he染色步骤HE实验步骤

he染色步骤 HE实验步骤

动物病理切片小结

[样本处理]

动物麻醉后，开胸，暴露心脏，头皮针插入左心室尖，打开37?生理盐水输液装置，从右心耳下沿剪开右心房，灌洗至流出的生理盐水无血(20min)，换4%多聚甲醛固定液灌注(约5min)

[固定]

4%多聚甲醛固定。

[石蜡切片]

取样从固定中取出待切组织，用手术刀切成2mm厚度的小样，装入脱水小盒中，铅笔标号纸条同放入小盒后流水洗30min，蒸馏水浸洗处理

Mice:

脱水

50%乙醇 2-3h

1

70%乙醇 1-2h

80%乙醇 1h

95%乙醇 2h(1h+1h)

100%乙醇 2h(1h+1h)

透明二甲苯 35min+35min

浸蜡 1h+1h+1h (62?蜡)

[HE染色]

脱蜡二甲苯? 15min

二甲苯? 15min

二甲苯:无水乙醇(1:1) 2min

无水乙醇? 2min

无水乙醇? 2min

95%乙醇 2min

85%乙醇 2min

70%乙醇 2min

50%乙醇 2min

蒸馏水 5min

(如果是DAB染色要抗原修复)

HE染色

苏木素 6-8min (时间可以延长，现在10-30min)

冲洗 1min(反向将载玻片反向冲洗，注意不要脱

片)

2

含1%盐酸的乙醇进行分色(用75%乙醇配)2-3s动作要快氨水反蓝 >10min

伊红 10s

冲洗

固定

脱水95%乙醇 2min

100%乙醇? 2min

100%乙醇? 2min

二甲苯? 2min

二甲苯? 2min 树胶封片

组织浸蜡-

常规石蜡切片制作

组织经过透明剂的完全透明后，被移放于65?左右熔化的石蜡中，于65?的电热恒温箱中浸渍的过程称为浸蜡。

组织在脱水时，组织中的脂类和类脂等物质在脱水剂的作用下被溶解掉，留下了许多腔隙，许多管腔组织和血管，也有许多腔隙，这些都严重地影响了切片。组织浸蜡时，由于诱导剂(二甲苯)的作用，石蜡进入到组织的各个角落，并在各个角落中保存下来。当石蜡包埋后冷却时，这浸入到里

3

面的石蜡便可起到支撑的作用，而且使组织不致于变形，塌陷等现象，使切片能完整的切出，便于镜下观察。

组织浸蜡据多次文献报到必须换几次不同熔点的石蜡。石蜡有软蜡和硬蜡之分，软蜡的熔点有45?、52~54?。硬蜡的熔有56~58?，58~60?、60~62?。浸蜡的顺序是先软蜡，后硬蜡，浸蜡的时间根据组织不同而确定不同的时间。有的人指出组织浸蜡先放入二甲苯与石蜡等份混合的液体中浸渍然后再放入软蜡、硬蜡。根据使用经验我认为不必要这样做。因为组织经二甲苯或其它透明剂透明后，在组织进入石蜡时，自己还带着残存的透明液，如为手工操作，可将组织块控干，尽量减少残存液的存在，而自动脱水机则不然，组织可存留一定量的透明剂，经使用次数多次后，残存的透明剂可把石蜡稀释。因此机器程序处理的次数较多时，应注意换石蜡，以防组织浸蜡效果不好。

一、石蜡的性质

石蜡是一种碳氢化合物，由矿物油的分裂产生，它的性质是相当的不同，其熔点在45~62?之间。熔点高的为硬蜡，硬度较高，适合于夏天切片的用蜡，熔点低的为软蜡，54?以下的称为软蜡，这种适合于组织化学的切片用蜡。根据石蜡的特点，根据季节的不同，合理地使用不同熔点的石蜡，这是能否切好片，使切片产生带状的关键。

二、石蜡性质的改善

4

为了获得较好的连续切片，人们想出了许多种方法，对石蜡进行改造，使石蜡的硬度和柔软性更适合于佳片的切出，提出了许多种方法:

石蜡加热冷却法

刚购入的石蜡,不管是动植物切片石蜡也好,还是工业用蜡也好,都必须进行处理,方法是:将石蜡放于容器里,于电炉上加热,此时石蜡遇热熔解并发出哔哔吧吧的声音,这是石蜡中含有的杂质,遇热后分解所发出的声音,随着时间的延长,温度的升高,这种声音将逐渐减少,直至消失。此时可将盛装石蜡的容器浸入冷水中，石蜡凝结后，再继续加热，如此反复几次即熔化—冷却—熔化—冷却。这种处理方法，可增加石蜡的密度和可塑性，除去杂质。为达高质量的切片，这是必经之法。

增加和改善石蜡的韧性和粘度

这种方法则需要加入一些东西才能获得，如蜂蜡和硬脂肪，蜂蜡最高熔点可达70余度，增加它可增加石蜡的硬度。石蜡切片切4—5um，60?左右的石蜡可支撑得起，如要切1~3um，其硬度则不够，因此，要制出较薄的切片，石蜡硬度一定要过关。

另外，增加石蜡的硬度还可以加入脂蜡酸、柏油、杨梅蜡等，虽然如此，石蜡经处理后，用时的颜色如肥皂一样为最好。

5

在了解了石蜡的性质及如何改造它后，下面再了解组织浸蜡。

三、传统浸蜡法

这是手工操作和不带真空负压的浸蜡方法。根据石蜡的熔点，确定浸蜡箱的温度。如硬蜡的熔点为62?,浸蜡箱的温度应比石蜡熔点高出2~3?，即浸蜡箱调在65?，当确定好后，将组织放入软蜡，后转入硬蜡，根据不同的组织，组织的大小来确定浸蜡时间，小组织20~30分钟，大组织几个小时不等。

四、真空负压浸蜡法

真空负压浸蜡法应用一真空泵，将箱内的空气抽出来，形成真空负压，在这种条件下，由于失重，各种分子活动加快，促使浸蜡过程迅速完成。为了浸蜡完全彻底，全密闭自动脱水机配有这一功能。

真空负压浸蜡法使用时的注意事项:

真空恒温干燥箱的温度应略高于传统浸蜡法，因为在抽气形成真空时，箱中的热气会被抽出，致使箱中温度下降，使熔化的石蜡凝结成块，所以温度调至70度左右为宜。

计时应从浸蜡完全熔化时计起。抽气时，箱中的温度下降，此时浸组织块的蜡如果处于凝固时，应待其熔化后，方可计时。

附:几种组织处理程序。

6

(1)、常规组织处理程序

1、组织块冲水24小时。

2、70%酒精24小时。

3、 80%酒精12小时。

4、 90%酒精12小时。

5、 95%酒精(1)2小时。