天然药物化学实验完整版
天然药物化学实验 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】
实验一天然产物化学成分系统预试验
天然产物中所含的化学成分种类很多，在深入研究之前应首先了解其中含有哪些类型的化学成分，如生物碱、皂苷、黄酮类等等。这就需要进行各类化学成分的系统定性预试验。或根据研究的需要进行单项预试法来初步判断。
一、实验目的与要求
掌握未知成分的天然产物是怎样初步提取分离的，熟悉各主要成分的试管试验、沉淀反应和纸层析、薄层层析的方法并根据试验结果判断含有什么类型的化学成分。
二、基本原理
利用各类成分的颜色反应和沉淀反应，对天然产物的提取液进行检查可以初步判断其中的化学成分。由于提取液大多数颜色较深，影响对颜色变化的观察，可以使用薄层层析（TLC）或纸层析（PC）等方法对天然产物的提取液进行初步分离，再进一步检查。
三、实验内容：
利用不同成分在各种溶剂中的溶解度的不同，一般可采用以下3种溶剂分别提取，试验。
1．水浸液：取中草药粗粉5 g加水60 ml，在50~60℃的水浴上加热1小时，过滤，滤液进行下列试验。
*在试管进行，△在滤纸或硅胶CMC-Na薄层板上进行，下同。
糖鉴定
（1）α-萘酚一硫酸试剂检查还原糖。
①溶液I：10％α-萘酚乙醇溶液。溶液II：硫酸。取1ml样品的稀乙醇溶液或水溶液，加入溶液I 2滴～3滴，混匀，沿试管壁缓缓加入少量溶液II，二液面交界处产生紫红色环为阳性反应。
（2）斐林试剂检查还原糖。
溶液I：6．93g结晶硫酸铜溶于100ml水中。溶液II：34．6g酒石酸钾钠、10g氢氧化钠溶于100ml水中。取1ml样品热水提取液，加入4滴～5滴用时配制的溶液I、II等量混合液，在沸水浴中加热数分钟，产生砖红色沉淀为阳性反应。如检查多糖和苷，取1ml样品水提液，加入1m110% 盐酸溶液，在沸水浴上加热10min，过滤，（成盐去除杂质）再用10％氢氧化钠溶液调至中性，按上述方法检查还原糖。
或者直接用高效液相色谱看色谱图。
酚类鉴定试剂
（1）三氯化铁试剂检查酚类化合物、鞣质1％～5％三氯化铁水溶液或乙醇溶液，加盐酸酸化。取1ml样品的乙醇溶液，加入试剂1滴～2滴，显绿、蓝绿或暗紫色为阳性反应。作色谱显色剂用，喷洒后，显绿或兰色斑点为阳性。
2．乙醇提取液
取中草药粗粉5 g，加5~12倍量95%乙醇，在水浴上加热回流提取1小时，过滤，滤液留2 ml作（1）项试验，其余回收乙醇至无醇味，并浓缩成浸膏状，浸膏分为二部分，一部分加少量2% HCL振摇溶过滤。分出酸液，作（2）项式验，附于滤纸上的一部分再以少量乙醇溶解，溶液作（3）项试验；另一部分浸膏以少量乙酸乙酯溶解，溶液置分液漏斗中加适量5% NaOH振摇，使酚性物质及有机酸等转入下层氢氧化钠水溶液中，剩下的乙酸乙酯为中性部分，用蒸馏水洗去碱性即可备用，将乙酸乙酯液2~3 ml，在水浴上蒸干，以1~2 ml乙醇溶解作（4）项试验。
3、石油醚提取液
取中草药粗粉1 g，加10 ml石油醚（沸程60~90℃），放置2~3小时，过滤，滤液置表面皿上任其挥发，残留物进行下列试验：
黄酮类鉴定试剂
（1）盐酸-镁粉试剂检查黄酮（醇）、二氢黄酮（醇）类化合物。
取1ml样品的乙醇溶液，加入数毫克镁粉，滴加数滴盐酸，必要时水浴上微热，显红-紫色为阳性反应。
（3）三氯化铝试剂检查具有邻二酚羟基或3-羟基、4-酮基或5-羟基、4-酮基的黄酮类化合物。
1％三氯化铝乙醇溶液或5％三氯化铝乙醇溶液。喷洒前、后将薄层板置日光下和紫外光灯下观察，呈黄色或黄绿色荧光为阳性反应也可在滤纸上或试管中进行。
（3）醋酸镁试剂检查黄酮类，二氢黄酮类化合物，及羟基蒽醌类衍生物。
1％醋酸镁甲醇溶液。在滤纸或薄层板上，点1滴样品醇溶液，挥去醇后，点1滴试剂于样品斑点边缘，加热干燥，于紫外灯下观察，黄酮类显黄色荧光，二氢黄酮类呈天蓝色荧光。显橙红色为大黄素型蒽醌，显紫色为茜草型蒽醌。
生物碱鉴定试剂
（1）改良碘化铋钾试剂
为生物碱通用显色剂。
溶液I：次硝酸铋溶于10ml冰醋酸，加水40ml。溶液II：8g碘化钾溶于20ml水中。溶液I和II等量混合，于棕色瓶中可以保存较长时间。目前市场上有碘化铋钾试剂可供直接配
制：碘化铋钾、冰醋酸10ml加水60ml。取1m1样品的稀酸溶液加1滴～2滴试剂，产生桔红色浑浊或沉淀为阳性反应。如作薄层色谱显色剂，取混合液1m1、醋酸2ml、水10ml混合即得。喷洒后呈桔红色斑点为阳性反应
（2）苦味酸试剂为生物碱通用沉淀试剂。
苦味酸1g溶于100ml水中。取1ml样品中性溶液，加入试剂1滴～2滴，产生黄色晶形沉淀。
（3）硅钨酸试剂为生物碱通用沉淀试剂。
1g硅钨酸溶于20ml水中，加10％盐酸使成pH2左右。取1ml样品的稀酸溶液，加入1滴～2滴试剂，产生白色至褐色沉淀为阳性反应。
四、药品试剂：
中药饮片每组每种8克
生物碱试剂
（1）碘化铋钾(Dragendorff)试剂：出现桔红色或黄色沉淀。
（2）苦味酸(Hager)试剂，样品液需调至中性后加试剂，出现黄色晶形沉淀。（3）硅钨酸(Bertrand)试剂：出现淡黄色或灰白色沉淀，在薄层板上应时，加热后出现黑色斑点。
酚类、鞣质试剂
1%三氯化铁水或乙醇试剂
氨基酸、蛋白质试剂
茚三酮(Ninnydrin)试剂
糖、多糖和苷试剂
（1）α-萘酚试剂、Molish试剂
（2）菲林氏反应(Fehling试剂)：
溶液Ⅰ：克结晶硫酸铜溶于1000毫升水中。
溶液Ⅱ：349克洒石酸钾钠及氢氧化钠100克，溶于1000毫升水中。
皂苷试剂
浓硫酸试剂
黄酮类试剂
盐酸——镁粉反应
醋酸镁反应
1%三氯化铝乙醇液
香豆素试剂
1%三氯化铁水溶液
Gibb氏反应：4-氨基安替比林-铁氰化钾(Emerson)
4、玻璃仪器：（每2人或3人一组，每组一套）
(1) 试管10个，滴管2个，玻棒1支
（2）100ml圆底烧瓶一个，250ml圆底烧瓶一个，25cm球型或蛇型冷凝管一个，有机溶剂蒸馏回收装置1套，50ml烧杯3个，25ml具塞锥形瓶，
（3）有孔白瓷板1个
（4）滤纸，乳胶管、药勺
仪器：
（1）普通天平，（2）分析天平，（4）电水浴锅
五、思考题
实验学时：9学时
实验二芦丁的提取、分离及鉴定
一、目的要求
1．以芦丁为实例学习黄酮类成分的提取分离方法。
2．掌握用黄酮苷水解制取黄酮苷元的方法。
3．了解黄酮类化合物的一般性质。
二、基本原理
槐米系豆科属植物槐树SopHora japonica. L.的花蕾，历来作为止血药，治疗痔疮、子宫出血、吐血、鼻出血，并有清肝泻火，治疗肝热目赤，头痛眩晕的功能。其主要化学成分为芸香苷（芦丁），含量高达12％～20％，芸香苷广泛存在于植物中，现已发现含有芸香苷的植物高达70种以上，尤以槐米和乔麦中含量最高。药理实验证明芸香苷有调节毛细血管渗透作用，临床上用作毛细血管性止血药，常作为高血压症的辅助用药。 槐米中主要成分的物理性质
1．芸香苷（芦丁， rutin ）：O H O H C 21630273?，淡黄色针状结晶，mpl74℃～178℃，无水物为188℃～190℃。溶解度：冷水中1：8000，热水中l ：200，冷乙醇中1：300，热乙醇中1：30，冷吡啶中1：12，微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、氯仿、石油醚等溶剂。易溶于碱液，呈黄色，酸化后又析出，可溶于硫酸和盐酸，呈棕黄色，加水稀释又析出。UV nm EtOH max λ：259，299sh ，359。
2．槲皮素（quercetin ）：O H O H C 2710152?，黄色结晶，mp313℃～314℃，无水物为316℃。溶解度：冷乙醇中1：290，沸乙醇中1：23，可溶于甲醇、乙酸乙酯、吡啶、丙酮等溶剂，不溶于水、乙醚、苯、氯仿、石油醚。 UV nm EtOH max λ：255，269sh ，301sh ， 370。
芸香苷（芦丁， rutin ）
1．芸香苷分子中具有酚羟基，显弱酸性，在碱水中成盐增大溶解能力，用碱水为溶剂煮沸提取，提取液加酸酸化后又成为游离的芸香苷而析出。并利用芸香苷对冷水和热水的溶解度相差悬殊的特性进行精制。
2．黄酮苷可通过酸水解得到苷元和糖，并可通过薄层色谱法和纸色谱法进行检识。 3．利用黄酮类化合物对紫外光有特定吸收的特征进行结构测定；也可制备乙酰化物进行结构鉴定。
三、实验内容
1自槐花米中提取芦丁： (1)．提取方法：
称取槐花米粗粉20g （压碎），加沸水300m1，加热煮沸30min ，四层纱布趁热过滤，残渣同法再操作一次，合并两次滤液，放置冰箱中析晶，待全部析出后，减压抽滤，用蒸馏水洗涤芸香苷结晶，抽干，得粗制芸香苷，置空气中干燥后，称重。
(2)．重结晶方法：
取粗芦丁2 g，加去离子水或蒸馏水400 ml，加热煮沸，趁热抽滤，放置过夜析晶
（或放冷析晶），抽滤，得精制芦丁。
记录：粗芦丁得率多少？精制芦丁得率多少？熔点？
2. 芦丁的水解：
取芦丁1 g，加2% H2SO4 80 ml，小火加热微沸回流30分钟至1小时。开始加热10分钟为澄清溶液，逐渐析出黄色小针状结晶，即槲皮素，抽滤取结晶（保留滤液20毫升，以检查其中所含单糖），沉淀物为芸香苷苷元（槲皮素），用蒸馏水洗至中性，抽干水分，晾干，称量。得粗制槲皮素，再用乙醇重结晶得精制槲皮素。
加50%乙醇（按1克90 ml量）加热回流使槲皮素粗晶溶解，趁热抽滤，放置析晶，抽滤得精制品，在减压下110℃干燥可得槲皮素无水物。测熔点，进行薄层层析鉴定。
取芸香苷水解后的滤液20m1，加饱和氢氧化钡溶液中和至中性（搅拌下进行），滤去白色的硫酸钡沉淀，滤液浓缩至2ml～3ml或蒸于后，加2ml～3 ml乙醇溶解，作为糖的供试液。
3. 鉴定
呈色反应
取芸香苷及槲皮素精品约10mg，各用5 ml乙醇溶解，制成样品溶液，按下列方法进行试
验，比较苷元和苷的反应情况。
（1）Molish反应取样品溶液1ml，加10O% α一萘酚溶液1ml，振摇后斜置试管，沿管壁滴
加 ml硫酸，静置，观察并记录液面交界处颜色变化。
（2）盐酸一镁粉反应芸香苷与槲皮素溶液分别置于两试管中，加入金属镁粉少许，盐酸2
滴～3滴，观察并记录颜色变化。
（3）醋酸镁纸片反应取两张滤纸条，分别滴两滴芸香苷、槲皮素的乙醇溶液，然后各加
1％醋酸镁甲醇溶液两滴，于紫外光灯下观察荧光变化，记录现象。
（4）利三氯化铝纸片反应在两张滤纸条上分别滴加芸香苷、槲皮素醇溶液后，各加1％三
氯化铝乙醇溶液两滴，于紫外光灯下观察荧光变化，记录现象。
（5）锆一柠檬酸反应取样品溶液 2 ml，加 2% 二氯氧锆甲醇溶液3滴～4滴，观察颜
色，然后加入2％柠檬酸甲醇溶液3滴～4滴，观察并记录颜色变化。
色谱鉴定
（1）芸香苷和槲皮素的薄层色谱
样品自制芦丁、槲皮素
对照品芦丁、槲此素
展开剂（1）正丁醇-醋酸-水（4∶1∶5上层或4∶1∶1）；（2）25%醋酸水溶液；
（3）85%醋酸水溶液
显色（1）可见光下观察，再在紫外光下观察；（2）经氨气熏后再观察；（3）喷三氯化铝试剂后再观察
点样：提取的槲皮素及芸香苷的乙醇溶液和对照品的乙醇溶液。
展开剂：正丁醇一醋酸一水（4：l：5）上层溶液。
展开方式：预饱和后，上行展开。
显色：喷洒三氯化铝试剂前后，置日光及紫外光灯（365nm）下检视色斑的变化。
观察记录：记录图谱及斑点颜色。
（2）芸香苷与槲皮素的聚酰胺色谱
层析材料：聚酰胺薄膜。
点样：提取的芸香苷与槲皮素的乙醇溶液和对照品的乙醇溶液。
展开剂：乙醇-水（7∶3），水饱和的正丁醇一醋酸（10：）。
展开方式：上行展开。
显色：喷洒三氯化铝试剂前后，置日光及紫外灯光（365nm）下检视色斑的变化。观察记录：记录图谱及斑色颜色。
（3）糖的色谱鉴定
层析材料：新华层析滤纸。
点样：（三）中糖的供试液及葡萄糖、鼠李糖对照品溶液。
展开剂：正丁醇一醋酸一水（4：l：5）上层溶液。
展开方式：上行展开。
显色：氨性硝酸银试液，喷洒后先用电吹风冷吹至于，再吹热风至出现斑点为止。
观察记录：记录图谱及斑点颜色。
四、药品试剂
药品：每组槐花米20克
主要仪器及试剂
仪器:
（1）烧杯(100ml ,500ml)；（2）圆底烧瓶(100ml , 150ml)；（3）冷凝管；（4）抽滤瓶；（5）循环水泵；（6）紫外灯
试剂:
(1) %硼砂水；（2）石灰乳；（3）乙醇，甲醇等；（4） 2%硫酸，盐酸；（5）；（6）1％三氯化铝乙醇液；（7）正丁醇:醋酸:水(4:1:5 或4:1:1)；（8） 25%醋酸, 85% 醋酸；（9）乙醇:水(7:3)；（10）标准品: 芦丁, 槲皮素, 葡萄糖, 鼠李糖，（11）PH广泛试纸（12）聚酰胺薄膜
五、思考题：
1、芦丁水解不完全时将产生什么结果？
2、芦丁和槲皮素用不同展开剂系统展开将出现什么结果？为什么？
3、芦丁和槲皮素聚酰胺薄层出现什么结果？为什么？
记录：主要产物得率？熔点？层析示意