Methods in Mammalian Autophagy Research(哺乳动物自噬研究方法)
哺乳动物自噬研究方法
自噬和许多生理和病理过程相关。因此，有一个持续增长的科学需要来精确的鉴定、量化并对自噬进行操作。然而，自噬包含许多动态的复杂的过程，它经常被错误的分析。在这篇读物中，我们通过主要关注哺乳动物的大自噬来讨论观察自噬和调控自噬活性的方法。
简介
过去的十年见证了一种叫做自噬的基本的细胞生物学途径的研究的爆发。自噬需要的进化上保守的基因的发现使得科学家们能够发现自噬的稳态、发育和其他生理功能。不仅如此，越来越多的证据表明自噬的反常可以导致一系列的哺乳动物疾病。因此，对于科学家来说有一个急剧增长的需要去精确的探究自噬并且研究其在不同生物学事件中的作用，尤其是在哺乳动物体系中。
哺乳动物自噬的研究被历史上两个主要的问题所困扰。第一，用静态的分析来捕获动态的过程是有难度的，基于这些分析手段进行推断是有内在的限制的。第二，区分形态和功能并且避免陷入基于给定的生理学设定的检测来赋予自噬生理学功能的陷阱。这两个挑战似乎成了我们错误的理解哺乳动物自噬功能的源泉。比如，特定的神经和肌肉退行性疾病起初被认为至少部分和增多的自噬（基于显微镜对于通路中增多的中间体的观察）是相关的，然而事实上，在这些疾病中早起中间体的积累可能会阻断其晚期的自噬过程。自噬，一个临死细胞正常的形态学特征，常被错误的认为是细胞死亡的途径，然而现在看来其主要的功能之一是在“威胁生命”的环境下来维持细胞的生存。
这些哺乳动物自噬研究的历史性的挑战在阐明自噬的分子机制时通过利用先进的自噬研究的新方法被部分克服了。因此，在过去的十年，大量的新方法被用来观察自噬的动态过程以及为了在特定的细胞过程中研究自噬的功能来调节它。这篇文章是为了现在自噬研究可用的技术以及在解释中存在的限制提供一个综述。每一种方法的更加详细的信息可以在其他综述中找到。
自噬的基础知识
自噬是细胞质中物质包括细胞器到达溶酶体被降解的一些过程的总称。在自噬的三种类型（大自噬，小自噬和蛋白伴侣介导的自噬）中，研究的最深入的是大自噬。蛋白伴侣介导的自噬包含了胞质蛋白定向转运到溶酶体膜的过程，这一
过程需要蛋白伴侣来进行解折叠。小自噬是溶酶体膜的内陷，这样使得一小部分胞质进入溶酶体腔。
大自噬将是这篇文章中主要关注的途径。这条途径从酵母到哺乳动物都很保守，并且被一个术语叫做自噬体的特殊的细胞器所介导。在诱导作用下，一个被称为隔离膜或者自噬泡的小囊泡逐渐延伸随后包裹了一部分细胞质，最后形成了双层膜的结构——自噬体。然后，自噬体的外膜和溶酶体融合（形成自溶酶体），导致自噬体内膜和其所包被的物质的降解。在和溶酶体融合之前，自噬体也可以和核内体融合形成自噬内涵体。自噬体的降解产生了一些氨基酸或者其他小分子用于循环或者产生能量。下面描述的方法探究了自噬途径的不同时期（比如，早期自噬体，自溶酶体，自噬降解产物），这些方法应该被协调的使用来判断途径中中间产物的增多是否代表了自噬降解的增多或者是否代表了自噬途径完成的阻断。
在生理环境下，自噬有一系列重要的作用比如在饥饿时维持氨基酸库，胚胎植入前发育，抑制神经退行性疾病，抗衰老，抑制肿瘤，胞内微生物的清除以及天然和适应性免疫的调控。自噬的特征之一就是它的动态调控性，在基础条件下，细胞中自噬活性是很弱的，但是可以通过大量的刺激来显著上调其活性。自噬的最广为人所知的诱导剂就是营养饥饿，无论是在从酵母到哺乳动物的培养细胞中还是在完整的生物体中。除了饥饿，自噬也可以被一些其他的生理压力刺激（比如缺氧，能量消耗，内质网压力，高温，高密度环境），激素刺激，药剂（比如雷帕霉素和下面讨论的其他复合物），内部免疫信号，一些疾病诸如细菌性的、病毒性的、寄生感染、急性胰腺炎、心脏病，蛋白aggregopathies所激活。相反的，自噬的抑制常常和一些特定的疾病相关，包括一系列的癌症，神经退行性失调，感染性疾病，炎症性肠病，并且自噬功能的减弱是衰老的普遍特征。考虑到自噬和不同的生理学以及病理生理学过程的重要相关性。在自噬研究方面有一个对于科学方法持续增长的需要来在一个给定的生物事件中准确判断自噬是否存在，上调或者抑制以及基本的自噬和/或修饰的自噬是否（以及如何）和在研究的生理或者病理生理的一些过程相关。
自噬的执行和一系列进化上保守的基因产物相关，被称为Atg蛋白，这些蛋白对于隔离膜和自噬体的形成是必需的。自噬体形成的过程包含两个重要的步骤，
成核和隔离膜的延伸。ULK/Atg1激酶复合体，自噬特异的磷脂酰肌醇3-激酶复合体，磷脂酰肌醇三磷酸效应物以及和他们相关的蛋白对于成核的步骤是重要的，Atg12和LC3/Atg8接合系统对于延伸的步骤是重要的。此外，在自噬中还有其他的蛋白对于自噬体溶酶体融合，溶酶体酸化溶酶体消化，整合环境线索的调节信号是必需的。自噬的详细的分子调节和机制在其他地方阐述过。在哺乳动物细胞中，大多数Atg蛋白在隔离膜上被发现（比如ULK1/2,Atg13, FIP200, Atg101, Beclin 1, Atg14, LC3, Atg12, Atg16L1）但是没有在完整的自噬体上发现。迄今为止，只有一个酵母Atg8蛋白同源的微管相关蛋白LC3被发现存在于自噬体上，因此，这个蛋白被广泛用作自噬体的标记。自噬体的鉴定极大地方便了自噬体的探究（通过基于LC3的生化和显微方法），也极大提高了实验操作自噬体的可行性。（自噬基因的敲除或者显性自噬负调蛋白的表达）自噬途径可以用一些试剂操作来调节自噬体的形成或者随后的降解过程。
细胞自噬活性观察
一个经常犯的错误就是关于细胞中增长的自噬体的数量和细胞自噬活性的增加是一定相关的这个概念。考虑到自噬体是动态途径中一个中间结构，在任何时间点观察到的自噬体的数量是它们的产生率和它们转变为自溶酶体速率的平衡。因此，自噬体的积累既有可能代表自噬的诱导，也有可能代表自噬途径下游部分自噬体形成步骤的抑制。比如，和自噬的基础水平相比，自噬的激活可以体现在所有自噬结构（也就是说，隔离膜，自噬体和自溶酶体）的数量增多上。如果自噬体形成的上游过程被阻断，所有自噬结构的数量都会增多。相反，自噬体形成下游过程被阻断会导致自噬体数量的增多和自溶酶体数量的减少。显然，在两个相反的生理学过程中，自噬的激活（和自噬降解的增多）和自噬下游过程的阻断（和自噬降解的减少）都会导致自噬体数量的增多。因此，自噬体数量的简单检测对于自噬活性的估计是远远不够的。而且，不同的方法需要在区别自噬基础水平，自噬的诱导，自噬上游过程的抑制和自噬下游过程的抑制方面达到一致。“自噬流量”这一项被用来指示自噬体合成的动态过程，自噬底物向溶酶体的运输，溶酶体中自噬底物降解产物的量，是一个相对于自噬体数量的测量更可靠的自噬活性的指示物。在随后的部分，我们将讨论观察自噬体和自噬流量数量的不同方法。
自噬体数量的观察
三个主要的方法被用来观察自噬体的数量，包括电镜观察，光学显微镜LC3亚细胞定位，LC3膜相关类型生化分析。
电镜观察
电镜观察是最传统的方法，事实上，哺乳动物自噬现象最初就是在20世纪50年代末电镜学家在观察溶酶时发现的。在超微结构水平，自噬体被鉴定为一个双层膜的含有胞质组分未和溶酶体融合的结构。自噬体通常包含一些细胞器比如线粒体和内质网的碎片。由于这个检测手段很直接，鉴别自噬体或者至少包含细胞组分的细胞器很容易。现在还不能很好的说明这个双层膜结构是如何包裹胞内特异的病原体的：有一些病原体的生活史可能包含通过自噬样中间结构（没有最终呈递给溶酶体）的转位，然而对于其他的情况，胞内病原体被自噬途径捕获最终到溶酶体降解。另外一个考虑就是古典的自噬体的鉴定包括双层膜中不同细胞组分的可视化。虽然这个可能在“散装自噬”事件中发生，但是有越来越多的证据表明存在细胞器特异性的自噬，包括过氧化物酶体自噬、线粒体自噬、核糖体自噬、和内质网自噬。因此，过去用以鉴定自噬体的标准应该被修改来包括最近在哺乳动物细胞中发现的病原体特异性的和细胞器特异性的自噬的证据。
和自噬体包含有胞内物质（很容易鉴定）不同，来自胞内其他被膜小室的自溶酶体的特征往往更加复杂。自溶酶体是由自噬体和溶酶体融合形成的混合细胞器（核内体也可能参与其中），其含有单层限制性的膜结构并且在不同的降解时期内含有胞质物质。在早期，内部的物质可以被识别出来是来源于细胞质。然而。如果降解进行的太久了，其内部物质是否起源于细胞质就很难说了。此外，区分自溶酶体和其他内吞小室（异噬小泡）或者不知起源自哪里的小泡结构是很困难的。特别的是，内部没有或者几乎没有物质的小泡不应该被认为是自噬结构。这些误解的其他典型事例在另外一篇综述中提到过。因此，电镜虽然是一个强有力的工具，但是它不是一个完美的方法并且其会在下面描述的功能学研究的应用中受到限制。
荧光显微技术
自噬体数量的电镜测定需要大量的专业知识，正在逐渐被不同领域研究者都能广泛使用的光学显微镜和生化分析方法所替代。如前所述，哺乳动物自噬蛋白
LC3是自噬体的一种标记物。在4种LC3亚型中，LC3B被广泛使用。合成后不久，初期LC3在C端和Atg4相互作用变成LC3-1，在C端含有一个甘氨酸残基。LC3-1随后和磷脂酰乙醇胺作用通过泛素样酶的作用变为LC3-2（LC3-PE）。和LC3-1的细胞质定位不同，LC3-2存在于自噬体的内外膜。和溶酶体融合后，外膜的LC3被Atg4裂解，内膜的LC3被溶酶体酶降解，导致自溶酶体中LC3的含量很低。因此，内源的LC3或者GFP-LC3无论是作为胞质中弥散性物质还是出现在自噬体中的颗粒结构都可以被荧光显微镜观察到。
虽然每一个细胞颗粒LC3或者GFP-LC3的数量可以精确的表示自噬体的数量，但是这个方法仍然可能存在实验陷阱。首先，主观因素和实验者制定和应用的统一方法可能都和定量的方法和鉴定“颗粒物”的标准相关。颗粒结构的数量可以通过观察（一个不知道实验环境的观察者）或者利用电脑图像分析系统软件来鉴定。虽然在自噬被诱导后颗粒结构的数量显著增多，但是在正常条件下仍然会有小数目的颗粒结构被观察到。因此，含有GFP-LC3的颗粒物质的细胞的百分数不是一个合适的指示物（理论上，这个数值对于大多数细胞来说应该是100%），除非可以建立一个有效区分“自噬活跃”和“自噬不活跃”的阈值；如果是这样，结果就会被这样表达：“含有多余特定数目的颗粒物质的细胞的百分数”。总之，在被评价的细胞中量化“每一个细胞GFP-LC3的平均数目”是更好的。每一个细胞GFP-LC3的总面积也可以图形分析软件来分析，但是在这样一个情况下，在GFP-LC3聚集体形成过程中消除实验人工误差尤为重要（见下）。
LC3或者GFP-LC3颗粒结构的检测作为观察自噬体数目的方法的第二个可能的陷阱是GFP-LC3和内源的LC3如果过表达或者和其他聚集倾向蛋白共表达很容易聚集起来。GFP-LC3聚集体和真正的自噬体通过荧光显微镜通常不容易区分。然而，我们可以进行特定的预防降低GFP-LC3聚集的可能性。稳定的GFP-LC3转化株被强烈推荐使用，因此我们可以筛选出来表达合适水平GFP-LC3的克隆而没有人为聚集。当GFP-LC3被用作瞬时转染时，应该进行预防避免过量的表达从而导致人为聚集。此外，通过利用C端甘氨酸突变的GFP-LC3实验区分成为聚集体的非特异性的GFP-LC3和进入自噬体的GFP-LC3是可能的，这个突变的GFP-LC3和磷脂酰乙醇胺的泛素样接合能力减弱而作为负控。在那些自噬体数量真实增加（相对于非特异性的GFP-LC3聚集）的情况中，我们会看到野生型GFP-LC3颗粒
物质数目的增多而不是突变型GFP-LC3颗粒物质数目的增多（假设野生型和突变型GFP-LC3可以表达为可供比较的水平）。
通过产生转基因GFP-LC3转基因小鼠，GFP-LC3标签方法被成功应用于体内哺乳动物自噬研究。在模式生物中也运用了相似的方法，包括果蝇，线虫，植物和斑马鱼。在GFP-LC3转基因小鼠中，GFP-LC3在CAG启动子的控制下无处不表达，GFP颗粒的积累在经过24小时的快速期后几乎在所有组织中都能观察到。大脑是一个例外，经过48小时饥饿后仍然没有观察到GFP-LC3颗粒的积累。这一点可能反映出来在大脑中缺乏通过营养状态调控的自噬，或者在大脑中存在很快的自噬体的流动。除了全身GFP-LC3转基因小鼠，还有表达GFP-LC3和mCherry-LC3的组织特异转基因小鼠。这些全身性的和组织特异性的模型被成功的用来表明在自噬基因缺乏的小鼠中自噬体数目的降低。他们也被用来展示在疾病或压力环境下自噬体数目的增多，比如，在肝细胞中表达一种α1-抗胰蛋白酶Z变体，在有突变的退化的浦肯野细胞轴突增强了兴奋毒性，在和压力相关的心肌细胞中过表达一种突变的αβ-晶状体蛋白。因此，在GFP-LC3转基因小鼠中观察GFP-LC3颗粒来测定不同的生理和病理生理的刺激是否在体内调节自噬体的数目是一个很好的方法。
生化分析
LC3除了在荧光显微分析中的作用，其还可以用作生化分析来测定自噬体的数量。内源LC3-1到LC3-2的转变和GFP-LC3-1到GFP-LC3-2的转变可以分别用抗LC3和GFP的抗体用免疫印迹检测到。虽然LC3-2的实际分子量比LC3-1大，但是LC3-2在SDS-PAGE中比LC3-1迁移的快，因为LC3-2极度疏水（这个常常因为表观分子量减少而被误认为“加工”）。LC3-2的数目通常和自噬体的数目有很好的相关性（或者更精确地说，理论上，带有LC3-2标签的自噬膜）。然而，并不是所有的LC3-2都存在于自噬膜上，而且，重要的是，一些LC3-2似乎以一种非自噬的方式产生。比如，相当大数量的LC3-2在FIP200和Atg14缺失的小鼠胚胎成纤维细胞，在Beclin-1缺失的胚胎干细胞和在RNAi介导的Beclin 1，Atg13，Atg14，和Vps34抑制的细胞中被检测到了，虽然自噬体的形成和自噬流量被完全或者深度抑制。相似的，在酵母中，在atg1, 2, 6, 9, 13, 14, 16,和17的突变种发生了Atg8的脂化。因此，在那些自噬机器特定组分未被激活的情况下，即使
检测到LC3-2而自噬被抑制也是有可能的。在这些情况下，我们需要包括GFP-LC3标签法和自噬流量分析在内的其他方法来测定自噬活性。
注意
需要注意有时在文章中用的特定的方法这一领域的大多数专家都认为用来测定自噬体的数量（或者自噬的活性）是不合适的。比如，溶酶体的数目和活性对于自噬来说不是一个可靠的一般指示物，虽然它可能在果蝇中起作用。因此，至少对于哺乳动物细胞来说，我们不推荐使用LysoTracker，吖啶橙，或者单丹磺酰尸胺（MDC）。（MDC起初被认为是自噬体的特异指示物，但是最近证明其和溶酶体有高度亲和性）第二，虽然哺乳动物的LC3，酵母的Atg8，和其他特定的自噬基因可能会由自噬诱导的压力环境导致其自身转录上调，但是没有明显的证据表明自噬活性本身被转录上调。此外，Atg蛋白组成性表达的量是足够的，并且它们的转录后修饰和/或其和自噬机器其他的膜的作用而不是表达水平的调节似乎对于它们在自噬途径中的活性是重要的。因此，Atg的mRNA或者蛋白表达水平并不被认为是观察自噬的合适的指示物。
自噬流量观察
上面的部分谈到的方法对于测定细胞自噬体的数目是有用的，这个通常但不是总是是细胞自噬活性水平的指示物。正如上面所讨论的，自噬体数目的积累并不总是代表自噬的诱导，也有可能代表自噬体的持续产生和/或者自噬成熟过程以及自噬途径完成的阻断。对于LC-2的测定也是这样的。比如，如果用一种减弱溶酶体酸化的试剂氯喹来培养细胞，即使在正常的环境下LC3-2也会积累因为基础自噬中LC3-2的流通被阻断了。因此，仅仅通过自噬体数目的测定（比如通过电子显微镜或者光学显微镜对LC3或者GFP-LC3的检测）或者测定LC3-2的水平（免疫印迹分析）我们不能够区分真正的自噬诱导和自噬溶酶体成熟化的减弱。在大多数实验条件下，区分自噬体的积累是由于自噬的诱导还是下游步骤的阻断是有必要的，可以通过自噬流量分析方法来区分两者。需要注意的是，通过电子显微镜对自噬体或者自噬溶酶体的定量或者相对定量有助于区分自噬的激活（自噬体和自噬溶酶体数量均增加）和自噬体成熟过程的阻断（自噬体数量增加而自噬溶酶体数量不变）。然而，电镜并不提供溶酶体自噬底物降解的直接信息，因此，我们并不把他正式归为自噬流量检测方法。
LC3流量测定
现在用于测定自噬流量的一个主要的方法是测定LC3的流量，这个方法基于LC3-2在自溶酶体中被降解的观察。正如上面所描述的，如果细胞被用可以抑制溶酶体酸化或者抑制自噬体和溶酶体融合的溶酶体趋向药物比如氯化铵，氯喹，或者巴弗洛霉素A1处理或者用溶酶体蛋白酶抑制物比如E64d和抑肽素A处理，那么LC3-2的降解就会被阻断，导致LC3-2的积累。因此，现有样品和溶酶体抑制物缺失样品LC3-2数量的不同代表了LC3-2被溶酶体降解了。比如，即使在非饥饿条件下用氯喹处理细胞，LC3-2的水平还是会增加。然而，在饥饿条件下现有的和氯喹缺失的LC3-2的水平差距更大，表明在饥饿时自噬流量增加了。
虽然LC3流量测定在理论上很简单，但是在一些实验条件下，获得有意义的结果和可靠的检测自噬流量是有挑战性的。这可能部分反映了这个方法的高度敏感性；尤其是，即使是在基础环境下（比如，在基本培养基上生长的Hela细胞），高速率的流出也可以被检测到，这使得在这些环境中在自噬上调的情况下检测额外的LC3流量变化变得困难。因此，我们假设LC3流量的测定并不应该是测定自噬流量的单一必要条件。然而，在某些情况下，它应该被看做是自噬流量的可靠指示物，但是在另外一些情况下，自噬流量需要和其他的技术（下文描述的）相结合来测定，这样可以产生更多有用的信息。
LC3和选择性底物的降解
因为LC3被自噬所降解，所以总LC3的减少是自噬流量的很好的指示物。即使是在自噬诱导后瞬时增加的LC3-2在经历了长时间的自噬活化（比如，超过两小时的饥饿）后依然会减少。相似的，处在饥饿状态下的细胞存在大量的GFP-LC3颗粒，但是胞质和核GFP-LC3的信号在自噬诱导后都减弱了。总GFP-LC3表达量的减少可以通过流式细胞仪定量敏感地观察到。因此，和自噬流量呈反相关的总胞质LC3可以通过免疫印迹分析或者流式细胞仪定量（或者通过荧光显微镜定量观察）。关于这个的一个重要暗示和LC3在组织学研究中的染色相关。增强的LC3染色有事可以作为自噬激活的证据，但是，这样一个观察结果可能反过来表明自噬被抑制了，导致自噬溶酶体中LC3降解的减少。
除了LC3，其他自噬底物的水平也可用来观测自噬流量。过去，自噬被认为是一个随机的降解系统，然而最近的研究表明几种特异的底物优先通过自噬降解，
研究的最清楚的是p62（也被称作SQSTM1或者sequestome 1）。通过直接和LC3结合，p62被包含进自噬体中被高效降解；因此，胞质总p62表达量和自噬活性呈负相关。比如，在自噬缺失的细胞中饥饿诱导不会导致p62水平的降低反而会导致p62的积累。在大量的试验中，胞质p62的测定似乎和自噬流量的其他参数有很好的相关性，并且总的来说，这一方法看起来很有前景。然而，应该注意的是目前还不清楚p62是否只通过自噬降解还是部分通过泛素蛋白酶体途径降解。此外，p62，和LC3一样可以通过自噬被转录上调，这一点会混淆关于p62和LC3作为自噬流量的指示物的理解。考虑到这些可能的限制条件，我们建议自噬底物水平的测定应该和其他的独立实验相结合来测定自噬流量。
mRFP-GFP-LC3被呈递给溶酶体
另外一个测定自噬流量的方法基于溶酶体可以淬灭GFP标记的自噬底物比如LC3中的GFP信号。GFP是一个稳定的折叠蛋白并且可以相对抵抗溶酶体的蛋白酶。然而，溶酶体的低pH环境可以淬灭GFP的荧光信号，使得追踪GFP-LC3的呈递给溶酶体变得困难；实际上，大部分GFP-LC3颗粒并不和溶酶体共区域化。与其相反，RFP（和其他的红色荧光蛋白，比如mCherry）在酸性环境中会体现出更稳定的荧光，并且mRFP-LC3在自溶酶体中很容易被检测到。通过利用这两种荧光蛋白在性质上的不同（也就是说，溶酶体淬灭GFP的信号而不淬灭RFP 的信号），可以通过一个mRFP-GFP-LC3串联结构来对自噬流量进行形态学追踪。用这一新的结构，自噬体和自溶酶体分别被标记上了黄色（也就是mRFP和GFP）和红色（也就是只有mRFP）的信号。如果自噬流量增加，那么黄色和红色的颗粒都会增加；然而，如果自噬体到自噬溶酶体的成熟过程被阻断，那么只有黄色颗粒增多红色颗粒并不伴随增多。虽然这个方法可以被用来最为自噬流量的指示物，但是它并没有像那些直接测量溶酶体降解终点的流量方法那样精确。这个方法需要溶酶体具有酸性和降解的能力。因此，有时自溶酶体会被观察到黄色，这个依赖于溶酶体酶的活性和溶酶体酸性淬灭GFP信号的速度。
GFP-LC3裂解分析
虽然GFP荧光被溶酶体内部的酸性pH环境所淬灭，GFP还是可以通过免疫印迹来检测到并且比GFP-LC3融合蛋白更稳定（其在到达溶酶体的过程中被部分降解，导致出现自由GFP片段）。因此，另外一个检测自噬流量的方法就是通过
使用抗GFP抗体进行免疫印迹分析来检测由于GFP-LC3在自溶酶体中降解产生的自由的GFP片段。虽然这个方法已经被广泛应用于表达GFP-Atg8的酵母中，在哺乳动物细胞中是用的经验还很匮乏。在某些依赖于溶酶体的酸性的情况下（可能由于细胞类型不同而不同），作为在自溶酶体中GFP降解的结果这个方法可能是不成功的。
长寿蛋白质的降解
在20世纪70年代出现的最传统的一种测定自噬流量的方法是对长寿蛋白质降解的测定。在这种方法中，细胞被用同位素培养一段比较长的时间，随后用没用同位素标记的来孵育一段短时间来洗掉放射标记的主要被蛋白酶体降解的短寿命的蛋白质。在经过自噬诱导刺激处理后，被降解蛋白的胞质释放（用培养上清液中三氯乙酸溶解放射性来衡量）被定量。这可能是最定量的方法，因为它提供一个反映所有长寿胞质蛋白命运的精确的数字并且可以避免和单独检测一种自噬底物相关的陷阱。为了保证某人是在测定真正的“自噬降解”的贡献（而不是其他可能对长寿蛋白质降解做出贡献的途径），需要做一个标准实验来比较存在或不存在自噬抑制物（比如，3-甲基腺嘌呤）的样品中的降解率。这个方法的一个缺点是其需要完全依赖于特异性和使用的自噬抑制物的高效性（下文讨论）。注意事项
作为这一部分的总结，现在有多种不同的方法可以用来观测自噬流量，包括LC3流量方法，自噬底物总水平的测定（比如，LC3，GFP-LC3或者p62），mRFP-GFP-LC3颜色转换分析，由GFP-LC3产生的自由GFP的分析，溶酶体依赖的长寿蛋白质降解分析。每一种这些方法的用处和限制可能在不同的细胞类型和不同的实验条件中有所不同；因此，我们建议使用“习惯定制的”方法来测定自噬流量。因为这些方法的限制条件大都不重叠，我们建议多种方法联合使用来测定自噬流量。用这样的方法，在大多数哺乳动物组织培养条件下都应该能可靠的分析自噬流量（还有自噬活性）。不幸的是，只有几种有限的方法被报导用于在体内观测自噬流量。虽然p62的水平在自噬缺失的小鼠组织中增加，但是还不知道p62水平是如何和体内自噬的诱导相关的。和GFP-LC3转基因小鼠被用来观测体内自噬体数量相似，产生一个GFP-RFP-LC3转基因小鼠在体内观测自噬流量应该是行得通的。发展出一种能够测定病人（以及病人的血液和组织样本）的自噬
流量的方法是一个更难但是非常重要的挑战。
自噬活性的抑制
为了全面理解一个给定的生物学过程，进行试验来调节这一过程的活性是非常重要的。在现今自噬研究中一个很严重的问题就是缺乏高特异的自噬激活剂和抑制剂。即便如此，现在有几种调节剂，并且基因操作技术也为我们提供了强有力的工具。在这一部分和随后的部分，我们将分别讨论不同的抑制和激活自噬的药理和基因方法。
因为自噬体的形成需要第三类磷脂酰肌醇-3-激酶，在体外经常使用的抑制自噬的方法包括使用磷脂酰肌醇-3-激酶抑制剂，比如渥曼青霉素，LY294002或者3-甲基腺嘌呤。然而，需要注意的是所有这些试剂都能抑制第一类（抑制自噬）和第三类磷脂酰肌醇-3-激酶（自噬必需的）的活性，并且有一些磷脂酰肌醇-3-激酶的抑制剂比如LY294002和渥曼青霉素也通过靶向作用于mTOR（一种自噬抑制分子）的ATP结合位点来抑制它。此外，因为磷脂酰肌醇-3-激酶（第一类和第三类）调控多种细胞信号和膜运输途径，所以这些抑制物不是自噬特异的。另外一个就是3-甲基腺嘌呤，其在高浓度（通常是10mM）时可以抑制自噬，可以靶向作用于其他的激酶并且影响其他的细胞途径比如糖原的新陈代谢，溶酶体酸化，内吞作用，和线粒体渗透性的转变。实际上，即使是在Atg-5缺失的细胞中3-甲基腺嘌呤仍然能够抑制蛋白质降解，表明其除了自噬抑制的作用之外还有对蛋白质降解的作用。
虽然磷脂酰肌醇-3-激酶抑制剂阻断自噬体的生成，但是其他的药理学抑制剂在实验中用来阻断自噬后面的阶段。微管干扰试剂抑制自噬体和溶酶体的融合，这一步需要微管的参与。自噬货物在自噬溶酶体中最后的降解过程也可以被氯化铵，巴弗洛霉素A1和溶酶体蛋白酶抑制剂比如E64d和抑肽素A所抑制。虽然巴弗洛霉素A1最初被报导用来抑制自噬体和溶酶体的融合，但是最近的一个研究表明它至少在某些特定的条件下主要通过酸化来影响溶酶体内物质的降解。
一个重要的局限性就是微管的扰乱和溶酶体降解的抑制会影响除了自噬之外的其他细胞学过程，比如有丝分裂和内吞作用。因此，与磷脂酰肌醇-3-激酶一样，在通过此类实验来描述表型时一定要注意。考虑到目前缺乏特异的自噬抑制剂，我们建议研究人员避免单单依靠药理学的自噬抑制剂研究自噬功能时草率
作出结论。当然，药理学研究方法应该和基因方法结合起来使之能够更特异的抑制自噬通路。
可以通过敲除或者减弱不同ATG基因的表达来对自噬通路进行更特异的抑制。到目前为止，在缺乏Atg3，Beclin1，Atg7，Atg9a，Atg16L1，FIP200和Ambra1的细胞中证实了自噬的减弱。Atg4C和ULK1基因的敲除在体内呈现出野生型，可能由于相关的异构体补偿的基因的缺失。因此，在自噬减弱试验中这些基因不应该用作RNAi靶点的首选（虽然抗ULK1的siRNA至少在某些特定的细胞类型中是有效的）。另外一个RNAi介导的研究自噬抑制的问题就是某些特定的Atg蛋白在很低的水平下依然能够正常的起作用；在这些情况下，RNAi介导的沉默需要几乎对蛋白表达完全的抑制来观测有效的自噬抑制。因此，在进行自噬基因下调实验时，我们建议研究人员不仅用siRNA保证自噬蛋白表达水平有效的降低，而且也要用一个已知的自噬诱导的刺激比如饥饿来保证自噬途径高效的抑制。
另外一个对于自噬基因抑制的成功的方法是显性负突变自噬蛋白的使用。这些包括ULK1(ULK1K46N, ULK1K46R, and ULK1K46I)，Atg4B C47A，和Atg16L1的卷曲螺旋区域的激酶致死突变。此外，野生型Atg12和Atg16L1和接合缺失的Atg5突变体的过表达也导致显性负效果。因为这些显性负突变的效果有时是条件性的以及/或者细胞类型特异性的，在每一个试验中保证其抑制效果是十分重要的。
值得注意的是，大多数ATG基因的缺失或者自噬蛋白的显性负突变会阻断自噬体形成的起始。然而，在Atg3敲除的细胞中，Atg5敲除的细胞中和Atg4B C47A 表达的细胞中观察到了非正常的膜的延伸，表明属于Atg12和Atg8/LC3接合系统的这些因子可能对自噬体形成的完全终止是重要的。
理论上来说，自噬基因的减弱/敲除是一个比药理学试剂抑制自噬的更特异的方法。然而，一个重要的警告是Atg蛋白可能不完全是自噬特异的；他们可能有自噬非依赖的作用，包括在细胞死亡，内吞作用和免疫相关的GTPase运输中的作用。此外，不同ATG基因敲除的小鼠的不重叠的表型表明了Atg蛋白不同的作用。Atg3，Atg5，Atg7，Atg9a和Atg16L1定向突变的小鼠的表型在本质上是相同的（新生致死），然而胚胎致死性在缺失Beclin1，FIP200和Ambra1的小鼠中被观察到。因此，考虑到单独的Atg蛋白可能存在自噬非依赖的作用，建议联合使用不同基因方法的来增加在自噬基因敲除/减弱的条件下观察到的表型是真正
由于自噬活性的抑制而造成的可能性。
自噬活性的激活
对于自噬激活剂的研究有一个持续增长的兴趣，不仅仅是为了研究的目的更是为了可能的治疗的目的。和自噬抑制剂相似，有不同的方法来激活自噬，但是缺乏自噬途径完全的特异性。如上面所说，已知的最有效的自噬的生理诱导物是饥饿，其在体内和体外均发挥作用（氨基酸的缺少比血清或生长因子的缺少更有效）。在大多数细胞系中，缺乏氨基酸1小时就可以观察到自噬的诱导；一个明显的例外是特定的肿瘤细胞可以抵抗饥饿诱导的自噬。另外一个激活自噬的方法就是通过对营养敏感的信号途径的调节。最好的靶点是mTOR，其是自噬的有效的抑制剂。mTOR的抑制剂雷帕霉素和其类似物CCI-779可以在体内和体外激活自噬。雷帕霉素在哺乳动物中使用的一个限制是他看起来在自噬诱导中和4E-BP1的去磷酸化中只发挥部分作用。最近发展的mTOR的ATP结合位点的竞争性抑制剂比如Torin1和PP242表现出强烈的抑制活性并且作为自噬诱导试剂很有希望。值得注意的是，饥饿和mTOR的抑制不是自噬的特异的诱导剂；这些处理影响大范围的细胞反应，尤其是除了自噬激活之外的蛋白质合成和细胞新陈代谢。
几种mTOR非依赖的自噬激活剂也被报道过。锂通过抑制肌醇单磷酸酶（mTOR非依赖性的）来诱导自噬，但是也会通过抑制糖原合酶激酶3β（mTOR 依赖的）来减弱自噬；因此，如果锂被用来激活自噬，应该和mTOR抑制剂联合使用。BH3类似物比如ABT737（以及临床前的相似的复合物）通过竞争性的扰乱Beclin1和Bcl2或者BclX L来诱导自噬。海藻糖和雷帕霉素的小分子增强物可以通过目前不知道的机理来诱导自噬。两屏幕的FDA认证的复合物鉴定的额外的试剂可以以mTOR非依赖的方式诱导自噬，包括氟司必林，三氟拉嗪，哌咪清，尼卡地平，niguildipine，洛哌丁胺，胺碘酮，维拉帕米，米诺地尔和可乐宁。无论是在体外还是在体内，为了达到最大的自噬诱导效果，把在mTOR非依赖途径中起作用的药物和雷帕霉素或者其他的mTOR抑制剂联合使用来达到自噬激活的加成效果是令人满意的。
附注
我们讨论了目前在哺乳动物细胞中可用的调节自噬的技术和方法。没有一个完美的方法能够测定自噬体的数目或者自噬流量，没有完美的方法来特异激活或
抑制自噬途径。因此，应该强调，没有观察或调节自噬活性方法的黄金法则。当然，应该考虑几种不同的方法联合使用（具有非重叠限制）在任何给定的生物学环境中精确的测定自噬的状态和功能。伴随着自噬的分子机制的更深入的阐述，有希望产生更好的观测自噬的方法和更多的调节自噬的特异性的药物。如此的发展对于深入的理解自噬的生物学过程和成功的研发出用于临床医药的调节自噬的方法是至关重要的。
致谢
参考文献