多糖测定方法

2.3.4 微藻细胞内、外总糖含量的测定

(1) 配制葡糖糖标准溶液（100 μg/mL）

①使用数显式电热恒温干燥箱在80℃下将分析纯无水葡萄糖烘干至恒重。

②使用电子精密天平准确称取1g无水葡萄糖。

③加入蒸馏水，使无水葡萄糖溶解。

④充分震荡摇匀后，再加入蒸馏水使之定容至100 mL。

⑤这样就成功配制1 %葡萄糖标准溶液。

⑥准确吸取1mL 1 %葡萄糖标准液，加入蒸馏水，摇匀后，使之定容到100 mL容量瓶中。

(2) 配制蒽酮溶液

①使用电子精密天平准确称取0.2 g蒽酮。

②加入100 mL 95 %浓硫酸中。

③充分搅拌使之溶解，然后置于棕色瓶中。

④待用。最好现用现配。

(3) 制作标准曲线

①准确吸取一些葡萄糖标准溶液。

②吸取量分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL。

③放入10 mL的具有塞试管中，分别各添加蒸馏水至到1 mL。

④然后再加入4.0 mL的蒽酮溶液，充分震荡摇匀。

⑤放入电热恒温水浴锅的沸水浴中煮沸10min，然后再用水冷快速冷却至室内温度。

⑥等它们稳定之后，用紫外分光光度计测波长为620 nm的吸光度。A = 6.8540 C + 0.0027，R2 = 0.9988。

(4) 配制亚铁氰化钾和硫酸锌溶液

硫酸锌溶液的配制：

①使用电子精密天平准确称取15 g分析纯硫酸锌。

②放入50 mL蒸馏水中，充分震荡搅拌，使之溶解。

亚铁氰化钾的配制：

①使用电子精密天平准确称取0.3 g分析纯亚铁氰化钾。

②放入50 mL蒸馏水中，充分震荡搅拌，使之溶解。

(5) 测定总糖含量

①测定细胞内总糖含量

1)精确吸取藻液10 mL，使用台式离心机在5000 r/min转速下离心。

2)等待10 min后，把上清液吸出，作为待测胞外总糖。

3)放进冰箱冷冻，30min后拿出来融化。

4)然后再放进冰箱，反复3次，藻泥冻融破碎3次后。

5)分别准确加入3 mL PBS溶液，使用数控超声波清洗仪超声破碎，30 min后取出，

充分摇晃振荡。

6)放入电热恒温水浴锅的沸水中加热，加热30 min后。

7)精确吸取1 mL溶液，分别加入0.1 mL硫酸锌溶液。

8)再次放入电热恒温水浴锅的沸水浴中，加热5 min后，取出。

9)立即精确分别加入亚铁氰化钾溶液0.1 mL。

10)再次使用台式离心机在5000r/min转速下离心，离心10 min后，精确吸取上清液

1 mL。

11)放入4mL之前配制好的蒽酮溶液中。

12)然后放入电热恒温水浴锅的沸水浴中，加热10 min。

13)取出来，放进冷水中快速冷却至室内温度。

14)使用PBS缓冲液1mL和蒽酮溶液4mL混合后的溶液作为参比液。

15)使用紫外分光光度计测定波长为620 nm的吸光度。根据标准曲线换算微藻细胞内

总糖的含量。

②细胞外总糖含量的测定

1)精确吸取1 mL待测胞外总糖的藻泥的上清液。

2)分别准确加入0.1 mL硫酸锌溶液，放入电热恒温水浴锅中的沸水浴，加热5 min

后，取出。

3)立即精确分别加入亚铁氰化钾溶液0.1 mL。

4)再次使用台式离心机在5000r/min转速下离心，离心10 min后。

5)精确吸取上清液1 mL，放入4mL之前配制好的蒽酮溶液中。

6)然后放入电热恒温水浴锅的沸水浴中，加热10 min，取出来。

7)放进冷水中快速冷却至室内温度。

8)然后使用1mL 的培养液与4mL的蒽酮溶液混合后的溶液作为参比液。