一抗的选择

一抗的选择

检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择，为缩小抗体的选择范围选中合适的抗体，需要考虑如下几种因素：

分析试验应用的类型l

样本蛋白的结构性质l

样本的种属l

抗体宿主的种类l

抗体的标记和检测l

1.分析试验应用的类型

一般抗体说明书都列出该抗体经试验验证过适用于何种分析类型，如：可以应用于WB IHC ICC ELASA分析等，如果抗体说明书没有提及的应用类型，并不意味着该抗体不适用于此种分析应用类型，而仅是说明尚未经过此种分析试验验证，如果抗体不适用某些分析试验，则会在抗体说明书上标注出来不适于某分析试验。

2.样本蛋白的结构性质

了解样本蛋白的结构性质有助于选择最合适的抗体，至少两方面因素需要考虑

待测样本蛋白的结构域：抗体是由各种不同免疫原免疫宿主而制备得来，其中的免疫原包括：全长蛋白、蛋白片断、多肽、全有机体（如：细菌）或细胞，抗体说明书一般都有免疫原的描述，如果打算检测的是蛋白片断或一种特殊的同型物或蛋白全长的某一区域，则必须选择用含此片段域的免疫原制备出的抗体。如果打算用FACS流式检测活细胞的表面蛋白，则需要选择含该表面蛋白的胞外域来免疫制备的抗体。l

样本的提取或处理过程：某些抗体要求样本经过某些特殊处理，例如：许多抗体只识别还原和变性的、表位已暴露不受二级四级结构阻碍的蛋白样本，另一方面，某些抗体仅识别天然折叠状态的蛋白。当选择免疫组化的抗体时，应注意某些抗体只识别未固定的冷冻的组织，而另一些抗体则适用于无需抗原修复解交联步聚的甲醛固定石蜡包埋的组织，这些都会在抗体说明书上应用部分标示出来l

3.样本的物种

应选择物种相同或有交叉反应的抗体，抗体可能与不同物种的同种靶蛋白有交叉反应，因其氨基酸序列同源性较高，如果样本的种类未列入抗体说明书上的交叉反应种属表中，并不意味着该抗体不适用于检测该物种的蛋白，而只是表示该物种尚未用此抗体检测验证过，应通过序列比对的方法来预测交叉反应，可应用Expasy 和NCBI BLAST来进行不同物种蛋白同源性比对。

4.一抗宿主物种的选择

一般说来，在使用偶联二抗结合无偶联物的一抗时，一抗宿主动物的物种选择较为重要，对于免疫组化而言，尽可能选择与样本不同种系物种的一抗，从而避免二抗与样本内源性免疫球蛋白产生交叉反应，例如：检测小鼠样本蛋白，则不应选择小鼠或大鼠源的一抗，最好选兔源的一抗，则二抗则可选择偶联了检测分子（酶、荧光素、生物素等）的抗兔IgG。如果选择有偶联物的一抗则不适用上述情况，除免疫组化外的其它对不含内源性免疫球蛋白样本的检测方法，则抗体宿主物种的影响不大，如对不含IgG的细胞裂解物样本的western blotting 检测，尽管如此，含有血清的组织裂解物和组织培养上清中含有免疫球蛋白，还原变性样本中含IgG，在western blot检测中则结合出现IgG分子50 and 25 kDa的重链和轻链条带。

如何选择二抗——根据一抗种属及类型选择合适的二抗

广义上是指专门和进行特异性反应和结合的抗体，在免疫学反应中，经常需要针对试验选择不同的二抗，艾美捷能为您的科研工作提供最适合和最全面的二抗产品。检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择，同时在后继试验中也会有不同的检测方案，因此在选择二抗的时候要综合考虑一抗的类型及后继检测方案的要求，一般来说，选择合适的二抗需要从下面几个方面考虑：

【一抗的种属来源】

二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源，例如：如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗则选抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）；如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体，则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。即根据一抗的物种来源选择相应的抗该物种的二抗。艾美捷能为您提供最全的抗不同种属的原装进口二抗，包括抗小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、人、豚鼠、猪、马、牛、鸡、鸭等二抗。

【一抗的类别亚型】

二抗需与一抗的类别或亚类相匹配。这通常是针对单克隆抗体而言。多克隆抗体主要是IgG 类免疫球蛋白，因此相应的二抗就是抗IgG抗体。其中单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品说明书中都会有描述，如果你的一抗是小鼠IgM，那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM。如果单克隆一抗是小鼠IgG的某一亚类（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合，或者你也可以选择专门针对这一亚类的二抗，例如，如果你的一抗是小鼠IgG1，那么你可以选择抗IgG1的二抗，此种抗体在双标记实验中尤其适合。在不清楚一抗为何种类/亚类的情况下，可以选用抗相应物种IgG。艾美捷能为您提供通用的IgG（H+L）二抗，或者特异性只结合IgM的Anti IgM （mu）Antibody、IgA的Anti IgA （alpha-Antibody、IgE的Anti IgE （epsilon）Antibody等。

【二抗的种属来源】

一般来说，不同的种属来源与二抗的质量没有必然的联系，来源于山羊的二抗与来源于驴的二抗在一般的实验里没有太多的差别。然而在一些特殊的实验里，如双标实验里，如果其中一个一抗是山羊来源的，一个是小鼠来源的，则相应的二抗分别要抗山羊和抗小鼠的二抗，这时候，二抗就不能选择山羊或者小鼠来源的。有相应的驴来源的二抗，非常适合做类似双标的免疫实验。

【二抗的耦联标记】

一般来讲，耦联到二抗上的探针主要有酶（辣根过氧化酶HRP和碱性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP），荧光基团（FITC、Rhodamine、Texas Red、PE、Rhodamine、Dylight 等）、生物素、金颗粒。选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。对于Western Blot和ELISA，最常用的二抗是酶标二抗；而细胞或组织标记实验（细胞免疫化学，组织免疫化学，流式细胞术）中通常使用荧光基团标记的二抗，免疫组化中也可以使用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记的二抗。如果想要更大程度的放大检测信号，可以使用Biotin/Avidin检测系统。在一些荧光检测方案中，则需要选择不同的荧光标记；而金颗粒标记的二抗则更多的应用于免疫电镜中。艾美捷能为您提供上述所有不同类型标记的二抗。

【是否经过血清吸附过的二抗】

为减少二抗与样本的非特异性结合，艾美捷还能为您提供不同血清吸附的原装进口二抗。如您的检测样本是人源的蛋白，一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗就需要选择抗小鼠源的二抗，如果您对实验的特异性要求很高，那我们向您推荐经过人血清吸附过的抗小鼠源的二抗，这种二抗由于经过人血清吸附而排除了与人源组织（如IgG等）可能发生非特异性反应的IgG，

因此将非特异性结合降低到最低。

【Anti-IgG还是Anti-IgG, F（ab’）2 fragment】

在一些如胸腺、脾脏、血液的组织以及造血细胞、淋巴细胞、B细胞等细胞内，通常含有较多的Fc受体，这时候选择二抗时最好选择Anti-IgG, F（ab’）2 fragment这样的特异性二抗，这样就消除了由于Fc部分与IgG的非特异性结合。常规的Anti-IgG （H+L）二抗与IgG的重链和轻链都有结合反应，即与IgG的Fc的F（ab’）2片段都能结合；由于IgG、IgM、IgA 都有保守的轻链结构域，因此Anti-IgG （H+L）与它们都有交叉反应。而Anti-IgG, F（ab’）2 fragment经过了IgG Fc片段的吸附，因此只与IgG的F（ab’）2片段结合，然而IgG、IgM、IgA都有保守的轻链结构域，因此与它们也有交叉反应。

【Anti-IgG（H+L）、Anti-IgG （gamma）、Anti-IgM （mu）、Anti-IgA （alpha）】

在一些特殊的实验里，只需要检测样本里的IgG或者IgM，常规的Anti-IgG （H+L）由于与IgG的重链和轻链都有结合反应，而IgG、IgM、IgA都有保守的轻链结构域，因此不能特异性的检测某种类型的IgG或者IgM。这时候就需要针对特殊类型Ig分子的二抗。艾美捷备有全面的二抗现货产品并能提供最完整的二抗产品线。主要二抗品牌为全球最大的二抗产品以及前沿抗体生产商EarthOx。按照标记分，有HRP、AP、生物素等标记二抗，FITC、TRITC、Rhodamine、Cy3/5、Dylight等荧光二抗；按照检测物种分，有抗人、大鼠、小鼠、猪、驴、绵羊、山羊、小鸡、马、兔、仓鼠、狗、牛，以及多种细菌类二抗；另外，还有IgG、IgA、IgM以及IgG（Fc）、IgG（ab’）2等不同类型抗体。

如抗原为A C物质，产生的抗体为抗-ac，

如抗原为B C物质，产生的抗体为抗-bc，

AC物质和抗-ac、BC物质和抗-bc产生的是特异性结合，

而AC物质和抗-bc、BC物质和抗-ac就会产生交叉反应.

什么是抗体的交叉反应性呢

看到有的抗体是小鼠来源的，但是跟人，大鼠，兔和猴子都有交叉反应性，什么是抗体的交叉反应性呢？这样的抗体可以用于人来源的细胞做western blot实验吗？

抗原分子表面存在着能与抗体相互作用的部位即抗原决定簇,一种抗原物质可以有两个或更多的决定簇。研究表明,抗体是从抗原决定簇的立体结构而不是从抗原的全面分子排列来“认识”抗原的。这样,有时一种抗体可以与分子结构并不完全相同但具有类似抗原决定簇的不同抗原起反应,这称为交叉反应。如果你的抗体和其它种属有交叉反应，理论上可以用于人源的WB。

哦，那如果厂家的产品说明上交叉反应性一栏里写着人，大鼠，兔，猴，但是抗体来源是小鼠，是不是也就是说，这种抗体可以用于来源于人，大鼠，兔，猴的组织或者细胞的WB?可是为什么，买抗体的时候还要注意它的种属和来源呢，我对这个搞不清楚，希望指点，谢谢！

所谓抗原和抗体的特异性结合其实也是相对的，抗原和抗体结合也就是十几到二十几个氨基酸，理论上在其他的蛋白中也可能存在同样或者相似的序列。

其次至于抗体为什么能和不同种属同一个分子反应，那是因为有一部分蛋白在机体发挥较为重要的作用，因此可能在低等动物就存在，因此该分子的氨基酸序列存在较为严格的保守性，也就是同样的分子在不同种属的序列是相同或者相似的，比如VEGF等。所以就出现免疫的时候是用人的抗原，但是后来产生的抗体可以和其他很多动物种属反应。

楼主说的买抗体的时候为什么要注意种属来源，这个和你的实验目的有关，比如有的人同时要做人体试验和某个动物的实验，比如大鼠，那么就希望买的抗体可以同时针对人和大鼠，这样就可以节约资源。相反如果有人只做一个种属的试验，那么可能就希望抗体的特异性更

高点，那么就和其他种属的交叉反应越少越好。

至于抗体本身的来源，主要和你下游试验有关，也就是二抗和显色有关。