细胞生物学综合实验报告

本科学生实验报告

学号

学院生命科学学院专业、班级

实验课程名称细胞生物学实验

指导教师及职称王莎莎

开课时间2013 至2014 学年第一学期

填报时间2013年10月13 日

师大学教务处编印

传代时只须把培养的悬浮细胞做适度稀释或把培养细胞经简单的离心处理后再加入适量的培养液即可培养。因此，细胞在从原代到传代的转变过程中遭受的机械损伤和化学损伤的可能性较少，损伤程度也较轻，相对而言，传代的成功率较高。

流程：

每小组先用一个培养瓶配制50ml

每人取10ml培养基到自己的细胞培养瓶内

然后向细胞培养瓶内接种10ul的结肠腺癌320细胞株培养株原液

放入二氧化碳培养箱，旋松瓶盖

根据细胞的数量看细胞瓶是否平放或直立放置

4、死活细胞的鉴别

（1）.细胞的存活率是反映细胞群体生活状态的重要指标。多种方法可以鉴别细胞的死活，最常用到的方法是染色排除法。

（2）.许多酸性物质不容易穿过活细胞的质膜进入胞，却能渗入死的细胞，使其着色，以次来区别死活细胞。

流程：制片

计数

4、实验方法步骤及注意事项：

Ⅰ、细胞培养准备工作（清洗、消毒、灭菌）

（一）清洗

(1).新玻璃器皿的清洗

先用自来水刷洗，再浸泡5%稀盐酸中和玻璃表面的碱性物质和有害物质。

(2).使用过的玻璃器皿的清洗

A、立即进入清水，避免干涸难洗；

B、用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍，倒置自然干燥；

C、浸酸性洗液过夜；

D、从洗液捞出自来水冲洗10~15次去除酸性洗液，蒸馏水刷洗10次，倒置烘干；

E、包装（牛皮纸或不透水纸）；

F、高压（15磅20min)或干热（160度2h)灭菌；

G、备用

（二）胶塞处理

（1）新胶塞应先用清水清洗之后再用0.2%NaOH煮沸10~20min。

（2）自来水清洗10次

（3）用1%稀盐酸浸泡30min。

（4）自来水清洗10次，蒸馏水刷洗10次。晾干

（5）旧胶塞不必用酸碱处理可直接用洗涤剂煮沸清洗数次，过蒸馏水，晾干，包装高压灭菌，可使用。

（三）塑料制品的清洗

（1）用洗涤剂清洗，自来水冲洗数遍

（2）强（次强）酸洗液浸泡2~6h.

（3）自来水冲洗10次以上，蒸馏水刷洗10次

（4）浸泡在70%乙醇0.5~1h,备用。

（5）用前从乙醇中取出，在超级工作台紫外线照射1h。

（四）Tip和Tube的清洗

（1）新的国产Tip和Tube如用于非RNA提取时可用蒸馏水刷洗，晾干，高压灭菌后使用。

（2）用于RNA提取时，用蒸馏水刷洗后再用DEPC水（抑制RNA酶）浸泡过夜晾干，高压灭菌后使用。

（3）使用过的Tip和Tube用后浸泡在0.2mol/L NaOH或0.2mol/L HCl溶液中，清水洗过，自来水清洗10次晾干，进洗液2~24h。晾干，放入饭盒高压灭菌，备用

（五）洗液的配制

（1）将重铬酸钾放入大烧杯中，加入蒸馏水放在石棉网上加热至沸腾并搅拌，使重铬酸钾充分溶解。

（2）将重铬酸钾倒入酸缸中，然后缓慢加入浓硫酸并用一长玻璃棒不断搅拌，充分溶解。

注意：操作时注意安全，穿戴好耐酸手套和围裙，防止洗液飞溅到衣物皮肤上，不慎飞溅到皮肤应立即用大量清水冲洗。

（六）消毒和灭菌

（1）射线消毒灭菌

主要使用X、60Co进行消毒灭菌，用于牛血清或塑料制品。

（2）紫外线消毒

一般用无臭氧型紫外灯。一般20min，71%细菌消灭；40min后79%细菌消灭，60min 后86%细菌消灭。紫外线照射时间照射再长也不能100%灭菌，最多只能达到90%。（3）干热灭菌

主要用于玻璃器皿的灭菌。将用于细胞培养的器皿放入干燥箱，加热至160度，保温90~120min。用于RNA提取实验的用品则需要180度，保温5~8h.

（4）湿热灭菌

也称高压蒸汽灭菌，是最有效的一种灭菌方法。主要应用布类、橡胶、金属器械、玻璃器皿、塑料以及加热后不发生沉淀的无机溶液。

（5）滤过灭菌

用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液。

（七）化学消毒法

（1）70%（75%）酒精消毒

（2）0.1%新洁尔灭消毒

（3）来儿水消毒

（4）0.5%过氧乙酸消毒

（5）乳酸蒸汽消毒

（6）37%甲醛加高锰酸钾消毒

（7）煮沸消毒

Ⅱ、培养基的配制（RPMI 1640 合成培养基配制）

（1）加入 0.1ml 1%的酚红，通入CO2，使液体变为金黄色，说明培养基完全溶好。（2）配制好的培养基，用时用饱和 NaHCO3液调节 pH 至 6.8-7.0。

溶好以后的培养液在超净台中进行0.22μm滤过除菌，分装至细胞培养瓶中。

（3）瓶口封好，-20℃或4 ℃贮存。