熊果酸的研究进展

作者：肖坤福郑云法刘成左张春牛

【关键词】熊果酸；,,,检测方法；,,,提取方法；,,,动物实验；,,,临床研究熊果酸是广泛存在于白花蛇舌草、女贞子、乌梅、夏枯草等天然植物中的一种五环三萜类化合物，有研究表明熊果酸具有镇静、抗炎、抗菌、抗糖尿病、降血糖等多种生物学效应，早在1996年，日本学者神藏美枝子等人从杜鹃花科越桔属植物越桔叶中提取了具有较高熊果酸浓度的熊果酸产品，产品中除含有25%的熊果酸外，尚含有大量的熊果酸衍生物、熊果苷和其它三萜类化合物等，具有多种活性成分，用于增强机体免疫力、预防心血管系统疾病、稳定肝功能等。现在人们对其研究越来越多，并在很多方面取得了可喜的研究进展。

1 提取方法

对三萜类化合物的分离提纯是其研究起点，没有较好的提取工艺，就更谈不上对其进一步研究。近年来，许多科研工作者在这方面做出了突出的贡献。有些科研工作者［1～5］，通过正交实验确定85%～95%的乙醇提取熊果酸效果最佳。崔星明等［6］采用超临界流体萃取得到的芦笋提取物，用甲醇溶解，采用液相色谱-质谱联用仪检测，得到了56个组分。发现有保留时间和熊果酸基本一致的峰。其质谱分子离子峰和特征碎片峰都与熊果酸的一致，确定该化合物为熊果酸。

2 检测方法

在检测方法方面，有不少科研工作者对其进行了较深入的研究。熊慧敏［7］全面地论证了薄层层析-双波长扫描法测定大山楂咀嚼片中熊果酸含量的检测限的线性范围可行性，并考查了此方法的测定熊果酸的稳定性和重复性，从而证明薄层层析-双波长扫描法测定熊果酸精密度、稳定性、重现性、回收率均都达有关规定的要求，本方法操作简单方便，结果可靠，可作为检验产品质量的一个快速而实用的定量方法。朱玉琴等［8］在采用薄层扫描检测保驾胶囊中熊果酸的含量时首次对显色剂进行了改进，并验证了醋酸-浓硫酸 (9∶1)比10%硫酸乙醇显色要好，检测限低等优点。与此同时，杨云等［9］在采用薄层层析检测牙周康泰胶囊熊果酸的含量验证了10%磷钼酸乙醇液比10%硫酸乙醇显色要好。

罗启剑等［10］采用分光光度法测定连钱草中熊果酸含量。郭艳玲等［11］和陈志强［12］采用薄层扫描法分别测定了补肾颗粒和消食贴中熊果酸含量，方法简便、快速、准确，可作为该产品的质量控制方法。

周静等［13］探求用毛细管气相色谱法测定女贞子中齐墩果酸和熊果酸含量。取女贞子氯仿提取液自然挥发干，甲醇溶解经甲酯化后，进样分析。色谱条件：hp－1毛细管柱（25 cm×0.32 mm，0.52 μm），柱温280℃，氮气为载气，氢火焰检测器。分析结果表明熊果酸的线性良好，回收率为99.8%±2.1%。所建立的气相色谱法可以作为女贞子药材的质量检测方法。

施慧君等［14］采用hplc法测定知柏地黄冲剂中熊果酸的含量。选用ods-c：色谱柱，流动相：甲醇-水(99∶1)，磷酸调ph 2.5，检测波长：206 nm，流速：1.2 ml/min，柱温25℃的条件下，熊果酸线性关系良好(r=0.999 8) 平均回收率达98.7%(rsd=0.66%)。罗晓清等［15］采用rp-hplc法测定石精叶中熊果酸含量，色谱柱为zorbax ods柱，用甲醇（1%），醋酸水溶液(88∶12)为流动相。检测波长为215nm。结果熊果酸和齐墩果酸的平均收率分别为98.5%、97.6%(n=3)。rsd分别为1.62%，1.89%(n=3)。方法准确、灵教、快速，可作为石抽叶药材的质量检测方法之一。

杨书良等［16］采用高效液相色谱法从影响熊果酸测定的各个方面(例如：粒度、煎煮次数、溶媒量、提取时间等)进行测定和和正交分析，从而论证了它比薄层层析法更精确、更可靠、灵敏度更高，重现性更好。鞠建华等［17］，也采用高效液相色谱测定熊果酸含量，但他在前人的基础上调节流动相的比例和加入改性剂乙酸胺，验证了此改进方法可以使熊果酸和它的同分异构体齐墩果酸达到基线分离，并使基线平稳、峰型和分离效果较佳。鄢立新等

［18］在采用高效液相色谱测定熊果酸时通过实验验证了在流动相中加入少量的醋酸可提高熊果酸的分离度，因为少量醋酸的加入使流动相蒸发所需的漂移管温度和气体流速应比初始条件高，可以在试验中逐渐增加漂移管温度和气体流速。刘海兴等［19］首先采用毛细管电泳法测定熊果酸含量的方法, 此方法能有效地分离和测定熊果酸，测定精密度比其它方法高，最易适合低含量测定，此方法准确、样品及试剂消耗少等优点。但此方法可操作性难度大，不适合简捷检测。闫花丽等［20］曾经采用重氮甲烷衍生化气相色谱法测定熊果酸的含量，此方法精密度高，检测限低，并克服了齐墩果酸和熊果酸(二者是性质和结构相似)难分离、难分别测定等优点。但此方法工艺繁锁，可操作性难度大，故现在很少有人使用此方法。也有人如皮文霞等［21］采用分光光度法测定熊果酸的含量。此方法很少有人采用，因为此方法精确度不够，实验重复性差，不便采用。

3 药理效应

在药理研究方面也取得了可喜的成就。黄镜等［22］采用mtt法、dna凝胶电泳、形态学等方法观察到熊果酸抑制hl-60细胞增殖并诱导其凋亡从而发挥抗肿瘤作用。王杰军等［23］探讨了熊果酸对体外血管形成的抑制作用(由于新生血管形成是肿瘤生长和转移的重要步骤),采用mtt法、细胞迁移及小管实验观察到熊果酸对培养血管内皮细胞(vec)增殖、迁移和小管形成均有较强的抑制作用(p＜0.01)，并且结果表明抑制程度与熊果酸的作用浓度呈正相关。

白育军等［24］对熊果酸的1、2位和3位进行氧化，制备其衍生物来观察其抗肿瘤活性，结果显示熊果酸抗肿瘤活性最强。樊明文等［25］采用mtt法研究熊果酸对人舌鳞癌细胞株(tscca)增值的影响；用原位杂交的方法检测熊果酸对tscca细胞浆中核转录因子mrna原位表达的影响研究了女贞叶有效成分熊果酸对tscca细胞增殖的影响，探讨其中可能的机制。研究结果显示，熊果酸抑制tscca 细胞增殖，对tscca细胞的半数生长的抑制剂量约为12.5 μmol・l－1，在24h内表现为一定的量效关系；原位杂交显示熊果酸对tscca细胞的抑制作用与抑制核转录因子的原位表达有关。

4 动物实验

动物实验是临床研究的最重要前期阶段，在这一方面很多科研工作者做出了不少贡献。向敏等［26］观察到细胞经熊果酸诱导后，b16细胞黑色素颗粒生成能力明显增多，并通过集落形成实验及体内成瘤实验证明了b16细胞分化后，致瘤力下降，由细胞周期动力学研究表明，熊果酸可使b16细胞周期阻断在g1期，而s期细胞明显减少。由免疫组化分析显示，熊果酸作用后b16细胞内c-myc蛋白含量明显下降。

黄镜等［22］系统地考察了熊果酸对抗致癌物如苯并芘、黄曲霉素b1诱发基因突变, 可抑制tpa的促癌作用，通过抗氧化作用起到抗始发突变与抗促癌作用，还对p-388和l-1210白血病细胞、a-549人肺腺癌细胞有显著的细胞毒作用，其ed50均小于4 mg／l 。

熊筱娟、陈蔚云［27］采用动物试验发现熊果酸能使急性肝损伤大鼠血清sgpt和肝甘油三脂含量明显下降，血清甘油三脂和肝糖原含量明显增加，并能减轻肝细胞变性、坏死，对急性肝损伤有显著保护和治疗作用。

hsue-yin hsu［28］通过辐射损伤后的小鼠分别用齐墩果酸和熊果酸治疗观察表明熊果酸比齐墩果酸更能抗癌，并且熊果酸能加强损伤的小鼠体内的造血功能。

5 临床研究

5.1 对肝炎的作用熊果酸临床表现有显著而迅速降低谷丙转氨酶、消退黄疽、增进食欲和恢复肝功能的作用，具有见效快、疗程短、效果稳定的特点［29］。lee i等［30］实验研究证明熊果酸具有明显的趋脂停用和抗纤维化，并能保护肝细胞膜及细胞器的生物膜系统，使主动运输功能恢复正常，细胞内外离子和水的移动及分布亦随之复原，再生能力相继恢复，促进肝小叶中央区坏死肝细胞修复。

5.2 抑制肿瘤形成生长以及诱导癌细胞分化作用熊果酸对肿瘤形成生长各阶段具有预防

和抑制作用。li j等［31］通过实验及临床试验证明熊果酸能抗dna突变、抑制癌变的启动, 并且熊果酸能对抗致癌物如苯并芘，黄曲霉毒素bl诱发基因突变。王鹏［32］试验对早期抗体(ebv-ea)活化试验型来筛选皮肤癌促癌物的抑制剂，发现熊果酸对tpa诱导raji细胞ebv-ea活化具有几乎同维甲酸相同的抑制作用，并使raji细胞的存活率更高；利用同位素标记的佛酯化合物3h-pdb2证明熊果酸不影响tpa与受体的结合，不是通过竞争tpa位点，而是有效地阻断致癌物与受体结合后的环节发挥作用。