生物饵料培养实验指导

实验一常用单细胞藻类的形态观察

一、实验目的：

观察并识别作为饵料生物的代表性单细胞藻类的种类，为后继单细胞藻类的分离和培养做准备。

二、实验器材：

1、藻种

绿藻门：

Chlorophyta

小球藻Chlorella sp.

盐藻Dunaliella sp.

青岛大扁藻Platymonas helgolandica var. tsingtaoensis

亚心形扁藻Platymonas subcodiformis

微绿球藻Nannochloropsis oculata

硅藻门：

Bacillariophyta

三角褐指藻Phaeodactylum tricornutum

小新月菱形藻Nitzschia closterium f. minutissima

中肋骨条藻Skeletonema costatum

牟氏角毛藻Chaetoceros muelleri

xx门：

Chrysophyta

xxPavlova viridis

球等鞭金藻Isochrysis galbana

湛江等鞭金藻Isochrysis zhanjiangensis

xx门：

Cyanophyta

钝顶螺旋藻Spirulina platensis

xx门：

Xanthophyta

异胶藻Heterogloeasp.

2、实验器材

光学显微镜，载玻片，盖玻片，胶头滴管，鲁哥氏碘液，甲醛溶液，滴瓶，无菌水，擦镜纸，吸水纸

三、操作步骤及要求：

用胶头滴管吸取液体培养的各种藻类样品，滴到载玻片上（若藻种浓度大用无菌水稀释），用显微镜（低倍和高倍）观察细胞的形态大小，色素分布，运动方式，然后用碘液或甲醛固定样品，观察细胞的鞭毛着生情况（长度、数量），细胞的内部结构等。

四、结果与讨论：

1、描绘5种藻类形态、构造图，描述各种藻类的特征颜色。运动性的藻类，描述其细胞游动方式。

2、用甲醛固定样品与用碘液固定样品，在观察细胞结构上有何不同的效果？

实验二饵料生物个体及筛网xx大小的测量

一、实验目的：

1、学会并掌握使用目测微尺和台测微尺在显微镜下测量物体大小。

2、对各种生物饵料和筛网孔径大小有直观认识。

二、实验器材：

1、器材

光学显微镜，目测微尺，台测微尺，载玻片，盖玻片，胶头滴管，鲁哥氏碘液，擦镜纸，水，吸水纸

2、样品

各种规格的筛网小片，扁藻，三角褐指藻，小球藻，卤虫休眠卵，褶皱臂尾轮虫

三、方法与步骤：

（一）、目测微尺的校正

目测微尺也称目微尺，为一圆形光学玻璃片，可被安装到光学显微镜的目镜中。玻片中央刻有一条线段，此线段被等分成共100格。由于显微镜物镜下的物体经过放大，而目镜中的目测微尺没有被放大，因此，当以目测微尺为参照物目测微尺的每一格刻度线的测量长度因显微镜物镜的放大倍数的不同而不同。故必须用台测微尺进行校正，以求得在特定的放大倍数下，目测微尺每一格线所代表的真实长度。

台测微尺也称台微尺，是一片中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般为1mm等份成100格，每一格的实际长度为，即10.0微米。

当要校正目测微尺时，先将显微镜的目镜取下，旋开目镜，将目测微尺装入目镜镜筒内的搁板上，然后旋紧目镜。注意，目测微尺的有刻度面应朝上。将带有目测微尺的

目镜重新装好，此时观察目镜可见视野中央有一刻度尺。确认目测微尺的刻度线清晰，明了。若刻度线不清楚，则需将目测微尺重新取出，用擦镜纸小心擦拭后重新安装。

将台测微尺置于显微镜的载物台上，先用低倍镜观察，调节调焦旋钮和光栅，直至看清楚台测微尺的刻度线。旋转目镜，使目测微尺与台测微尺平行。移动载物台的推进器，先使两尺重叠，再使两尺在视野的左方某一刻度完全重合。然后从左到右寻找第二个完全重合的刻度。并计数两重合线段之间目测微尺和台测微尺的格数。由于台测微尺的刻度是镜台上的实际长度（10微米），故可通过下列公式计算出当前放大倍数下目测微尺每格的测量长度：

目测微尺每格长度（微米）=两重叠刻度之间台测微尺的格数*10/两重叠刻度之间目测微尺的格数

同样，将物镜转换成高倍物镜，再次校正在高倍镜下目测微尺每格的测量长度。校正完毕，将台测微尺擦拭干净后小心放好。

（二）测量：

取一干净的载片。用吸管吸一滴微藻样品。小心地加好盖片后在显微镜下观察。调好焦距。转动目微尺测出其长、宽各等于目微尺多少格。再由已经计算出的相应的放大倍数下目微尺每格的长度（u）。算出饵料个体的长，宽的实际长度。

将轮虫用鲁哥氏碘液固定后，在低倍镜下测量轮虫兜甲的长宽。其他饵料样品依次同样进行测量。

在测定筛网孔径大小时，先在载玻片上滴加一滴水，将一小片筛网放在水滴上，然后在其上加盖盖玻片，测量其孔径（内径）的长宽。

四、实验报告：

1.写明你所用的显微镜号码，高，低倍镜的放大倍数及在高、低倍镜下目测微尺每格长度的计算。

2.量出4种生物饵料样品的长，宽，每种测量3个细胞。

3.测量200目、120目、100目和80目四种筛网的孔径大小。

4.讨论：1）测量筛网孔径时滴水的目的。2）如何使测量结果更准确

实验三单细胞藻类浓度的测定

一、实验目的：

1、熟悉饵料微生物的定量方法。

2、掌握血球计数板的使用，学会正确定量饵料微生物的浓度。

二、血球计数板的原理和构造：

血球计数板由一块特殊规格的载玻片特制而成。板的中央透明区一般由一H形沟分成两块。每一块即是一计数池。每个计数池上分别刻有准确面积的大、中、小方格。一般每个计数池被分成九个大方格。每个大方格的面积为1平方毫米。计数池两侧的凸起部分与计数池之间有0.1毫米的高程差。因此，当在计数池上方加盖盖玻片时，盖玻片下每个大方格区域内的体积为0.1立方毫米。计数池中央的大格又被双线划分成25个中格，其中的每个中格又被单线划分成16个小格（也有一类计数板的每一个中央大格先分成16个中格，每个中格分成25个小格）。因此，在中央大格内，1平方毫米被均匀分成16*25（即400）等份。计数时，当样品用细口滴管滴加到计数池后，通常计数中央大格的五个中格内的细胞数，即可推算出整个中央大格内的细胞数，即0.1立方毫米的细胞数。由此可推算每毫升内饵料生物的浓度。三、实验器材：

1、器材

光学显微镜，血球计数板，盖玻片，计数器，5毫升量筒，1毫升移液管，细口胶头吸管，擦镜纸，吸水纸，消毒海水，鲁哥氏碘液，纱布。

2、样品

小球藻，扁藻

四、方法与步骤：

1、将盖玻片和计数板用擦镜纸擦拭干净，将盖有盖玻片的计数板放在显微镜的载物台

上，调焦，用低倍镜仔细观察计数池的结构。

2、将计数板连同盖玻片一起取下，用细口胶头滴管吸取摇匀的藻液，迅速将吸管尖靠

在计数池上盖玻片的边缘，略挤胶头滴管使藻液进入盖玻片下，直至充满整个空间，多余的藻液会流入H形的凹沟中。注意，当藻液浓度高时为了便于计数，可将藻液稀释后进行计数。在计数有鞭毛或有运动性的藻类时，可先吸取定量的藻液，滴加鲁哥氏碘液进行固定，然后添加消毒海水稀释后计数。

3、样品添加到计数池后，静置片刻。在显微镜下仔细调焦，同时调节光栅，必要时调

节光源和反光镜角度，直至细胞和纵横格线都清楚。

4、统计计数池中央大方格内四角及中央中格内的饵料生物的数量。并记录。计数时，

小心移动载物台，从上到下，由左及右又由右及左依次计数各小格内的细胞数。凡压方格的上线和左线的细胞，统一算此方格内的细胞，而压方格的下线和右线的细胞，统一不算此方格内的细胞。

5、将计数板及盖玻片用流水冲洗，擦干，重复上述步骤，对同一样品再计数2-3次。

6、将同一样品的计数结果，取平均值。代如下式，求算单胞藻的密度：

单胞藻密度（个/ml）=平均每小格内的细胞数*16*25*100*稀释倍数

7、计数完毕，将血球计数板冲洗干净，用纱布吸干水分，用擦镜纸包装后连同盖玻片

一起放入原盒子内。

五、报告与数据处理：

1、将原始记录连同计数结果，填写实验报告。

2、样品滴加到计数池后，为什么要静置片刻后才计数？

实验四单细胞藻类的分离

（一）微吸管分离法

一．实验目的：

藻类在自然界中与其他生物杂居在一起，在研究工作中。常常需要把它们和其他生物，特别是其他藻类分开，进行单种或纯种培养，这叫分离。本实验的目的是使学生熟悉单细胞藻类的微吸管法分离技术。

二．实验器材：

解剖镜，显微镜，凹玻片，载玻片，大盖片，喷灯，砂轮，细玻管，橡皮头，培养皿，无菌培养液，待分离藻种。三、方法与步骤：

1、拉制微吸管：

用砂轮将孔径3—4mm玻璃管载成35—40mm的段。浸入浓HCL（或HNO

3）溶液中洗去污物。先用自来水，后用蒸馏水洗净烘干。然后点燃喷灯，两臂加紧，手持玻璃管在火焰上烧灼其中部一面烧一面转一面。使其受热均匀。待玻璃管烧红软化后稍向上提，两手均匀用力。向相反方向拉引。将中段拉长约6—10cm。使这段孔径约为0.5mm。冷却后从中间拉断。尾部在喷灯上烧红迅速压在玻璃板或石棉网上，使成扩张状。

使用前将吸管在酒精灯上加热，用镊子夹住细头部拉成孔径约0.1mm的微吸管，尾部套上橡皮头或孔胶管备用，如进行纯种（无菌）培养，微吸管需经灭菌。为了防止擦伤藻体，微吸管头部可在酒精灯上烧灼圆滑。

2、分离：

首先镜检待分离藻液，如浓度过大应予以稀释，一般以每小滴藻液中含5—10个藻细胞为宜。

在一已灭菌后的清洁载片上滴加9滴消毒培养液，方法如上图。另取一载玻片滴一滴稀释的待分离藻液，在解剖镜（或显微镜）下用微吸管吸取其中所需的藻体（最好是1个，也可以是多个2—5个）放入第一滴水中，用一干燥的吸管洗（从一边吹水滴，使藻体在水中旋转，均匀）。然后换一干净的微吸管从第一滴水中吸一个（或13579

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数个）藻细胞，放入第二滴水中，清洗，依次而下，直至水滴中含一个藻细胞。（清洗是为了洗去藻体上附有的细菌，进行无菌培养）。用微吸管将此单个藻细胞转移到滴有培养液的盖玻片上，将盖玻片在凹玻面上进行悬滴培养。每天数次观察藻体分裂情况。如繁殖良好，可以扩大培养成纯（单）种。

扩大后的培养液镜检为单种时，分离成功。

注意：

1、培养液配方根据待分离藻种的不同选择，一般用F/2配方。

2、此微吸管所形成的小滴以显微镜低倍镜一个视野能全看到为宜。但又不能太小，以免很快干掉。

四、报告与讨论：

1、在分离中需要注意哪些问题？

2、怎样才能熟练掌握分离技术？

实验五单细胞藻的分离

（二）平板分离纯化技术

一、实验目的：

本实验的目的是使学生熟悉并掌握利用平板分离单细胞藻类的技术。

二、分离原理：

用平板分离纯化藻种，一般可分为划线，喷雾和倾注平板等方法。其共同点是分离用水样首先经过适当稀释，再使水样分散到固体平板培养基上。等藻类在平板上成藻团时进一步分离，直至成单种。

三、实验器材：

中试管，大试管，培养皿，移液管，烧杯，分装漏斗，血球计数板，计数器，接种针，喷雾器，营养盐成分，待分离单胞藻等。

四、方法和步骤：

1、培养基的制备配方如下：

1000ml培养基中的

加入量

N—4（F/2）N 1 ml（相当于

4mlF/2N）

P—4（F/2）P 1 ml相当于

4mlF/2F）

EDTA-Na

21 ml（4*36.3um储

液）

柠檬酸铁

Soil extract（浓)

Agar

Sea Water

*每ml约等于20滴

（1）将试管、培养皿、移液管等玻璃工具在烘箱中消毒。

（2）在烧杯中加入100ml海水，水位标号。称取1.2g琼脂，撕碎加入海水中，在电炉上加热，不断搅拌至琼脂完全溶化。损失的水分用蒸馏水调整。

（3）按配方比例加入各营养成分、搅匀。0.5ml(1%储液)

1ml

12g

1000ml1滴

2滴

1.2g

100ml2滴

8滴

100ml培养基中的加

入量

8滴*(F/2N)

（4）分装试管：

每组分装中试管12支（5ml/支），大试管4支（20ml/支），无菌海水3

支（9 ml/支），标明班组。

（5）高压灭菌：15磅/时

2、121℃、20分钟。稍冷却后在超净工作台内分装试管，完成后置斜面，在培养皿中倒平板

2、分离：

（1）分离前的水样先用血球计数板浓度，一般以每毫升1000—5000个为宜，太浓时应先进行稀释。用灭过菌的1ml移液管吸取1 ml水样加入9ml无菌海水中，换一移液管进行第二次，第三次稀释，稀释水样标号。

（2）喷雾法：

将稀释好的水样（10-

2、10-3）装进灭好菌的喷雾器中，对准事先做好的平板进行喷雾，然后盖好，放入光亮处培养。

（3）倾注法：

用灭过菌的移液管吸取1ml稀释过的水样（10-

1、10-2）加入事先先灭过菌的培养皿中，接着倒入45℃的培养基（保存在恒温水浴中）轻轻摇动一下使水样和培养基混合均匀，放在光亮处培养。

（4）固体斜面大接种：

等藻团长出后，镜检是否为单种，如不是单种，进一步进行平板划线分离，至单种时，用接种环挑取藻体在斜面上划线。

1、结果与记录

几天后观察藻类生长情况并进行记录，描述（包括培养条件）将结果写进实验报告，交实物和报告。

注意：

1、用于倾注法的水样应比喷雾法浓一个数量级，因为多数海水藻类的最适温度为25℃左右。加入45℃培养基时必有一部分藻类被烫死不能生长繁殖。

2、培养条件非常重要，要求一定的温度（25℃左右。根据藻种不同而异）和一定光照。

否则藻类不能生长而细菌则大量繁殖，导致分离失败。实验四微藻的培养

一、实验目的：

本实验要求学生掌握培养基成份计算，配制培养基，消毒、接种、测定等有关培养的基本操作与管理，巩固课堂讲授知识从而有可能做到有计划地为使用培养提供足够数量的符合质量的藻种，

二、实验材料：

1、一般用培养液配方

NaNO

30.03CO(NH

2)2KH

2PO

40.005FeC

6H

5O

7(1%溶液) 0.2维生素B

1200xx、》

xxB

12200

f/2微量元素溶液

CuSO4.5H2O 0.01mg ZnSO4.7H2O

0.023mg CoCL2.6H2O 0.012mg

MnCL.4H2O 0.18mg Na2MoO4 2H2O

0.07mg Na2EDTA

海水1000xx

0.03xx

克毫升

微毫微克

4.35mg

毫升培养绿藻、金藻、硅藻使用，培养硅藻时添加0.02克/升硅酸钠。

2、藻种：

扁藻、小球藻等液体单种

3、器材：

公用器材：

电炉、烧杯、海水比重计、量筒（250ml）、温度计、封口纸，橡皮圈，过滤海水，基础配方贮液。

小组用器材：

显微镜，血球计数板，计数器，量筒，纱布，盖玻片，载玻片，擦镜纸，吸水纸，酒精灯，火柴，标签纸。

三、方法与步骤：

1、各种玻璃器皿：

用洗洁净刷洗干净，放入100度烘箱烘干。

2、取2只500毫升的三角烧瓶，加入100毫升的自来水，擦干瓶外水滴，瓶上安装漏斗，将其加热煮沸，利用瓶中水产生的蒸汽消毒5分钟，然后将水倒掉。

3、用量筒量取100毫升过滤海水，加入三角烧瓶，同时加入配方的营养盐母液各0.1毫升。

4、将海水消毒，（同2），当开始冒泡时将其取下。瓶口立即用消毒后的封口纸及橡皮圈消毒。培养液自然冷却到室温。震荡烧瓶，恢复原海水中气体溶解量。

5、接种：

将其添加到消毒培养液中。

7、强烈震荡三角烧瓶，用消毒滴管取样1毫升，加固定液（运动藻类）1滴，用血球计数板计数。

8、将培养瓶置于一定的光照和温度下进行培养管理，并做好记录，一周左右，再次用

血球计数板计数培养密度，视情况按一定比例扩种。四、报告与讨论：

培养结束后提交培养报告，并讨论以下问题：

配方中的N/P比是多少？