐射

X射线与α射线、β射线和γ射线均为电离辐射。它们的波长很短，有足够的能量从分子中逐出电子而使之电离。

电离辐射效应无专一性。

五、干燥

水分对于维持微生物的正常生命活动是必不可少的。干燥会导致细胞失水而造成代谢停止以至死亡。不同的微生物种类，干燥时微生物所处的环境条件，干燥的程度等均影响干燥对微生物的效果。

革兰氏阴性细菌如淋病球菌对干燥特别敏感，几小时便死去；结核分枝杆菌又特别耐干燥，在此环境中，100℃20分钟仍能生存；链球菌用干燥法保存几年而不丧失致病性。休眠孢子抗干燥能力也很强，在干燥条件下可长期不死，这一特性已用于菌种保藏，如常用砂土管来保藏有孢子的菌中。

真空干燥法，首先将细胞悬于少量保护剂(例如血清、血浆、肉汤、蛋白胨、脱脂牛乳)溶液中，分装在安瓿内，置于零下45℃℃至零下75℃低温中迅速冰冻，随即抽成真空，使达到真空干燥状态。

六、渗透压

七、超声波

超声波(频率在20000赫兹以上)具有强烈的生物学作用。

超声波的作用是使细胞破裂，所以几乎所有的微生物都能受其破坏，其效果与频率、处理时间、微生物种类、细胞大小、形状及数量等均有关系。

八、重金属及其化合物

九、有机化合物

对微生物具有害效应的有机化合物种类很多，其中酚、醇、醛等能使蛋白质变性，是常用的杀菌剂。

十、卤族元素及其化合物

十一、表面活性剂

具有降低表面张力效应的物质称为表面活性剂。这类物质加入培养基中，可影响细胞的生长与分裂。

第三节化学疗剂对微生物的作用

能直接干扰原微生物的生长生繁殖并可用于治疗感染性疾病的化学药物即为化学疗剂。

一、抗代谢物

有些化合物在结构上生物体所必需的代谢很相似，以至可以和特定的酶结合，从而阻碍了酶的功能，干扰了代谢的正常进行，这些物质称为抗代谢物。

抗代谢种类较多，如叶酶对抗物(磺胺类药物)、嘌呤对抗物(6-巯基嘌呤)氨基酸对抗物(5-甲基色氨酸)、吡哆醇对抗物(异烟肼)等。

磺胺类药物广泛用于临床，是由于它们与微生物生长所必需的代谢物对氨基苯甲酸(PABA)间的竞争性抑制作用，细菌生长所必需的对氨基苯甲酸可以自行合成，也可从外界环境中获得。

若自行合成时，正常情况下，对氨基苯甲酸则和二氢喋啶在二氢叶酸合成酶的作用下，合成二氢叶酸。二氢叶酸。二氢叶酸再通过二氢叶酸还原酶的作用，生成四氢叶酸。然而磺胺的结构与对氨基苯酸极其相似，在一定条件下，它们竞争性地与二氢叶酸合成酶结合，阻止或取代了对氨基甲酸掺入到叶酸分子中去，从而阻断了细菌细胞重要组分叶酸的合成(图

6-15)。而叶酸是一种辅酶，在氨基酸、维生素的合成中起生要作用，缺乏此酶，细菌细胞活力受到明显破坏。磺胺抑制细菌的生长是因为许多细菌需要自己合成叶酸而生长。

由于人和动物可利用现成的叶酸生活，因此不受磺胺的干扰。叶酸，亦称蝶酰谷氨酸

二、抗生素

(一)抑制细胞壁的形成

(二)影响细胞膜的功能

(三)干扰蛋白质合成

(四)阻碍核酸的合成

三、微生物的抗药性

临床上重要的抗药性菌的抗药性主要表现为以下几种：

(一)菌体内产生了钝化或分解药物的酶

将有活性的药物转变成没有抗菌作用的产物。例如葡萄球菌的有些菌株能抗青霉素，就是由于它们产生了青霉素酶(β-内酰胺酶)，使青霉素分子中的β-内酰胺环开裂而丧失了抑菌作用。

(二)改变细胞膜的透性而导致抗药性的产生

这类抗性菌株具有阻挠抗微生物剂进入或排出已进入细胞的药物的能力。

(三)细胞内被药物作用的部位发生了改变

思考题

1.细菌的生长繁殖与高等动、植物的有哪些异同?与丝状真菌又有哪些异同?

2.试分析影响微生物生长的主要因素及它们影响微生物生长繁殖的机理。]

3.说明测定微生物生长的意义、微生物生长测定方法的原理及比较各测定方法的优缺点。

4.控制微生物生长繁殖的主要方法及原理有哪些?

5.细菌耐药性机理是哪些?如何避免抗药性的产生?

6.试举例说明日常生活中防腐、消毒和灭菌的实例，及其原理。