感受态细胞常用的制备方法
感受态细胞常用的制备方法
常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA，，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。
转化，是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。?
α-互补现象：因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补（α-互补）。当这种载体转入可编码?－半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-?-D 硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为α-互补现象。由互补产生的α－半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA时，会造成LacZ(α)基因的失活，破坏α-互补作用，就不能产生具有活性的酶。所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。
杆菌电转化感受态细胞制备经验过程
实验步骤：
1、将适合菌株（如XL1-Blue, DH5α）置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37°C下过夜培养。
2、高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）。准备几瓶灭菌水（总量约1.5升），保存于冷冻室中以备重悬浮细胞用。
3、转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB（或其他营养丰富的培养基）的1-2升挡板摇瓶中。
4、37°C下剧烈振荡培养2-6小时。
5、定时监控O.D.600值（培养1小时后每半小时测定一次），当O.D.600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15分钟（需要的话这种方式可以存放培养液数小时）。
6、细胞在4°C 5000g下离心15分钟，弃上清液（如需要，沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天）。
7、用灭菌的冰水重悬浮细胞。先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中（几毫升），然后加水稀释至离心管的2/3体积。
8、照上面步骤重复离心，小心弃去上清液。
9、照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞。
10、离心，弃上清液。用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞14. 照上面步骤离心，小心弃去上清液（沉淀可能会很松散）。
11、用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml。
12、将细胞按150μl等份装入微量离心管，于-80°C保存。
转化方法:
1、在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ，冰上培育约5分钟。
2、添加1-3μl DNA ，冰上培育约5分钟。
3、转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器（无泡）中。
4、加载P1000，准备好300μl LB 或2xYT 。
5、对电穿孔容器进行脉冲（200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏）（检查时间常数，应该在3以上）。
6、立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中。
7、37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原。
8、转移细胞至适当的选择培养基上培养。
高效感受态细胞制备
方法一：
效率非常高，一般可到10*8，好时可到10*9，特别适宜于大片段与文库构建及珍贵材料的连接转化。
实验试剂：
A液：1M，MnCl2：
B液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用无菌水配，配后不需灭菌；
C液称取CaCl2 0.10g，KCl 1.18g，全部转入细口试剂瓶，然后加入46ml三蒸水，轻轻振荡使所有组分充分溶解。将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎，然后放入灭菌锅121℃高压灭菌备用。
取1管B液（0.6ml），全部加入C液(46ml)中，混匀后，再用1ml移液器加入3.3ml A液，混匀冰浴即可使用。
实验步骤：
1、划线得到单菌落,37℃培养箱培养约17小时。
2、挑取2-4个形态饱满的单菌落接种于装有100ml SOB 培养基的三角瓶,37℃剧烈振荡（300 rpms）培养3-4小时。
3、将培养温度调至18℃剧烈振荡（3280 rpms）培养，其余与普通感受态差不多。
4、每管加入4ml TB缓冲液，轻轻振荡，使菌体重新悬浮。
5、加入280ml DMSO（可用国产分析纯），混匀后分装入1.5ml EP管，冰上静置15分钟。
6、用纱布将所有装有感受态的EP管包好，用棉线系好后放入液氮中速冻，在液氮中静置12小时以上。
7、取出感受态放入-70℃超低温冰箱备用。
注意事项：
1、洁净是最重要的。无菌都无所谓，在操作台上可正常操作。
2、离心力要注意不要超过2500g,建议1500-2000g 5min。
3、涂板不要觉得不匀而多次反复，轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴2小时以上的板。
4、涂完后建议空气晾干（20-30分钟）这样会减少卫星菌落出现。
5、预冷是必要的。整个过程的低温也并非特别重要。
大肠杆菌感受态细胞的制备实验具体步骤及说明
大肠杆菌感受态细胞的制备实验具体步骤及详细说明 带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。 带有外源DNA 的重组质粒，在体外构建后，导入宿主细胞，随着细胞的大量复制、繁殖，才能够有机会获得纯的重组质粒DNA，该过程称之为转化过程。受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl 等化学试剂）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，能容许外源DNA 的载体分子通过。 具体步骤 1、从37℃培养16-20 h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3 mm)，转到一个含有100 ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3 h。一般经验，1 OD600约含有大肠杆菌DH5α 109个/mL。 2、将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中，在冰上放置10 min，使培养物冷却至0℃。 3、于4℃用Sorvall GS3特头（或与之相当的转头）以4 100 r/min离心10 min，以回收细胞。 4、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
5、每50 ml初始培养液用30 ml预冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。 6、于4℃用Sorvall GS3转头（或与之相当的转头）以41 00 r/min离心10 min，以回收细胞。 7、倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。 8、每50 ml初始培养物用2 ml用冰预冷的0.1 mol/L CaCl2(或TFB)重悬每份细胞沉淀。 9、此时，可以用新鲜制备的感受态细胞直接做转化实验，也可以将细胞冻存于- 70℃。 注意事项 1. 为达到高效转化，活细胞数务必少于108个细胞/mL，对于大多散大脑杆菌来说，这相当于OD值为0.4左右。为保证细菌培养物的生长密度不致过高，可每隔15-20 min测定OD600值来监测，用监测的时间及OD值列一个图表，以便预测培养物的OD600值到0.4的时间，当OD600值达到0.35时，收获细菌培养物。 2. 在菌株与菌株之间，OD值与每毫升中活细胞散间的关系变化很大，因此有必要通过漶量特定脑杆菌的生长培养物在生长周期的不同时相的OD600值，并
高效感受态细胞制备试剂盒
高效感受态细胞制备试剂盒 产品编号：SK9305/SK9306 包装规格：40支/200支 试剂盒组成 组分 SK9305，40支 SK9306，200支 BT Buffer F 10 ml 5 × 10 ml BT Buffer E 4 ml 5 × 4 ml 2个 10个 BT Media (1 Capsules for 50 mL) 操作手册1份1份 保存方法及注意事项 BT Media以胶囊的形式提供，请于室温密封干燥保存。BT Buffer F和BT Buffer E可于常温运输，收到后请于4°C保存，长期保存请置-20°C。 产品介绍 生工BT高效感受态制备试剂盒采用了一种简单而可靠的方法制备感受态细胞，由该试剂盒制备的感受态细胞在进行转化时无需经过热激步骤，对于Ampicillin抗性质粒而言，甚至连活化步骤都可以省略，感受态细胞和DNA混合后即可直接涂布，极大地简化了转化过程，提高了实验效率。用该试剂盒制备的大肠杆菌DH5α细胞使用pUC19质粒DNA转化，转化率可以达到107~109 cfu/μg DNA，对其他常用的工程菌株和质粒也同样适用。 产品特色 1. 感受态制备流程快速简单。 2. 转化过程无需热激。 3. 转化效率高达107~109 cfu/μg DNA。 4. 使用感受态专用培养基，最大化感受态效率。 5. 适合大量制备。 高效感受态细胞制备流程 自备材料：目标菌种、LB培养基及平板、离心机、50 ml离心管、冰等。 BT Media培养基准备：将一只胶囊投入50 mL蒸馏水中，高压灭菌即可。 准备工作：将BT Buffer F和BT Buffer E放冰上预冷，预冷低温离心机至4°C。 1. 用超低温冰箱中保存的菌种在LB平板上进行划线培养，置37°C培养箱中静置培养12~16 h待菌落生长至直径1~2 mm大 小。 2. 挑取一个生长正常的菌落，接种至10~15 mL液体LB培养基中，于37°C摇床充分振荡（≥ 250 rpm）培养12~16 h。 3. 取上述活化好的菌液0.5 mL接种至准备好的50 mL BT Media中，于37°C摇床充分振荡培养至菌液OD600 = 0.4~0.6。? 50 mL培养物请使用容量大于250 mL的锥形瓶，同时摇床转速超过250 rpm以保证充气充分。 ?使用较低的温度（18·26°C）培养细菌将使感受态效率进一步提高一个数量级，室温状态下菌液培养至OD600 = 0.4~0.6需要10~36 h。
JM109,DH5a,BL21等感受态细菌特点及应用
1：DH5a菌株 DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coliDH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛 选鉴别重组菌株。 基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1 2：BL21(DE3) 菌株 BL21菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21 的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT， hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3） 3：BL21(DE3) pLysS菌株 BL21(DE3) pLysS菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。PLysS含有 表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋 白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLysS ，Camr 4：JM109菌株 JM109菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α －互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株 基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac －proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15] 5：TOP10菌株 TOP10菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。 基因型：F- ，mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，φ80，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1 ，araΔ139Δ(ara-leu)7697， galU，galK ，rps， (Strr) endA1， nupG 6：HB101菌株 HB101菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验 基因型：supE44，hsdS20（rB-mB－），recA13，ara－14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，leuB6，thi-1
(完整版)大肠杆菌感受态细胞的制备
大肠杆菌感受态细胞的制备 标签： tr..,Ca..,co.. 分类：细胞技术> 感受态细胞 来源： 实验管理实验概要 大肠杆菌感受态细胞的CaCl2法制备及质粒转化 实验原理 处于对数生长期的细菌经CaCl2 处理后接受外源DNA的能力显著增加。细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。 在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态，以摄取外源DNA。 转化（Transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体 （R-,M-），它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2 ，RbCl(KCl)等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Compenent cells）。进入受体细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA 分子的受体细胞）。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存（半年），因此CaCl2法使用更广泛。 主要试剂 (1)0.1mol/L CaCl2溶液 (2)LB液体培养基
常用几种感受态区别
常用大肠杆菌感受态JM109，DH5a，BL21的区别 1：DH5a菌株 DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。 基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1 2：BL21(DE3) 菌株 该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ 噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT， hsdS（rBB-mB－），gal， dcm（DE3） 3：BL21(DE3) pLysS菌株 该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。 基因型：F-，ompT hsdS（rBB-mB－），gal， dcm（DE3，pLysS ，Camr 4：JM109菌株 该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株 基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15] 5：TOP10菌株 该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。基因型：F- ，mcrAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，φ80 ，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1 ，araΔ139Δ(ara-leu)7697， galU ，galK ，rps， (Strr) endA1， nupG 6：HB101菌株 该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验 基因型：supE44，hsdS20（rB-mB－），recA13，ara－14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，leuB6，thi-1 7：M110或 SCS110 大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶 C-5位置上引入甲基。常用的菌株都会产生dam,dcm，从而受到甲基化的影
感受态细胞的制备(DH5α大肠杆菌)
感受态细胞的制备（DH5α） 一、准备工作 所有试剂、容器均需提前预冷。 1、实验器械 4℃离心机（50ml离心管），37℃恒温箱，37℃摇床，超净台（使用前需要紫外消毒15min 至少）；0.22μm的滤器2个（过滤灭菌TfB2种溶液），10ml注射器2个；冰盒；高压灭菌的1.5mlEP管1盒，与离心机配套的50ml离心管6个（高压灭菌），高压灭菌的500ml 锥形瓶2个，高压灭菌的100ml玻璃瓶2个，高压灭菌的1ml枪头和200μl枪头各一盒。 2、试剂配制（甘油特别难吸，用蓝枪头慢慢吸吧） ① LB平板：单纯LB平板，加有amp或有kana的（制板时需标注好类型，时间）。 ② SOB培养基（Super Optimal Broth） ③ TfBⅠ：（100ml制备量）分别称取乙酸钾0.294g，MnCl2 0.99g，KCl 0.146g，CaCl2 0.111g，置于200ml烧杯中，加入15ml甘油和85mlDDW，摇晃，使其全部溶解。然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液，置于高压灭菌的100ml玻璃瓶中，4℃保存，使用前必须预冷。（装在50ml离心管，封口4度保存） ④ TfBⅡ（20ml制备量，每次现用现配，装在50ml离心管）：分别称取MOPS 0.046g，CaCl2 0.167g，KCl 0.015g，置于50ml烧杯中，加入3ml甘油和17mlDDW, 摇晃，使其全部溶解。然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液，使用前必须预冷。
配制量 1 L 配制方法 1.配制250 mM KCl溶液。（50ml离心管分装） 在90 ml的去离子水中溶解l.86 g KCl后，定容至100 ml。 2.配制2 M MgCl2溶液。（50ml离心管分装） 在90 ml去离子水中溶解4.06g MgCl2 6H2O后，定容至100 ml，高温高压灭菌。 5.量取10 m1 250 mM KCl溶液，加入到烧杯中。 6.滴加NaOH小块，调节pH值至 7.0。 7.加入去离子水将培养基定容至l L。 8.高温高压灭菌后，4℃保存。 9.使用前加入5 ml灭菌的2 M MgCl2溶液。 LB培养基 配制量 1 L 配制方法 3.滴加固体NaOH，调节pH值至7.0。 4.加去离子水将培养基定容至1 L。 5高温高压灭菌后，4度保存。
CaCl2感受态细胞的制备实验步骤
CaCl2感受态细胞的制备实验步骤 ?1、从新活化的E.coli DH5α平板上挑取一单菌落，接种于3～5ml LB液 体培养中，37℃振荡培养至对数生长期(12h左右)； ? 2、将该菌悬液以1:100～1:50转接于100ml LB液体培养基中，37℃振 荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD600，至OD600为0.3～0.5时停止培养，并转装到1.5 mL离心管中； ? 3、培养物于冰上放置20min； ? 4、 0～4℃，4000g离心10min，弃去上清液，加入1 mL冰冷的 0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞, 冰浴20分钟； ?5、0～4℃， 4000g离心10min，倒净上清培养液，再用1.0 mL冰冷的 0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴20min； ? 6、 0～4℃， 4000g离心10min，弃去上清液，加入100 μL冰冷的 0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感 受态细胞悬液； ? 7、制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，如果在4℃放置 12～24h，其转化效率可以增高4～6倍；也可加入占总体积15％左右 高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于-70℃条件下， 可保存半年至一年。
CaCl2感受态细胞的制备实验步骤 1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中 37℃摇床培养过夜（约16小时）； 2 ．取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振 荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）； 3 ．将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上 操作； 4 ．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟； 5 ．4℃下3000 g冷冻离心5分钟； 6 ．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动 打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟； 7 ． 4℃下3000 g冷冻离心5分钟； 8 ．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动 打匀，使细胞重新悬浮； 9 ．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超 低温冷冻贮存备用（－70℃）。 注意事项 1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使 用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制。DH5α菌株OD600为0.5时细胞密度是5×107/ml）； 2 ．所有操作均应在无菌条件和冰上进行； 3 ．经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的 推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的 活菌数随时间延长而减少造成的）； 4 ．化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子 （如Mn 2+或Co 2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）； 5 ．所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能 大大降低细菌的转化效率； 6 ．质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA； 7 ．一定范围内，转化效率与外源DNA的浓度呈正比；
高效制备感受态
在科研实验中，为了获得纯的重组质粒DNA，需要允许外源DNA分子进入的细胞。经过一些特殊方法（电击法、CaCl2法）等处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞，即感受态细胞。 基本制备步骤 1.从37℃培养16-20 h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3 mm)，转到一个含有100 ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3 h。一般经验，1 OD600约含有大肠杆菌DH5α 109 个/mL。 2.将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中，在冰上放置10 min，使培养物冷却至0℃。 3.于4℃用Sorvall GS3特头（或与之相当的转头）以4 100 r/min离心10 min，以回收细胞。 4.倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。 5.每50 ml初始培养液用30 ml预冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。 6.于4℃用Sorvall GS3转头（或与之相当的转头）以41 00 r/min离心10 min，以回收细胞。 7.倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。 8.每50 ml初始培养物用2 ml用冰预冷的0.1 mol/L CaCl2(或TFB)重悬每份细胞沉淀。 9.此时，可以用新鲜制备的感受态细胞直接做转化实验，也可以将细
胞冻存于- 70
℃。 洁净是最重要的~ 无菌都无所谓，在操作台上可正常操作。离心力要注意不要超过2500g,建议1500-2000g 5min。 涂板要注意，不要觉得不匀而多次反复。 轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴2小时以上的板。涂完后建议空气晾干（20-30分钟）这样会减少卫星菌落出现。 预冷是必要的。 整个过程的低温也并非特别重要，只要注意就行了，我在去残液时经常在室温倒置1min，对感受态效率提高有帮助，第一次多加一点缓冲液，我经常加至20ml，效果不错。 关于感受态的制备方法~ 关于大肠杆菌的感受态制备及转化的方法很多，最复杂的莫过于电转化，而最简单的则是将LB平板上的菌落直接挑入装有缓冲液的EP管冰箱即开始转化。对于做克隆工作的人而言，高而稳定的感受态可减轻不少麻烦。
TOP10 感受态细胞使用说明书
全国免费电话：400-818-1148 TOP10 感受态细胞 Cat. No. JH0102-3 保存：-80℃ 组分说明 产品简介 本产品是大肠杆菌 TOP10 菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于 DNA 的热击转化。TOP10 是一种常用于质粒克隆的菌株，其 φ80lacZΔM15 基因产物可与载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α互补，可用于蓝白斑筛选。使用 pUC19质粒检测，转化效率可达 108，适用于高效的质粒 DNA 克隆并能保证高拷贝质粒的稳定复制。 注意事项 1.转化所有步骤均在无菌条件下操作。 2.感受态细胞应在-80℃下保存，不可多次冻融和放置时间过长，以免降低感受态细胞的转化效率。 3.包装中有0.1 ng/μl 的pUC19DNA ，供对照试验使用。 操作步骤 1.取感受态细胞置于冰浴中。一次转化感受态细胞的建议用量为50-100 μl ，可以根据实际情况分装使用。 以下实验以100 μl 感受态细胞为例。 2.待感受态细胞融化后，向感受态细胞悬液中加入目的DNA （根据实际情况加入适量的DNA ，通常100 μl 感受态细胞能够被1 ng 超螺旋质粒DNA 所饱和），用移液器轻轻吹打混匀，冰浴30分钟。 3.42℃热击90秒，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3分钟。 4.向每个离心管中加入900 μl 无菌的SOC 或LB 培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃摇床，150 rpm 振荡培养45分钟使菌体复苏。 5.取100 μl 已转化的感受态细胞，加到含相应抗生素的SOC 或LB 固体琼脂培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，直至干燥，倒置平板，37℃培养12-16小时。 注意：1） 涂布用量可根据具体实验调整。若转化的DNA 总量较多，可取少量转化产物涂布平板；若转化的DNA 总量较少，可取200-300 μl 转化产物涂布平板。若预计的克隆数较少，可通过离心（4,000 rpm ，2分钟）后吸除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于平板中。 2） 新制备的固体培养基不易涂干，可将平板正置于37℃直至液体被吸收后再倒置培养。 3） 涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的转化菌落数过少，可以将剩下的菌液再涂布新培养基进行培养。 Cat. No. JH0102-3 Kit Size 10×100 μl TOP10 感受态细胞 10×100 μl Control DNA pUC19，0.1 ng/μl 10 μl
高效感受态细胞的制备
感受态细胞的制备 一、实验原理 受体细胞通过一些特殊方法（如电击法，CaCl2，MnCl2，MgCl2等化学试剂法)的处理后，使细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的状态，成为感受态细胞。 本方案介绍的方法为TSS法和KCM转化法。 二、材料及准备工作 一）材料准备
二)试剂配制 1、液体LB培养基（200ml，高压灭菌，4℃保存备用） 蛋白胨 2.0g 酵母提取物 1.0g 氯化钠（NaCl） 2.0g 2、固体LB培养基（2×100ml，高压灭菌） 蛋白胨2×1.0g 酵母提取物2×0.5g 氯化钠（NaCl）2×1.0g 琼脂粉2×1.5g 温度降低到45℃后（不烫手），取其中一瓶加入氨苄至终浓度100μg/ml（100mlLB加100μl 100mg/ml的氨苄）后铺平皿，另一瓶直接铺平皿。4℃保存备用。 3、TSS液（100ml）（有效期2周） 聚乙二醇（PEG8000）10g 终浓度10% DMSO 5ml 终浓度5%
MgCl2(1mol/L）5ml 终浓度50mmol/L LB 85ml 终浓度85% 去离子水补足100ml，0.22μm过滤器过滤后，4℃保存备用 注：聚乙二醇分子量可以为3000-8000 4、5×KCM液（10ml）（可-20℃长期保存备用） KCl（2mol/L） 2.5ml CaCl2(1mol/L) 1.5ml MgCl2(1mol/L) 2.5ml 水补足到10ml, 0.22μm过滤器过滤后，4℃保存备用（不要高压消毒） 5、氨苄青霉素（amp）（100mg/ml） 取0.5g氨苄青霉素，溶解于5ml去离子水中，0.5ml分装，-20℃ 保存备用 三）仪器设备 1、低温大容量离心机 2、恒温水浴锅 3、超净台 4、高压锅 5、37℃孵育箱 6、恒温摇床 7、制冰机 8、分光光度计
农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤及验证
农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤发布日期：2010-04-28 发布 人:technew最后更新时间:2010-04-28 浏览次数:889 一、目的及要求 了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。 二、实验原理 在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。 在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA 的一种特殊生理状态。农杆菌的感受态可用CaCl2 处理而诱导产生。将正在生长的农杆菌细胞在加入到低渗的氯化钙溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。 制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大影响。 三、实验仪器、材料和试剂 仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml 试管，50ml 离心管，1.5ml 离心管，冰浴，微量进样器及吸头。以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。 材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株 试剂： YEB液体培养基（1升）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g， MgSO4.7H2O 0.5g, pH7.0，高压灭菌； 链霉素（Sm）储液：125mg/ml 0.15 N NaCl，高压灭菌。 20mM CaCl2，高压灭菌。
四、实验步骤 1. 挑取根癌农杆菌LBA4404 单菌落于3ml 的YEB液体培养基（含Sm 125mg/l）中，28°C振荡培养过夜； 2. 取过夜培养菌液0.5ml接种于50mlYEB(Sm 125mg/l)液体培养基中，28°C振荡培养至OD600为0.5； 3. 5000rpm, 离心5min； 4. 加入10ml 0.15N NaCl，使农杆菌细胞充分悬浮，5000rpm, 离心5min； 5. 弃上清，置于冰上，加入1ml预冷的20mM CaCl2，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24小时内使用，或分装成每管200ml，液氮中速冻1 分钟，置70°C保存备用。 一．农杆菌感受态细胞的制备 二．双元载体转化农杆菌EHA105 三．杆菌转化子的鉴定 A．农杆菌转化子的PCR鉴定 B．农杆菌转化子的酶切鉴定 关键词：农杆菌感受态细胞转化子 一．农杆菌感受态细胞的制备（同大肠杆菌质粒DNA的提取），然后将其转化大肠杆菌，再提取大肠杆菌的质粒DNA进行酶切鉴定。 取-70℃保存的EHA105于含有50μg/ml链霉素平板划线，28℃培养2天。挑单 菌落接种于5ml YM（0.5g/L KH 2 PO 4 ,10 g/L Mannitol,2 g/L L-Glutamine,0.2 g/L NaCL,0.2 g/L MgSO 4,0.3 g/L Yeast extract,PH 7 .0）液体培养基中，220rpm， 28℃振荡培养18 hr 左右。将5ml菌液转接于100ml YM液体培养基中， 28℃,220rpm,振荡培养至OD 600 =0.5。转入无菌1.5ml的EP管，5000g离心5min, 去上清液。加入1ml预冷的0.1M的CaCl 2 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置20min， 4℃下，5000g离心5min，去上清。加入200μl预冷的含15%甘油的0.1M的CaCl 2溶液，轻轻悬浮。混匀后立即冻存于-80℃。 二．双元载体转化农杆菌EHA105 取1μg左右的质粒DNA加入到200μl EHA105感受态细胞中，混匀后，冰浴30min；-70℃放置10min ；取出后37℃水浴5min或42℃水浴1min；冰浴2min；加入800μl YM液体培养基,28℃，175rpm摇培3hr；取出后涂在含50μg/ml Kanamycin 的YM平板上，28℃培养到形成单菌落。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化（原理） 感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。 1、感受态细胞的概念 所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。 制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。 2、转化的概念及原理 在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。
它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。 受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），该法最先是由Cohen 于1972年发现的。其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase（DNA酶）的羟基--钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值。被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。 Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×106--2×107转化子/质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。如在Ca2+的基础上，联合其它的二价金属离子（如Mn2+、Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100--1000倍。 化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70℃保存，因此被广泛用于外源基因的转化。
实验七 感受态细胞的制备和重组质粒的转化
实验七感受态细胞的制备和重组质粒的转化 【实验目的】 1.掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。 2.学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。 【实验原理】 质粒在不同的细菌之间转移是微生物世界中一种普遍的现象，一个细菌品系通过吸收另一个细菌品系的质粒DNA而发生了遗传性状的改变，这种现象叫做转化，获得了外源DNA的细胞称为转化子。 在基因克隆技术中，所谓转化是指质粒或重组质粒被导入受体细胞，表达相应的选择标记基因，并在一定的培养条件下，在选择性培养基上长出转化子的过程。质粒必须通过转化进入细菌细胞内，才能进行扩增和表达，从而获得大量的克隆基因,使我们能够进行进一步的DNA操作，如亚克隆等；或者获得其表达产物。转化效率的高低与受体菌的生理状态有关。细菌吸收外源DNA的能力最高时的状态被称为感受态细胞（competent cell）。有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受态，而另一些细菌只有处于某个生长时期时（一般为对数生长早、中期），才会处于感受态,如本实验所用的大肠杆菌。用一定浓度的CaCl2 处理对数生长早中期的细菌可以大大提高细菌吸收周围环境中的DNA分子的能力。对这种现象的一种解释是CaCl2能使细菌细胞壁的通透性增强，从而提高转化率。这种转化方法称为“化学法”。目前还可以使用电激的方法，通过瞬间的高压电流，在细胞上形成孔洞，使外源DNA进入胞内，从而实现细胞的转化。电激转化的效率往往比化学法高出1到2个数量级，达到1 x 108转化子/μg DNA，甚至1 x 109转化子/μg DNA，所以常用于文库构建时的转化或遗传筛选。 微生物转化是基因工程的常用技术，大肠杆菌是基因工程中最常用的受体菌，本实验即是用前面实验获得的重组质粒转化大肠杆菌细胞。 【试剂与器材】 〈一〉试剂 1．LB液体培养基: 参见附录 每组配200mL, 其中100mL分装于500mL三角瓶中，另各取3mL装于2只大试管中，其余装于装于500mL三角瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。 2．LB/Amp/IPTG/X-Gal平板（1）: 配1L LB液体培养基，加入20g琼脂粉和1支搅拌棒，同上高压灭菌，趁热取出置搅拌器上冷却，待冷至55℃左右, 加氨苄青霉素(Ampicillin)至终浓度100μg/ml (Amp储存液一般为100mg/mL), 倒平板，每皿倒约15 mL，室温放置过夜至冷凝水挥发干净。使用前半小时在培养基表面加20μL 50mg/mL X-gal 和100μL 0.1mol/L IPTG，涂匀，待这两种化合物渗入琼脂后，即可用于转化菌的涂布。 每组制备LB平板2个，LB/Amp 平板5个，LB/Amp/IPTG/X-Gal平板6个。 3．IPTG储存液(0.1mol/L)：1.2g IPTG加水至50ml，过滤除菌，4℃储存。 4．X-gal储存液：50mg/ml溶于二甲基甲酰胺溶剂中，过滤除菌，4℃储存。 5．1 mol/L CaCl2储存液，使用浓度为0.1mol/L，CaCl2应使用分析纯，配100mL，高压灭菌，全班用。6．甘油(灭菌)，全班50mL，同上高压灭菌。 7．酸洗无菌玻璃珠，涂布平板用，用50mL三角瓶分装，同上高压灭菌，烘干备用。 〈二〉器材 1. 37℃温箱、水浴锅、恒温振荡器等 2. 高速冷冻离心机 3. 微量移液器等
感受态细胞制备及各种感受态的特点
感受态细胞制备及各种 感受态的特点 Company Document number：WUUT-WUUY-WBBGB-BWYTT-1982GT
感受态细胞制备制备感受态常用的方法是电击法和CaCl2制备法，以下介绍CaCl2制备法： 1、可以从-80℃冰柜中，取出一支冻存菌株，于事先照过紫外的超净台中，用无菌的接种环轻轻蘸取菌种后，在无抗平板（由于Rocetta含有氯霉素抗性，需要涂布在氯霉素抗性的平板，后面的都是如此）上划线，并将菌种迅速放回-80℃保存，在划线板上做好相应标记，于37℃培养过夜。 2、从37℃培养过夜的新鲜平板上挑取一个单克隆，接种于2mlEP管中，37℃， 220rpm震荡培养约6个小时至对数生长中后期；将该菌悬液以1:100的比例接种于 50ml LB液体培养基（2瓶）中,37℃振荡培养小时至OD600=。 注意：接种比例不得大于1:10。 3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、预冷的离心管（50ml）中，在冰上放置 5~10min； 注意：划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板和多接一根试管，划板、接种、转接均要严格按照无菌操作。 4、4℃ 5000g离心5分钟。用预冷的去离子水洗涤沉淀，4℃ 5000g离心5分钟；Note：此步主要是为了洗去培养基中的盐等 5、沉淀加入2ml预冷的L CaCl2-15%甘油混合溶液，轻吹散，冰浴5分钟，4℃5000g 离心5分钟； 6、沉淀加入2ml预冷的L CaCl2-15%甘油混合溶液，轻吹散，即成为感受态细胞悬液。分装成50~100μl的小份，贮存于-70℃可保存半年。 含15%甘油的L CaCl2制备方法: 称取 CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。
感受态细胞的制备步骤和原理
感受态细胞的制备步骤和原理 实验目的 为了获得大量的质粒作为克隆载体，我们需要将购买来的质粒通过转化的方法导入细菌的细胞内。制备出感受态的细胞，我们就可以方便的将需克隆的质粒导入其中，使其繁殖，就能获得大量质粒。本次实验的目的就是增加质粒的数量。同时，我们能掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的基本原理和实验技术方法。 实验原理及过程 实验步骤 1挑取一个JM109单菌落于3ml LB(无抗生素)培养基中，37℃，180rpm培养过夜。 [让菌复苏，进入对数期的早中期。此时更容易制得感受态细胞。] 2取0.4mL过夜培养物加入到40mL LB(无抗生素)培养基中，37℃250rpm大约2.5小时。 [减少达到所需亮的均所需繁殖的世代数，以减少菌的变 GAGGAGAGGAFFFFAFAF
异。] 3取培养物置于40mL的灭菌离心管中，冰浴10min，4000rpm 4℃离心10min，弃上清。（将所有上清倒光，可以将离心管倒过来） [使细菌的生长停止，代谢减慢。因为这时已经没有培养基了，如果细菌仍有很高的代谢效率，则有大量细菌死亡。] 4菌体重悬于10mL 100mmol/L冰冷CaCl2中，轻吹，4℃30min，4000rpm离心5min弃上清。 [ 细菌处于0度，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面（羟基来源于细胞壁上的糖，磷酸来源于DNA），经短时间420C热激处理，促进细胞吸收DNA复合物。（一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱）] 5菌体重悬于1mL 100mmol/L冰冷的CaCl2中，轻吹，用于转化。 [除去所有的LB以及细胞破损后释放出来的细胞内含物。防止细胞分裂，以致大量细胞死亡。（一定要轻吹，这时细 胞壁打开，十分脆弱）] GAGGAGAGGAFFFFAFAF
CaCl2法制备感受态细胞知识讲解
C a C l2法制备感受态 细胞
大肠杆菌感受态细胞的CaCl2法制备及质粒转化 实验原理 处于对数生长期的细菌经CaCl2 处理后接受外源DNA的能力显著增加。细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。 在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态，以摄取外源DNA。 转化（Transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（R-,M-），它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2 ，RbCl(KCl)等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Compenent cells）。进入受体细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA 分子的受体细胞）。目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备
出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存（半年），因此CaCl2法使用更广泛。 主要试剂 (1)0.1mol/L CaCl2溶液 (2)LB液体培养基 (3)30%甘油：30mL甘油溶于100mL蒸馏水，高压灭菌。 主要设备 (1)超净工作台 (2)冷冻离心机 (3)恒温摇床 (4)－70℃冰箱 (5)10mL移液管 (6)吸耳球 (7)1mL、200μL移液枪（配套枪头） (8)50mL 离心管 (9)1.5mL离心管 实验材料 (1)大肠杆菌DH5α（R-，M-，Amp-） 实验步骤 （一）受体菌的培养
感受态细胞的制备步骤和原理
感受态细胞的制备步骤和原理 实验目的为了获得大量的质粒作为克隆载体，我们需要将购买来的质粒通过转化的方法导入细菌的细 胞内。制备出感受态的细胞，我们就可以方便的将需克隆的质粒导入其中，使其繁殖，就能 获得大量质粒。本次实验的目的就是增加质粒的数量。同时，我们能掌握大肠杆菌感受态细 胞的制备及转化的基本原理和实验技术方法。实验原理及过程实验步骤 1挑取一个JM109单菌落于3ml LB（无抗生素）培养基中，37C, 180rpm培养过夜。［让菌复苏， 进入对数期的早中期。此时更容易制得感受态细胞。］ 2取0.4mL过夜培养物加入到40mL LB（无抗生素）培养基中，37C 250rpm大约2.5小时。 ［减少达到所需亮的均所需繁殖的世代数，以减少菌的变异。］ 3取培养物置于40m L的灭菌离心管中，冰浴10min , 4000rpm 4C离心10min，弃上清。（将所 有上清倒光，可以将离心管倒过来） ［使细菌的生长停止，代谢减慢。因为这时已经没有培养基了，如果细菌仍有很高的代谢效率，则有大量细菌死亡。］ 4菌体重悬于10mL 100mmol/L 冰冷CaCl2中，轻吹，4 C 30min , 4000rpm离心5min弃上 ［细菌处于0度，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，外源DNA形成抗DNA酶的羟基 -钙磷 酸盐混合物黏附于细胞表面（羟基来源于细胞壁上的糖，磷酸来源于DNA ）,经短时 间420C热激处理，促进细胞吸收DNA复合物。（一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱）］ 5 菌体重悬于1mL 100mmol/L冰冷的CaCl2中，轻吹，用于转化。 ［除去所有的LB以及细胞破损后释放出来的细胞内含物。防止细胞分裂，以致大量细胞死亡。 （一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱）］ 6取感受态细胞100uL,加入2uLpET-21a质粒，冰浴30 min受体菌：感受态细胞100uL, 加入2 uL 无菌双蒸水阴性对照：0.1mol/LCaCl2溶液100uL,加入2 uL阴性对照 ［第一个阴性对照是为了验证LB中的抗生素有活性；第二个阴性对照是为了验证CaCl2溶 液和pET-21a质粒未被污染。］［冰浴是为了降低细胞代谢率，防止细胞大量死亡。］ 7热激42度，90s 【在低温处理后，热激，可以使细胞壁热胀冷缩，再低温，使细胞壁上黏附的质粒进入细胞体内。】8冰浴2 min 9加入800 uL无抗生素的LB, 37 C复苏1h 【用LB复苏细胞，使细胞恢复活力，从而使细胞中的质粒表达抗抗生素的基因，只有这样才能使 转化成功的细菌在有抗生素的LB平板上生长。】 10取100ul细胞直接在含50ug/mL Carbenicillin（短节西林）的LB培养基上铺平板，将平皿放置 37 oC温箱30min至液体被吸收。倒置平皿37 oC培养过夜，出现菌落。 【这些菌落为转化成功的菌落，而对照组应该没有菌落。在目的菌落的旁边有可能出现卫星菌落，这是因为亩的菌落的抗性基因似的菌落周围的抗生素失效，长出了转化为成功的菌 落。用短节西林因其对酸稳定、不易被细菌降解，所以可以降低卫星菌落的数量。 因为抗生素高温易失活，所以应等到LB600C时（热而不烫），加入抗生素。】