细胞培养试验报告

细胞培养实验报告

一、试验准备

1、试验目的

学习细胞培养，熟悉细胞培养的操作。

2、细胞种类

人体成纤维细胞——HDF，第21代

3、实验人员

朱宏历、俞鸿飞（指导）、董溪溪（指导）

4、参照方法

刘苹《细胞培养技术》2015版PPT

5、试验设备

细胞房、离心机、超净台、4℃冰箱、-20℃冰箱、-80℃冰箱、液氮罐、冻存架、带CCD摄像功能的倒置显微镜、程序降温盒、倒置显微镜（细胞房内）、1-1000ul 移液器、恒温水浴锅、电动大容量移液器、二氧化碳培养箱、酒精灯、打火机、细号记号笔、酒精消毒剂喷洒器、定时报警器。

6、试验耗材

75%酒精消毒剂、分析纯异丙醇、50ml离心管（无菌分装用）、15ml离心管、2ml 移液器吸嘴、5ml巴氏吸管、一次性培养瓶、10ml一次性塑料移液管、1.5ml冻存管、口罩、鞋套、医用帽（或连体洁净工作服）、灭菌乳胶手套（无粉）

7、试验用培养液

全培养液：90%DMEM（基础培养液）+ 10%FBS（胎牛血清）

冻存液：90%FBS（胎牛血清）+ 10%DMSO（二甲基亚砜）

消化液：Trypsin - EDTA（胰蛋白酶0.25% - EDTA 0.2%消化液）

二、试验步骤

前一天从-20℃冰箱中取出已冻存的FBS及DMEM置于4℃冰箱之中。

DAY1——细胞复苏

1. 酒精喷洒操作台面，取出大容量电动移液器、1个10ml一次性移液管、1把5ml巴氏吸管，1盒2ml移液器吸嘴,1个15ml离心管，2个50ml离心管，1个培养瓶用酒精喷洒消毒后置于操作台面右侧。

1. 分装培养液

点燃酒精灯，取出大容量电动移液器和10ml一次性移液管，另准备2个50ml 离心管，离心管开盖过火后，以9：1的比例，从FBS离心管中吸5ml至离心管，再吸45mlDMEM培养液至离心管。共准备2管备用。完成后，将原DMEM培养液重新置于-20℃冰箱中冻存。

2. 细胞复苏

从液氮罐中取出冻存架，搁于罐口，待液氮流尽后置地。取出HDF细胞冻存管置于37℃恒温水浴锅内解冻约1分钟，观察无冰结晶存在后，立即进细胞房，取15ml离心管过火开盖，取2ml全培养液置于离心管中，再将冻存管过火开盖，吸出细胞冻存液后置于15ml离心管内，而后全部过火盒盖。

离心管置于离心机内，离心机设定1000转，1分钟。离心完成后取出，重新酒精喷洒消毒后置于超净台内，过火开盖，用5ml巴氏吸管吸去上清液后，换根巴氏吸管加约2ml全培养液，并不断吹吸制成细胞悬液。

3. 细胞培养

将培养瓶过火开盖，取10ml全培养液置于培养瓶中，再将15ml离心管内细胞悬液吸至培养瓶中，过火盒盖。并前后摇晃30秒，左后摇晃30秒。将其置于二氧化碳培养箱中，二氧化碳浓度设定为5%，温度设定37℃，观察纯水托盘中是否有水。全培养液的离心管置于4℃冰箱。

DAY2——换液

4. 细胞换液

24小时后，于倒置显微镜中观察细胞贴壁情况，若贴壁完好，说明细胞复苏成功。

取2支巴氏吸管和全培养液的离心管，酒精消毒后置于超净台内。点燃酒精灯，

于超净台内将培养瓶、全培养液的离心管过火开盖，吸去旧培养液，换巴氏吸管吸约10ml新鲜培养液，置于培养瓶中。全过火盖瓶后，培养瓶继续置于二氧化碳培养箱内培养，全培养液的离心管置于4℃冰箱。

DAY3——细胞冻存

5. 细胞消化

取分装FBS的50ml离心管，分装全培养液的50ml离心管，1把巴氏吸管，Trypsin消化液，酒精灯，1-1000ul精密移液器、1盒吸嘴用酒精喷洒器消毒后置于超净台内。从二氧化碳培养箱内取出培养瓶，用倒置显微镜观察细胞生长情况，生长覆盖面积达70-80%时可开始消化。

点燃酒精灯，Trypsin消化液和培养瓶过火开盖，取5ml巴氏吸管从培养瓶内吸去旧的全培养液，并加5ml的Trypsin消化液。过火盖上后，置于二氧化碳培养箱内定时培养1分钟。这1分钟内，将消化液过火上盖，并将全培养液过火开盖。1分钟过后，将培养瓶从培养箱拿出，快速过火开盖后，加入约5ml全培养液终止消化

6. 细胞传代

吸去有消化液培养液。将FBS离心管过火开盖后，换巴氏吸管吸取3ml的FBS，加入培养瓶中。并用巴氏吸管吸FBS反复吹打培养瓶，然后取3个1.5ml

冻存管，分析纯DMSO用酒精消毒后过火开盖，将培养瓶内3ml细胞悬液分装于3个冻存管中，每个冻存管分别再添加100ul的DMSO，制成细胞冻存液。并全部过火合盖。

7. 细胞冻存

将细胞冻存管置于程序降温盒内，程序降温盒底层添加200ml分析纯异丙醇，并置于-80℃冰箱内过夜。于第二天移入液氮罐中。