兽医生物制品学

兽医生物制品学：是以预防兽医学和生物工程学理论为基础，研究动物传染病和寄生虫病的免疫预防、诊断和治疗用生物行制品的制造理论和技术、生产工艺、制品质量检验与控制及保藏和使用方法，以增强动物机体特异性和非特异性免疫力，及时准确诊断动物疫病，并给予特异性治疗，防止疫病传播的综合性应用学科。

兽医生物制品：是根据免疫学原理，利用微生物、寄生虫及其代谢产物或免疫应答产物制备的一类物质，专供相应的疫病诊断、治疗或预防之用。

疫苗：凡接种动物后能产生自动免疫和预防疾病的一类生物制剂均称为疫苗，包含细菌性疫苗、病毒性疫苗和寄生虫行疫苗。

兽医生物制品学的应用：免疫预防；诊断；治疗

生物制品安性质分类：疫苗、类毒素、诊断制品、抗病血清、微生物制剂、副免疫制品。

疫苗安抗原的性质和制备工艺分为：活疫苗、死疫苗、基因疫苗

活疫苗与死疫苗的优缺点比较：活疫苗可以在免疫动物体内繁殖，能刺激机体产生全面的系统免疫反应和局部免疫反应；免疫力持久，有利于清除局部野毒；产量高，生产成本低。但是该类疫苗残毒在自然界动物群体内持续传递后有毒力增强和返祖危险；有不同抗原的干扰现象；要求在低温、冷暗的条件下运输和储存。死疫苗不能在免疫动物体内繁殖，比较安全，不发生全身性副作用，无毒力返祖现象；有利于多价或多联等混合疫苗；制备稳定，受外界环境影响小，有利于保存和运输。但该类疫苗生产成本高，需多次免疫。而且一般只能诱导机体产生体液免疫和免疫记忆，故常需用佐剂或携带系统来增强其免疫效果。

灭活：指破坏微生物的生物学活性、繁殖能力和致病性，但尽可能不影响其免疫原性。或指破坏诊断血清或待检血清中的补体活性，以避免补体对诊断试验的干扰作用。用于灭活微生物的化学试剂或药物。

微生物致弱：是指通过各种方法使病原微生物的致病性降低或丧失，但其它生物学活性以及免疫原性并未发生本质性改变。

灭活剂：用于灭活微生物的化学试剂或药物

灭活剂的种类：

1.甲醛溶液

2.常用烷化剂：

3.苯酚：

4.结晶紫\甲基青莲\甲紫

5.β-丙酰内酯

影响灭活作用的因素

（1）灭活剂特异性（2）微生物种类与特性（3）灭活剂浓度（4）灭活剂温度（5）灭活时间（灭活时间与灭活剂浓度和作用温度密切相关）（6）酸碱度（在微酸性时灭活速度慢，抗原性保持较好；碱性时灭活速度快，担抗原性易受破坏（7）有机物存在。

保护剂：又称稳定剂，指一类能防止生物活性物质在冷冻真空干燥时受到破坏的物质。保护剂是保护微生物和寄生虫等活力和免疫力及酶和激素等生物活性的一类物质，还包括细菌或病毒的营养液、赋形剂和抗氧化剂。

疫苗冻干保护剂组成

1. 营养液：

可修复因冻干而受损的细胞，使冻干制品含有一定量水分；可促进高分子物质形成骨架，使冻干制品呈多孔的海绵状，增加溶解度

2. 赋形剂：防止低分子物质的碳化和氧化，保护活性物质不受加热影响使冻干制品形成多孔性、疏松的海绵状物，增加溶解度。

3. 抗氧化剂：抑制冻干制品中的酶作用，增加生物活性物质在冻干后贮存期间的稳定性，如维生素C、维生素E和硫代硫酸钠等。

①防止活性物质失去结构水及阻止结构水形成结晶而导致生物活性物质的损伤；

②降低细胞内外的渗透压差、防止细胞内结构水结晶，以保持细胞的活力；

③保护或提供细胞复苏所需的营养物质，有利于生活力的复苏和迅速修复自身。佐剂：传统讲：当一种物质先于抗原或与抗原混合或同时注射于动物体内，能非特异性地改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答，发挥其辅佐作用者，都称之为佐剂新概念：凡是可增强抗原特异性免疫应答的物质均称为佐剂。

佐剂种类：

1. 按佐剂物理性质：颗粒型佐剂、非颗粒型佐剂

2. 按佐剂的生物学性质（即Ballanti分类法）：微生物及其组分、非微生物物质

3. 按佐剂在体内存留的时间：贮存型佐剂、非贮存型

油乳佐剂：属于一种储存型佐剂，是指一类由油类物质和乳化剂按一定比例混合形成的佐剂。

乳剂：是将一种溶液或干粉分散成细小的微粒，混悬于另一不相溶的液体中所成的分散体系。被分散的物质称为分散相（内相），承受分散相的液体称连续相（外相），两相间的界面活性物质称为乳化剂。

乳化剂的种类：1.天然乳化剂：来自植物、动物2.人工合成乳化剂：分离子型（阴离子型、阳离子型）和非离子型：多元醇或聚合多。

油乳佐剂的制备（以制备白油佐剂为例）：

1、白油佐剂制备：取7号白油470ml，司本-80 30ml，硬脂酸铝10g，混合后用力振摇，116度高温灭菌，取30-40ml，冷却至50度左右，再用力振摇至透明均质状，即为白油佐剂。

2、乳化：（1）、取自制的组织灭活液5ml，加入2~4%的吐温-80混匀。（2）、将白油佐剂与水按3:1~2:1混匀。（3）、用匀浆机或者注射器乳化（4）、取乳化后的乳剂滴入水中，检测乳化效果。

生物制品菌（毒）种标准：生物学特性明显、历史清楚；遗传学上相对纯一与稳定；反应原性与免疫原性优良；毒力应在规定范围以内

弱菌（毒）种选育

自然弱毒株的选育：1.同源动物（如ND LaSota 株）、2.异源动物（如MD FC126株）人工诱变致弱： 1.化学途径：亚硝基胍、醋酸铊、洗衣粉 2.物理途径：高温、紫外线3.生物途径：适应非易感动物或细胞；杂交减毒

细菌培养技术

（一）细菌分离与培养

1.需氧菌的分离培养：常用营养琼脂平板分离

方法：划线接种法；倾注培养法

2.厌氧菌的分离培养：多数在二氧化碳条件下进行。最简便的培养方法使用有盖玻璃容器，放入接种的培养物后，点燃蜡烛，加盖密闭容器，由于燃烧产生二氧化碳，燃烛即刻熄灭。此时容器内含有较高的二氧化碳浓度，再将容器放入适宜温度培养即可。

（二）细菌的规模化培养

1.种子接种量：通常为1%~2%

2.培养时间：多数在对数繁殖后期至稳定前期活菌数量高，生命力最强，宜于收获。

3.培养方法：⑴固体表面培养法⑵液体静置培养法适于一般性细菌疫苗生产⑶液体深层通气培养发法⑷透析培养法

培养基的原料标准：1.水（生活用水标准）2.肉肝胃消化肉汤3.蛋白胨4.琼脂5.明胶（化学纯CP）级以上即可 6.酵母7.抑菌剂8.指示剂

培养基分类:

1按原料来源分：天然培养基；人工合成培养基

2按理化性状分：液体\半固体\固体\生化培养基

3按用途分：基础\营养\选择\鉴别\增菌\厌气\生化

病毒培养方法：

一、动物增殖病毒技术动物选择标准：

（1）大动物应来源于非疫区,最好是未接种过相应病毒疫苗、青壮年和健康(经临床检查、检疫）

（2）对相应病毒易感，并十分敏感

（3）经隔离饲养和观察检查证明健康

（4）家兔、小鼠、大鼠应符合普通级或清洁级实验动物标准；鸡应属非免疫鸡或SPF级标准；犬猫应品种明确，且符合实验动物标准。

（5）体重、年龄要基本一致，个体差别不宜过大

二、接种方法:根据病毒及研究目的的不同，可采用不同途径进行接种：皮下接种、皮内接种、肌肉接种、静脉接种、腹腔接种和脑内接种

疫苗制造流程：1.活疫苗制备：种毒鉴定、种毒批制备，细菌、病毒或寄生虫培养、鉴定，抗原纯化或提取、配苗冻干及成品检验

2.灭活疫苗制备：种毒鉴定、种毒纯制备，细菌、病毒或寄生虫培养、鉴定、抗原提取、灭活、配苗及成品检验

细胞培养的方法：

1.静置培养：将细胞悬液接入培养瓶或培养板中，置恒温箱内静置培养，细胞长成致密的单层将细胞悬液接入转瓶(塑料或玻璃瓶)，放于恒温箱的转鼓上，进行培养

2.转瓶培养

通过振荡或转动的装置，使细胞始终处于分散悬浮于培养液内的培养方法

3.悬浮培养

悬浮培养的优点：能连续培养和连续收获，不需胰酶消化，采用吹打即可分散，传代细胞不受任何处理的损失，从而可大量提高细胞数量，提高生物制品的产量和质量

4.微载体培养

微载体(microcarrier)：直径为60~105nm的细小颗粒、无毒性、透明、颗粒密度与培养液近似、略重于培养液、低速搅拌即可悬浮、表面光滑、硬度小、有弹性、不吸收培养液、易于吸附细胞

5.中空纤维细胞培养

中空纤维：由乙酸纤维、聚氯乙烯-丙烯复合物、或多聚碳酸硅等材料制成，外径50-100um，壁厚25~75um，壁呈海绵状，上有许多微孔，内腔表面是一层半透性的超滤膜，允许营养物质和代谢废物出入，而对细胞和大分子物质(如单抗)有滞留作用

6.微囊化细胞培养：适用于单克隆抗体的生产。先将杂交瘤细胞微囊化，置于培养液中进行悬浮培养，一定时间后，从培养液中分离出微囊，冲洗后打开微囊，离心后可获得高浓度的单抗

弱毒疫苗：充分致弱，不含本病原或其它病原的强毒

灭活疫苗：彻底灭活；选用优质佐剂，减少应激反应

保障疫苗效果的关键环节

1.选择(育)优良的菌种和毒种，并保持其稳定性

2.选用合适的繁殖细菌和病毒的方法，以获得高滴度的抗原量，并保持其良好的抗原性

3.使用合适的生产工艺

4.严格按标准进行质量检定

菌种：免疫原性优良的强毒菌株，老制品的菌种可向有关单位索取，新制品的菌种需作全面鉴定

种子液：将菌种接种于规定的培养基进行培养，经纯粹检验合格即为种子液

菌液培养：将种子液接种于固体或液体培养基，用固体表面培养法、液体静置培养法、液体摇振培养法、液体深层通气培养法、透析培养法等方法进行培养

纯检：菌液培养完成后，取少量作纯粹检查，同时计算菌数

灭活：用适当的灭活剂(如0.1%甲醛)、在一定条件下(如37℃过夜)灭活，同时或随后加入防腐剂

浓缩：为提高抗原量以获得更好的免疫效果，或在培养过程中未能达到所需菌数，需用离心沉淀、氢氧化铝吸附沉淀、羧甲基纤维沉淀法浓缩菌液

配苗与分装：灭活后的细菌可作为菌素苗适用；加入氢氧化铝胶、蜂胶、油乳佐剂，制成铝胶苗、蜂胶苗、油苗；制成油乳剂灭活苗时，需加入适量油乳佐剂，以保证抗原量，并充分乳化

贴标签：制品名称、用法用量、保存方法、有效期、制造日期、批准文号、批号、检验号码、

制备细菌性活疫苗的程序与灭活菌苗基本一致，不同之处在于：其种毒为弱毒菌种、无灭活过程、菌苗需加保护剂冻

动物组织苗制作

一.动物的选择

1.应符合相应的等级要求，如清洁级以上

2.动物的品种、年龄和体重也需符合要求

3.制备组织灭活苗时，所选动物应是对所接种的病毒易感性高的

4.制备组织弱毒苗时，所选动物则是培育该弱毒株时所用动物，如制备猪瘟兔化弱毒疫苗，选用兔子

二、种毒与接种

三、观察与收获

1.组织灭活苗：按一定比例加入稀释液(灭菌生理盐水)制成匀浆，加灭活剂灭活

2.弱毒组织苗：无菌操作剔除脏器上的脂肪与结蹄组织，称重后，加入适量保护剂，制成匀浆，过滤，加入足量保护剂，及一定量的青、链霉素，充分混匀，于0-4℃冰箱处理一定时间，无菌检验，分装，冻干

四、疫苗的配制

许多病毒疫苗合适于用禽胚特别是鸡胚制备，如鸡痘疫苗、禽流感疫苗、鸡新城疫疫苗、鸭瘟疫苗、鸭肝炎弱毒疫苗等

鸡胚选择：SPF鸡胚

高免血清的制备：

一、动物选择与管理

动物品种：制备抗菌和抗毒素的血清多用异种动物，抗病毒血清的制备多用同种

动物

动物年龄和健康状况：体型较大、性情温驯、体质强健的青壮年动物，自繁自养、专门动物场饲养、从非疫区购买

动物的管理：精心管理、隔离饲养、建立动物档案

二、免疫原的制备

免疫原：异物性、结构的复杂性和一定的物理性状

1.细菌抗原的制备与免疫

2.病毒抗原的制备与免疫

3.抗毒素血清制备

三、免疫程序：第一阶段为基础免疫、第二阶段为高度免疫

接种途径：皮下注射、肌肉注射、皮内注射、腹腔注射，抗原量大时，多部位注射

四、采血与分离血清

试血：免疫过程中，经试血决定是采血或继续免疫

采血：一般在最后一次免疫后的7～10天，血清抗体效价可达到高峰，便可采血；分一次采血和多次采血

分离血清：自然凝固析出、自然凝固加压法

五、免疫血清的使用

原则：正确诊断、尽早使用

用法：皮下或肌肉注射，严重者静脉注射

用量：依动物体重不同而异；大动物为10～20 ml；猪羊等中等动物为5～10ml，禽类为0.5～1ml

抗病毒免疫血清的制备：以病毒为免疫原，须通过反复冻融或超声裂解法，将病毒从细胞中释放出来，并尽可能地提高病毒滴度或和疫原性。如抗猪瘟血清，基础免疫的抗原，可用猪瘟兔化弱毒疫苗；高度免疫抗原，则用猪瘟血毒或脏淋毒乳剂等强毒。猪接种猪瘟强毒发病后5-7d，当出现体温升高及典型猪瘟症状时，由动脉放血，收集全部血液，经无菌检验合格后即可作为抗原使用。GMP：是兽药企业管理生产和质量的基本准则，适用于兽药生产的全过程；或者说是对兽药企业(包括兽医生物制品企业)生产全过程的质量管理

GMP内容：涉及人员、厂房和设备、原料采购入库、检验、发料、加工、半成品检验、分包装、成品检定、产品运输、销售、用户意见及处理等在内的全过程的质量管理

概括起来分为：1.人员：管理人员、专业技术人员和生产人员2.硬件：厂房和设施、设备、原材料3.软件：管理制度和要求

GMP的作用和特点

一、GMP的实施涉及两个方面：

1.政府兽医药政管理部门：从管理角度出发，把GMP看成政府对兽药企业(包括兽医生物制品生产企业)提出的最低要求，并作为兽药药政部门检查兽药企业和兽药质量的依据

2.兽药企业：应把GMP视为本企业所必须具备的技术水平，包括生产管理、质量管理和质量监测

二、GMP是根据通用的原则性规定，针对我国所有兽药企业而制定的。各兽药企业应按照GMP要求，制定更具体的实施细则和条例

三、GMP的主要目的是防止兽药生产过程中的污染、混淆或其他事故，根除生

产中的不良习惯，防患于未然，保证产品质量安全有效

四、GMP强调有效性的证实：对一个工序或一件用具或设备在用于生产之前，要经过验证，证明是符合要求和有效的，以保证产品质量

五、GMP要求生产管理部门和质量控制部门的权力分立：生产部门和质控部门是构成GMP的两大要素，但在组织上其地位平行，其领导应由两人分别承担六、GMP强调人员素质、卫生要求、无菌要求、核对制度以及质量监督和检查制度

猪瘟免疫失败的原因有哪些？1没有按规定妥善保存和运输疫苗，使其免疫原性降低2注射时操作不正规，剂量不足3生产实践中免疫程序不合理4母源性中和抗体对猪瘟弱毒活疫苗的干扰

猪瘟疫苗有几种类型？1猪瘟活疫苗I-猪瘟兔化弱毒兔体组织活疫苗2猪瘟活疫苗II-猪瘟兔化弱毒犊牛睾丸细胞活疫苗3猪瘟-猪丹毒-猪肺疫三联活疫苗

II号炭疽芽孢疫苗与无荚膜炭疽芽孢疫苗的异同点？1相同点：制苗菌种为炭疽杆菌弱毒C40-202株，校检菌种为炭疽杆菌C40-48弱毒菌株，所选菌株应符合炭疽杆菌生物学特性，2~8摄氏度保存期10a 2不同点：II号炭疽芽孢疫苗的毒力应为以37摄氏度培养24h的普通肉汤培养物0.2ml皮下接种200~250g豚鼠四只，于7d内全部死亡或大部死亡；以0.5ml皮下接种体重1.5~2kg家兔2只，观察10d不致病，无任何反应。无荚膜炭疽芽孢疫苗的毒力应为以37摄氏度培养24h的普通肉汤培养物0.25ml皮下接种小鼠四只，0.5ml皮下接种家兔2只和豚鼠2只，均应产生剧烈水肿，但兔不应死亡豚鼠允许死亡1只，小鼠应全部或大部死亡，死亡动物脾脏涂片染色镜检应不见荚膜。

猪丹毒疫苗有灭活疫苗和活苗两类，灭活疫苗交互免疫的效果不如活苗。（一）灭活苗猪丹毒灭活苗的免疫效果与制苗用菌株的免疫原性有关，又与培养基及佐剂的种类有关。目前应用的有以下三种：氢氧化铝吸附灭活疫苗、裂解疫苗、猪丹毒猪肺疫氢氧化铝二联灭活疫苗（二）弱毒疫苗：国内外关于培育猪丹毒弱毒菌株的报道很多，但安全和效力可靠的广泛应用的并不多。1、猪丹毒GC42活疫苗 2 猪丹毒G4T10活疫苗.G4T10弱毒菌株是江苏省农科院兽医研究所与南京兽药厂协作，用通过豚鼠致弱的G370菌株通过含0.01%锥黄素的血琼脂培养基传40代，再提高锥黄素浓度为0.04%继续传10代而培育成的3、猪丹毒-猪瘟-猪肺疫弱毒三联冻干苗（简称猪三联苗）

口蹄疫，1弱毒疫苗：口蹄疫O型A型鼠化弱毒疫苗、口蹄疫O型、A型鼠化弱毒双价疫苗、2灭活疫苗

大肠杆菌大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起动物，特别是幼龄动物疾病的总称。临床上表现为腹泻、败血症或毒血症。

大肠杆菌病特点：易感动物多，分布范围广。血清型多，但在某地或某种动物引起发病的只有少数几个特定血清型。临床表现类型多。大肠杆菌易产生耐药性。防治比较困难。

分类：①产肠毒素大肠杆菌(ETEC) ②产类志贺毒素大肠杆菌(SLTEC) ③肠致病性大肠杆菌(EPEC)④败血性大肠杆菌(SEPEC)⑤尿道致病性大肠杆菌(UPEC)

猪大肠杆菌1.仔猪黄痢又叫早发性大肠杆菌病，是出生1周内仔猪发生的一种急性、高度致死性的传染病。以腹泻（排黄色或黄白色液状粪便）、消瘦、迅速死亡为特征。2.仔猪白痢又叫迟发性大肠杆菌病，由致病性大肠杆菌引起10~30日龄仔猪发生的肠道传染病。以排乳白色或灰白色浆状、糊状粪便为特征，致死率低。3.仔猪水肿病由某些溶血性大肠杆菌产生毒素引起断奶后仔猪的一种过敏性

疾病。其特征是：突然发病，头部水肿，共济失调，惊厥，麻痹；胃壁和结肠系膜水肿。

炭疽是由炭疽杆菌引起的一种人畜共患的急性、热性、败血性传染病。其特征呈败血病变化，脾脏肿大，皮下及浆膜下组织呈浆液性冻胶样浸润和出血，凝血不全，以及败血病症状。

炭疽杆菌的致病作用由水肿因子、致死因子和保护性抗原三种毒力因子组成，任何单一因子都不能保持其生物学活性。无毒（荚膜）炭疽芽胞苗1、培养基培养种子用pH7.2-7.4普通肉汤或马丁肉汤。培养芽胞用pH7.2-7.4普通琼脂，豆汤琼脂或马丁琼脂。2、菌种系自印度引进的Sterne无荚膜菌株，由中国兽药监察所统一保管，须合乎下列标准：①菌落：在普通琼脂平板上低倍镜观察，边缘不整齐，呈卷状结构；在血琼脂平板上无溶血现象。②毒力及荚膜：以36-37℃培养24h的普通肉汤培养物，注射小鼠4只，各皮下注射0.25 ml。豚鼠、家兔各2只、各皮下注射0.5 ml。3、制苗过程将培养24h的种子液，接种于琼脂培养基表面，使分布均匀，平置2-3h，然后反置于33-35℃中培养48-96h后，涂片检查。当芽胞形成达90%以上，眼观无杂菌菌落生长，即可加适量30%甘油蒸馏水刮洗下菌苔，收入含玻璃珠之瓶内，充分振荡使芽胞均匀分散。4、芽胞苗检验

Ⅱ号炭疽芽胞苗：1、培养基种子培养用pH7.2-7.4普通肉汤，制苗用pH7.2-7.4普通琼脂、无胨肉汤琼脂或豆汤琼脂。2、菌种自日本引入的按巴斯德方法将炭疽强毒通过42℃高温培养，致弱毒力，仍保持荚膜的Ⅱ号苗菌株。由中监所保管。3、制苗过程将纯检（悬滴检查、肉汤中生长性状、平板上菌落性状观察）合格的培养24h的种子液，接种于制苗琼脂培养基表面，使均匀分布，反置于33-35℃中培养48～96h。取样镜检，当芽胞形成90%以上，加入适量的30%甘油蒸馏水洗下芽胞。4、芽胞苗检验 5.疫苗品质及应用①本芽胞苗静置时液体透明，瓶底有少量灰白色沉淀（芽胞）。振摇后稍混浊，呈乳白或淡黄色，不得有片状或絮状之异物。②保存于2-8℃冷暗处，有效期2a。

③应用时须将芽胞苗充分振荡